羅君琴 柯甫志 王平 聶振朋 徐建國(guó) 孫建華

(浙江省柑橘研究所 臺(tái)州 黃巖318020)

試驗(yàn)研究

尤力克檸檬與四倍體夏橙雜交幼胚試管培養(yǎng)試驗(yàn)初報(bào)

羅君琴 柯甫志 王平 聶振朋 徐建國(guó) 孫建華

(浙江省柑橘研究所 臺(tái)州 黃巖318020)

世界各國(guó)十分重視柑橘育種，三倍體無(wú)籽育種一直都是各育種專家比較重視的柑橘育種方向之一。利用二倍體與四倍體進(jìn)行有性雜交仍是目前柑橘獲得三倍體育種材料的重要途徑，但柑橘二倍體作母本與四倍體材料人工授粉受精后產(chǎn)生的三倍體雜種胚在雜交果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育途中極易敗育，與此同時(shí)雜種胚的獲取亦容易受二倍體母本胚性干擾。利用幼胚試管培養(yǎng)技術(shù)[1～3]可有效克服柑橘二倍體作母本與四倍體雜種胚敗育問(wèn)題，及有助于直接分離單、多胚不同胚性的雜交胚，深入研究二倍體母本與四倍體雜種幼胚試管培養(yǎng)技術(shù)對(duì)提高三倍體雜種后代的獲取概率及獲取更豐富的遺傳育種材料意義較大。

1 材料與方法

本研究以浙江省柑橘研究所種質(zhì)資源圃中二倍體尤力克檸檬為母本，四倍體夏橙為父本，連續(xù)兩年于4月中下旬進(jìn)行人工雜交授粉。授粉后10d去雜交袋，2個(gè)月后開(kāi)始定期采集雜交果無(wú)菌條件下取幼胚于24± 2℃、2000lux光強(qiáng)、12h/d 模擬光照條件下開(kāi)展試管離體培養(yǎng)技術(shù)研究。試驗(yàn)以MT為基本培養(yǎng)基，主要從不同雜種胚齡、培養(yǎng)基生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑配方方面來(lái)探討關(guān)鍵影響因子對(duì)尤力克檸檬×四倍體夏橙雜交幼胚試管離體培養(yǎng)成活及成苗影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同胚齡對(duì)雜交幼胚試管離體培養(yǎng)葉狀胚及成苗誘導(dǎo)影響

父母本樹(shù)授粉后60d開(kāi)始每隔8～10d，直至授粉后130d，各時(shí)間點(diǎn)分別采集雜交果實(shí),取幼胚離體接種于以MT 為基礎(chǔ)培養(yǎng)基、相同植物調(diào)節(jié)劑配方誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，并于相同光溫控制條件下培養(yǎng)。在最后一批幼胚組培接種后76d，分別觀察統(tǒng)計(jì)不同胚齡各試驗(yàn)小組離體培養(yǎng)葉狀胚產(chǎn)生比率及誘導(dǎo)成苗情況，結(jié)果如表1所示。

表1 雜交種胚不同胚齡試管內(nèi)離體培養(yǎng)葉狀胚與成苗誘導(dǎo)情況

從表1可以看出，授粉后60d最早采集的幼胚試管培養(yǎng)僅有2.6%的葉狀胚產(chǎn)生，沒(méi)有誘導(dǎo)成苗；授粉后70d 雜交果幼胚離體培養(yǎng)的外植體葉狀胚和小苗產(chǎn)生率略有增加，但仍然很低。而至授粉后80d 成苗率可快速遞增，高達(dá)49.5%；授粉后90d、98d、106d幼胚離體培養(yǎng)誘導(dǎo)成苗率穩(wěn)定在48.6%～50.0%之間，且仍存在13.7%～14.0%的葉狀胚產(chǎn)生比率，可保持較好的芽誘導(dǎo)分化能力。授粉后114d 開(kāi)始幼胚離體培養(yǎng)成苗率隨著胚齡的增加明顯下降，授粉后114d、122d、130d幼 胚 試管 培 養(yǎng)成 苗 率 分 別 降 為19.7%、12.3%、5.7%，且葉狀胚產(chǎn)生比率均很低，芽誘導(dǎo)分化潛力較差。誘導(dǎo)試驗(yàn)直觀結(jié)果結(jié)合原始數(shù)據(jù)LSD0.01分析比較，均表明授粉后80d至106d 是尤力克檸檬×四倍體夏橙雜交幼胚試管離體培養(yǎng)適宜胚齡。

