黃麗英，王永超，顧 捷

（1.浙江海洋大學(xué)海洋與漁業(yè)研究所，浙江省海洋水產(chǎn)研究所，浙江舟山 316021；2.浙江海洋大學(xué)海洋科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，浙江舟山 316022）

水產(chǎn)品中堿性玫瑰精殘留量的UPLC-MS/MS和LCMS-IT-TOF分析

黃麗英1，王永超2，顧 捷1

（1.浙江海洋大學(xué)海洋與漁業(yè)研究所，浙江省海洋水產(chǎn)研究所，浙江舟山 316021；2.浙江海洋大學(xué)海洋科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，浙江舟山 316022）

建立了水產(chǎn)品中堿性玫瑰精測(cè)定的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLC-MS/MS）和離子阱飛行時(shí)間質(zhì)譜法（LCMS-IT-TOF）。樣品經(jīng)均質(zhì)，以無(wú)水乙醇進(jìn)行提取，通過(guò)Oasis HLB固相萃取小柱凈化后進(jìn)行UPLC-MS/MS和LCMS-ITTOF定性定量分析。結(jié)果表明，UPLC-MS/MS法在0.5～10.0 μg/L范圍內(nèi)線(xiàn)性相關(guān)性好，相關(guān)系數(shù)為0.999 1，回收率在70%～120%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差低于15%，檢測(cè)限為0.1 μg/kg。自制陽(yáng)性樣品進(jìn)行LCMS-IT-TOF定性，采用V飛行模式，根據(jù)正離子模式下獲得的多級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)，對(duì)比對(duì)照品碎裂特征，總結(jié)其多級(jí)裂解規(guī)律，進(jìn)一步確證該非食用物質(zhì)的添加使用。

堿性玫瑰精B；UPLC/MS/MS；LCMS-IT-TOF；水產(chǎn)品

堿性玫瑰精（英文名Rhodamine B），又名羅丹明B、鹽基玫瑰精B、堿性熒光紅8B，俗稱(chēng)"洋紅"，溶于水和乙醇呈藍(lán)光紅色，微溶于丙酮，極易溶于乙二醇乙醚，是一種偶氮類(lèi)堿性工業(yè)染料，用于染蠶絲、腈綸、羊毛，也用于皮革、紙張、麥稈著色以及制備色淀顏料[1]。雖然堿性玫瑰精用途廣泛，但濫用該類(lèi)工業(yè)染料仍會(huì)通過(guò)皮膚接觸、呼吸吸入、直接食入等對(duì)人體導(dǎo)致不良的影響。我國(guó)禁止食品及農(nóng)產(chǎn)品中添加該工業(yè)染料，但非法使用的情況還是存在，也曾發(fā)生過(guò)一起群體性堿性玫瑰精中毒事件[2]。堿性玫瑰精已被我國(guó)衛(wèi)生部列為食品中可能違法添加的非食用物質(zhì)名單，但由于這些色素比食用色素更易于在肉制加工品上著色，且價(jià)格低廉，一些不法食品生產(chǎn)經(jīng)營(yíng)企業(yè)為了改善水產(chǎn)品的外觀亮澤，在生產(chǎn)加工過(guò)程中可能濫用非食用物質(zhì)堿性玫瑰精，以謀求更大利益。

目前工業(yè)染料的檢測(cè)方法主要有紫外分光光度法[3]、高效液相色譜法[4]、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[5-6]、飛行時(shí)間質(zhì)譜法[7]等，多集中在調(diào)味料[8]和通用食品[9]上，水產(chǎn)品中有堿性嫩黃O的研究[10]，堿性玫瑰精的測(cè)定報(bào)道較少。液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)具有選擇性、靈敏度、分析效率高等特點(diǎn)，本文建立了水產(chǎn)品中堿性玫瑰精的超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)法，大幅度排除了食用色素的干擾。同時(shí)，對(duì)水產(chǎn)品中檢出堿性玫瑰精的自制陽(yáng)性樣品應(yīng)用液相色譜－離子阱飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)進(jìn)行了多級(jí)質(zhì)譜的分析，進(jìn)一步確證該非食用物質(zhì)的添加使用，極大提高了水產(chǎn)品中堿性玫瑰精的風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)質(zhì)量安全分析能力。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

美國(guó)Waters液質(zhì)聯(lián)用儀（AcquityTMUPLC/Quattro Premier XE，MsssLynx4.1工作站）；日本島津高效液相色譜離子阱飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（LCMS-IT-TOF，LCMSsolution V3.50工作站）；固相萃取柱（Oasis HLB 6 mL，500 mg或相當(dāng)者）；固相萃取裝置；渦旋混合器；超聲波清洗器；離心機(jī)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；氮吹儀。

