沈琪琦 喬建甌

（上海交通大學(xué)附屬第九人民醫(yī)院，上海200011）

·研究報(bào)告·

參附注射液對大鼠急性肺損傷保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究*

沈琪琦 喬建甌△

（上海交通大學(xué)附屬第九人民醫(yī)院，上海200011）

目的觀察參附注射液對脂多糖性急性肺損傷（ALI）大鼠肺組織的保護(hù)作用及探討其可能的作用機(jī)制。方法54只健康雄性Wistar大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為對照組（NS組）、急性肺損傷組（ALI組）、參附注射液干預(yù)組（SF組），急性肺損傷模型通過股靜脈注射脂多糖（5 mg/kg）建立。SF組于造模前30 min給予參附注射液（10 mL/kg），NS組和ALI組均給予等量0.9％氯化鈉注射液。分別于用藥3 h、6 h、12 h后，觀察大鼠肺組織的病理改變，檢測血?dú)夥治?，記錄肺組織濕/干重比（W/D），測定大鼠肺組織中腫瘤壞死因子F-α（TNF-α）、白介素-6（IL-6）、白介素-10（IL-10）的表達(dá)。結(jié)果與ALI組相比，SF組ALI的程度明顯減輕，PaO2顯著改善（P＜0.05），肺W/D比值降低（P＜0.05），肺組織TNF-α、IL-6濃度顯著下降，IL-10濃度明顯升高（P＜0.05）。結(jié)論參附注射液對ALI大鼠肺組織具有一定的保護(hù)作用，其機(jī)制可能是降低了TNF-α、IL-6的濃度，促進(jìn)IL-10的表達(dá)，調(diào)節(jié)促炎-抗炎平衡，減輕肺部及全身的炎癥反應(yīng)。

急性肺損傷參附注射液TNF-αIL-6IL-10急癥

急性肺損傷（ALI）是臨床危重癥，發(fā)病急、變化快，其死亡率非常高。ALI的病理特點(diǎn)是肺組織水腫、中性粒細(xì)胞浸潤以及炎癥反應(yīng)失衡［1］。調(diào)控促炎與抗炎因子之間的平衡是有效控制炎癥介質(zhì)瀑布式反應(yīng)的關(guān)鍵。近年來許多研究均提示中醫(yī)藥在防治ALI方面有較好的療效，尤其是參附注射液因其“多靶效應(yīng)”而廣泛應(yīng)用于臨床。但其對脂多糖（LPS）引起的ALI的影響尚未報(bào)道。筆者通過動物實(shí)驗(yàn)觀察參附注射液對LPS性ALI大鼠肺組織的保護(hù)作用，并探討其可能的作用機(jī)制?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物清潔級健康雄性Wistar大鼠54只，體質(zhì)量250～300 g，由上海西普爾必凱實(shí)驗(yàn)動物有限公司提供，生產(chǎn)許可證SCXK（滬）X2008-0016。

1.2 藥物L(fēng)PS：E.coli，美國Sigma公司，L3129。參附注射液：10 mL/支，雅安三九制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字Z51020664。

1.3 儀器與試劑血?dú)夥治鰞x（GEM Premier 3000），顯微鏡（Nikon Eclipse E600），數(shù)碼顯微鏡照相分析軟件（Image Pro Plus），石蠟切片機(jī)（4062型，德國SLEE），電子天平（ER-182 A型，日本AND公司），離心機(jī)（ZK380型，德國HERMLE）。大鼠腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、白細(xì)胞介素-10（IL-10）、ELISA檢測試劑盒（R&D，美國，上海玉博公司分裝）。

1.4 造模與分組54只Wistar大鼠于實(shí)驗(yàn)前禁食12 h，自由飲水。ALI動物模型通過股靜脈注射LPS 5 mg/kg來制備。按隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為3組，每組18只：0.9％氯化鈉注射液對照組（NS組）、急性肺損傷組（ALI組）、參附注射液干預(yù)組（SF組）。SF組在注射LPS前30 min通過靜脈給藥參附注射液10 mL/kg干預(yù)，另兩組給予等量NS。按3 h、6 h、12 h 3個(gè)時(shí)間點(diǎn)（n=6）觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.5 標(biāo)本采集與檢測1）血?dú)夥治觯焊怪鲃用}取血0.5 mL，用于測定血?dú)夥治觥?）肺濕/干重比（W/D）：分別在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)處死大鼠，取左右兩肺。取左下肺稱重為肺臟濕重，而后置于70℃恒溫烤箱中干燥72 h后稱重為肺臟干重，計(jì)算W/D。3）肺組織病理檢測：取左中肺組織，石蠟包埋，蘇木素-伊紅染色，觀察肺組織病理變化和炎癥浸潤。4）肺組織TNF-α、IL-6及IL-10含量測定：取右肺組織300 mg制成肺組織均漿，3000 r/min離心15 min，收集上清液，ELISA方法測定TNF-α、IL-6及IL-10含量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（±s）表示，多組均數(shù)采用單因素方差分析（ONEWAY ANOVA），組間兩兩比較采用SNK法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠PaO2及肺組織W/D比較見表1。結(jié)果顯示，ALI組大鼠3個(gè)時(shí)間點(diǎn)PaO2較NS組均顯著降低（P＜0.05），而SF組PaO2各時(shí)間點(diǎn)較ALI組有明顯上升；ALI組大鼠W/D值隨時(shí)間點(diǎn)的延長明顯增高（P＜0.05），而各時(shí)間點(diǎn)SF組肺組織W/D值明顯低于ALI組（P＜0.05）。