2.2 培養(yǎng)基生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑配方對(duì)雜交幼胚試管離體誘導(dǎo)成苗影響

采用正交試驗(yàn)初步分析、篩選不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑種類及濃度對(duì)尤力克與四倍體夏橙雜交幼胚試管成苗影響。試驗(yàn)設(shè)3個(gè)影響因子，分別為KT、IBA和GA。每個(gè)因子3個(gè)水平，KT對(duì)應(yīng)的3個(gè)水平分別為1.0、2.0、3.0mg/l；IBA對(duì)應(yīng)的3個(gè)水平分別為0.3、0.9、1.5mg/l；GA對(duì)應(yīng)的3個(gè)水平分別為0.0、0.2、0.4mg/l。每個(gè)組合處理接種30個(gè)授粉100d雜交果幼胚，重復(fù)2次。接種培養(yǎng)2個(gè)月后觀察記錄雜交幼胚成苗情況，記錄分析不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)尤力克與四倍體夏橙雜交幼胚試管成苗的影響，試驗(yàn)結(jié)果如表2所示。

從表2正交試驗(yàn)極差分析結(jié)果可以看出KT、IBA、GA 三種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)幼胚誘導(dǎo)成苗影響大小依次為：KT＞IBA＞GA。

為進(jìn)一步明確KT、IBA和GA三個(gè)試驗(yàn)因子對(duì)雜交幼胚組培離體培養(yǎng)成苗率的影響，對(duì)試驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)進(jìn)行了方差分析，結(jié)果如表3所示。

表2 不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑及濃度對(duì)雜交幼胚離體培養(yǎng)成苗率影響

表3 不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑及濃度對(duì)雜交幼胚離體培養(yǎng)成苗率影響方差分析

從表3中F值可以看出，KT、IBA、GA3個(gè)試驗(yàn)影響因子對(duì)尤力克與四倍體夏橙雜交幼胚試管成苗誘導(dǎo)的影響未達(dá)顯著水平。結(jié)合表2直觀分析，進(jìn)一步明確了本次試驗(yàn)可 優(yōu) 選 平 均 數(shù) 大 的 水 平KT2.0mg/L、IBA0.3mg/L和GA0.2mg/L(即MT+KT2.0mg/L+ IBA0.3mg/L+GA0.2mg/L)組合配方為尤力克與四倍體夏橙雜交幼胚試管離體培養(yǎng)較適配方。

3 小結(jié)

本試驗(yàn)中，尤力克檸檬×四倍體夏橙雜交授粉后80d至106d 幼胚試管離體培養(yǎng)成苗率、葉狀胚產(chǎn)生率明顯高于80d前與106d后胚齡。試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了利用柑橘雜種幼胚試管培養(yǎng)技術(shù)可提前趕在合子胚敗育前創(chuàng)造良好的光、溫、濕及營(yíng)養(yǎng)環(huán)境離體成功培養(yǎng)各雜種幼胚成苗，有效克服柑橘二倍體作母本與四倍體雜種胚敗育問(wèn)題。同時(shí)，接種培養(yǎng)前去除種胚內(nèi)外種皮可直接有效分離單、多胚，實(shí)現(xiàn)培養(yǎng)前期雜交胚初選，既提高獲取三倍體雜種后代的概率，又減少組培工作量，目前仍不失為單、多胚雜交組合三倍體育種雜種后代有效的培養(yǎng)途徑。試驗(yàn)利用正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)初步篩選出尤力克與四倍體夏橙雜交幼胚離體誘導(dǎo)培養(yǎng)基較適配方，可作為相近柑橘種屬親本雜交幼胚離體培養(yǎng)參照配方。

[1]譚洪泉，陳善春.柑橘雜種胚挽救及早期鑒定[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，39（15）：8901～8903，8999

[2]郭文武，伊華林，鄧秀新.離體培養(yǎng)與柑橘三倍體育種[J].中國(guó)南方果樹(shù)，1997，26(6)：11～13

[3]伊華林，鄧秀新，付春華.胚搶救技術(shù)在果樹(shù)上的應(yīng)用.2001，18（4）：224～228

10.13906/j.cnki.zjgj.1009-0584.2017.02.540

2017-5-18

臺(tái)州市科技項(xiàng)目（編號(hào)：14ny09）