2.2 各組肺組織病理比較見圖1。結(jié)果顯示，與NS組比較，ALI組肺泡間隔明顯增寬，部分肺泡間隔斷裂，肺泡腔內(nèi)有大量滲出，肺泡壁毛細(xì)血管充血明顯，肺間質(zhì)內(nèi)可見明顯炎癥細(xì)胞浸潤。SF組肺泡及肺部炎癥情況相對于ALI組明顯改善。

2.3 各組大鼠肺組織中TNF-α、IL-6、IL-10水平比較見表2。結(jié)果顯示，NS組大鼠TNF-α、IL-6、IL-10水平在不同時(shí)間點(diǎn)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。ALI組TNF-α、IL-6水平3 h開始升高，12 h達(dá)到高峰（P＜0.05）；IL-10上升緩慢，12 h達(dá)到峰值。與ALI組比較，SF組在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)TNF-α和IL-6水平明顯降低，IL-10水平明顯升高（P＜0.05）。

表1 各組大鼠PaO2及肺組織W/D比較（±s）

表1 各組大鼠PaO2及肺組織W/D比較（±s）

與NS組相應(yīng)時(shí)點(diǎn)比較，*P＜0.05；與ALI組相應(yīng)時(shí)點(diǎn)比較，△P＜0.05。下同。

組別時(shí)間PaO2（mmHg）肺W/D NS組3 h96.16±2.784.44±0.27（n＝6）6 h94.66±3.324.71±0.44 12 h95.66±2.164.58±0.24 ALI組3 h73.83±3.81*5.93±0.50*（n＝6）6 h63.33±4.08*6.92±0.41*12 h56.50±3.61*7.76±0.68*SF組3 h82.0±4.19*△4.67±0.61△（n＝6）6 h73.50±3.83*△5.87±0.33△12 h70.16±3.18*△6.43±0.47△

圖1 各組大鼠12 h肺組織HE染色（200倍）

表2 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)肺組織TNF-α、IL-6、IL-10含量比較（ng/mg，±s）

表2 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)肺組織TNF-α、IL-6、IL-10含量比較（ng/mg，±s）

組別時(shí)間TNF-α NS組3 h17.16±4.26（n＝6）6 h18.33±5.35 12 h16.66±4.76 ALI組3 h32.83±5.23*（n＝6）6 h37.16±4.44*12 h54.50±4.67*SF組3 h21.50±2.88△（n＝6）6 h29.16±1.47*△12 h40.66±4.50*△IL-6IL-10 20.83±2.4826.66±4.84 20.66±3.1426.16±5.41 22.00±3.0327.16±5.70 48.66±5.42*36.83±3.76*68.66±4.50*44.66±2.58*89.66±6.68*69.66±3.14*31.66±3.01*△54.66±4.88*△42.16±2.78*△82.83±5.70*△71.33±2.80*△104.0±6.72*△

3 討論

參附注射液組方來源于參附湯，主要成分為紅參、黑附片提取物，含有人參皂苷、人參多糖、烏頭堿等多種活性成分，具有回陽救逆、益氣固脫之功效，可使正氣得以匡扶、陽氣得以暢達(dá)、氣血流暢運(yùn)行、陰陽恢復(fù)平衡，與西藥配合使用具有減毒增效作用，因此臨床上廣泛應(yīng)用于危重病患者的搶救［2-4］。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為熱、瘀、水（濕）、虛是ALI的關(guān)鍵病機(jī)，治療當(dāng)從清熱解毒、通里攻下、活血化瘀及益氣扶正等方面著手［5］。研究還顯示參附注射液能抑制感染性休克大鼠機(jī)體組織NF-κB的活化及炎癥因子的過度釋放、使促炎因子和抗炎因子達(dá)到平衡，防止過度炎性反應(yīng)［6-9］。研究發(fā)現(xiàn)，參附注射液治療重度膿毒血癥有較好療效［10］，而且能增加膿毒癥休克患者的組織灌注，改善微循環(huán)［11］。林雪梅發(fā)現(xiàn)應(yīng)用烏司他丁聯(lián)合參附注射液治療ARDS患者可調(diào)節(jié)患者的免疫功能、減輕炎癥反應(yīng)程度［12］。在大鼠腸缺血再灌注的ALI模型中，劉志剛等發(fā)現(xiàn)，參附注射液對其有保護(hù)作用［13］。徐鵬發(fā)現(xiàn)，參附注射液干預(yù)能夠減輕膿毒癥大鼠肺水腫、肺出血及肺不張程度，減少肺組織炎性浸潤，并且使肺泡間隔逐漸修復(fù)［14］。但在LPS性ALI的模型中研究較少。其具體機(jī)制尚未完全闡明。

在全身炎癥反應(yīng)綜合征的眾多炎癥介質(zhì)中，TNF-α是首要因子，具有廣泛生物學(xué)活性，促使多形核白細(xì)胞（PMN）在肺內(nèi)聚集、黏附，釋放多種促炎細(xì)胞因子，損傷肺毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞膜［15］。IL-6是機(jī)體另一個(gè)重要的促炎因子，能夠啟動、催化和放大炎癥反應(yīng)，是機(jī)體炎癥與疾病嚴(yán)重程度的重要指標(biāo)［16-17］。有研究發(fā)現(xiàn)，缺血再灌注腎損傷模型小鼠肺組織IL-6及TNF-α的表達(dá)與肺損傷程度密切相關(guān)，提示IL-6及TNF-α是ALI的增惡因子［18］。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，在LPS誘導(dǎo)的ALI模型中，大鼠BALF中TNF-α、IL-1β、IL-6的水平顯著升高，提示膿毒癥大鼠肺損傷時(shí)細(xì)胞因子IL-1、IL-6過度表達(dá)可能是造成膿毒癥肺損傷的重要原因［19-20］。IL-10是人體內(nèi)重要的抗炎因子，多項(xiàng)研究提示，IL-10可通過抑制單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中IL-6、IL-8和TNF-α等炎癥因子的釋放，減輕ALI/ARDS動物模型肺組織損傷［21］。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，參附注射液干預(yù)后，大鼠肺損傷程度明顯減輕，在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)較LPS組PaO2升高，W/ D值明顯下降，說明SF對LPS誘導(dǎo)的ALI大鼠有保護(hù)作用；ALI組大鼠各時(shí)間點(diǎn)肺組織TNF-α、IL-6含量顯著高于NS組，相比于ALI組大鼠，SF組大鼠肺組織TNF-α、IL-6含量則顯著降低；ALI組大鼠3個(gè)時(shí)間點(diǎn)肺組織IL-10含量顯著低于NS組的表達(dá)，相比于ALI組大鼠，SF組大鼠肺組織IL-10含量則顯著升高。本結(jié)果提示參附注射液可通過降低促炎因子TNF-α、IL-6水平，增強(qiáng)抗炎因子IL-10表達(dá)，調(diào)節(jié)體內(nèi)炎癥介質(zhì)/抗炎介質(zhì)的平衡，抑制ALI的發(fā)展。

綜上所述，參附注射液對LPS性ALI大鼠有一定保護(hù)作用。其機(jī)制可能是通過降低促炎因子TNF-α、IL-6水平，增強(qiáng)抗炎因子IL-10表達(dá)，重建炎癥網(wǎng)絡(luò)的平衡，來減輕機(jī)體過度反應(yīng)的損傷。

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Protective Effects of Shenfu Injection on Acute Lung Injury in Rats

SHEN Qiqi，QIAO Jianou.The NinthPeople’s Hospital，Shanghai Jiaotong University，Shanghai 200011，China.

Objective：To study Protective effect of Shenfu Injection on lung tissue in rats with lipopolysaccharide induced acute lung injury and its possible mechanism.Methods：54 male Wister rats were randomly divided into the control group（NS group），acute lung injury group（ALI group），and Shenfu injection group（SF group）.A-cute lung injury model was established by injection of lipopolysaccharide（5 mg/kg）.30 min before modeling，SF group was given Shenfu injection（10 mL/kg），and NS group and ALI group were given equivalent saline.In 3 h，6 h and 12 h，the pathological changes of lung tissue in rats were observed，and blood gas analysis，Wet/dry weight ratio of lung tissue（W/D），and the expression of TNF-α，IL-6 and IL-10 in rat lung tissue were determined.Results：Compared with ALI group，the degree of acute lung injury was significantly reduced in SF group；PaO2was significantly improved（P＜0.05），and the pulmonary W/D ratio was decreased（P＜0.05）；TNF-α and IL-6 concentrations in lung tissue were significantly decreased and IL-10 concentration was significantly increased（P＜0.05）.Conclusion：Shenfu injection has protective effects on lung tissue of rats with ALI，whose mechanisms may involve decreasing the expression of TNF-α and IL-6，increasing the expression of IL-10，regulating the balance of pro-inflammatory and anti-inflammatory，and reduce inflammation in the lungs and the whole body.

Acute lung injury；Shenfu injection；TNF-α；IL-6；IL-10；Emergency

R285.5

A

1004-745X（2017）06-0944-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2017.06.002

2016-11-15）

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81170028）

△通信作者（電子郵箱：gjou@163.com）