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：堿性玫瑰精（SIGMA公司，50 g/瓶），用甲醇配制成1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。色譜純：甲醇、甲酸；分析純：無(wú)水硫酸鈉、無(wú)水乙醇、氨水；超純水。

1.2 儀器條件

1.2.1 UPLC-MS/MS法

色譜柱：Waters AcquityTMUPLC BEH Cl8柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相 A 為 0.1%甲酸甲醇溶液，B 為 0.1%甲酸水溶液，65：35（A:B）等度洗脫 5 min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣體積：5 μL；流速：0.2 mL/min。

離子化方式：ESI正離子模式；離子源參數(shù)：毛細(xì)管電壓3.5 kV，源溫度120℃，脫溶劑氣溫度350℃，脫溶劑氣流量600 L/hr，錐孔反吹氣流量50 L/hr；離子采集方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM），選擇m/z 443/399、443/355作為定性離子對(duì)，m/z 443/399作為定量離子對(duì)，采用外標(biāo)法定量。

1.2.2 LCMS-IT-TOF法

色譜柱：Shimadzu Shim-pack XR-ODS C18柱（2.0 mm×75 mm,2.2 μm）；流動(dòng)相 A 為 0.1%甲酸甲醇溶液，B 為 0.1%甲酸水溶液，55：45（A:B）等度洗脫 10 min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣體積：4 μL；流速：0.3 mL/min。IT-TOF MS 離子化方式：ESI正離子掃描；掃描范圍：MS1m/z 150～1 000，MS2m/z 100～500,MS3m/z 100～500；加熱模塊溫度：200℃；曲形脫溶劑管溫度：200℃；霧化氣N2流速：1.5 L/min；干燥氣流速：10 L/min；離子源電壓：4.5 KV；檢測(cè)器電壓：1.70 KV；校準(zhǔn)方法：自動(dòng)調(diào)諧優(yōu)化電壓，外標(biāo)法校準(zhǔn)質(zhì)量數(shù)。

1.3 試驗(yàn)方法

稱(chēng)取5 g樣品（精確到0.01 g）于50 mL聚丙烯離心管中，加入5 g無(wú)水硫酸鈉，攪拌均勻，加入25 mL無(wú)水乙醇，渦旋混合1 min，超聲提取20 min，以8 000 r/min離心5 min，上清液轉(zhuǎn)移至雞心瓶中，再加入25 mL無(wú)水乙醇，重復(fù)上述操作，合并全部上清液于雞心瓶中，在45℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，待凈化。樣品提取濃縮液用10 mL水少量多次溶解，上固相萃取柱（使用前分別用10 mL甲醇和10 mL水預(yù)處理，保持柱體濕潤(rùn)），調(diào)節(jié)流速小等于2 mL/min，用6 mL 4%氨水甲醇溶液洗脫，40℃氮?dú)獯蹈?，?zhǔn)確加入1 mL 70%甲醇水溶液定容，過(guò)0.22 μm濾膜，待測(cè)。

2 結(jié)果與討論

2.1 UPLC-MS-MS法的TIC和MRM圖

根據(jù)堿性玫瑰精的結(jié)構(gòu)特征我們選擇ESI（+）作為電離模式，采用流動(dòng)注射的方式以10 μL/min將高濃度（5.0 mg/L）的標(biāo)準(zhǔn)溶液注入離子源中對(duì)離子源毛細(xì)管電壓、錐孔電壓、源溫度、脫溶劑溫度等作優(yōu)化調(diào)節(jié)，得到堿性玫瑰精的分子離子峰443。優(yōu)化碰撞室的氬氣、碰撞能量等條件參數(shù)，對(duì)其子離子進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析，并從中選取兩個(gè)子離子組成離子對(duì)，使離子對(duì)的豐度響應(yīng)最大。在液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)的應(yīng)用中，流動(dòng)相的選擇除考慮色譜系統(tǒng)分離效果外，必須關(guān)注分離各組分進(jìn)入質(zhì)譜前離子化的效率，以便獲得最佳的分辨率和最高的靈敏度。對(duì)堿性玫瑰精進(jìn)行分離中發(fā)現(xiàn)，在甲醇和水中加入0.1%甲酸時(shí)，母離子峰迅速提高，經(jīng)離子化后獲得高靈敏度。按照上述色質(zhì)譜條件分析測(cè)試堿性玫瑰精標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的總離子流圖和多反應(yīng)監(jiān)測(cè)圖如圖1，保留時(shí)間為2.22 min。

圖1 堿性玫瑰精標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的TIC和MRM圖Fig.1 TIC and MRM chromatograms of reference substance of Rhodamine B

2.2 UPLC-MS/MS法的方法學(xué)考察

準(zhǔn)確移取適量的堿性玫瑰精標(biāo)準(zhǔn)液，配制系列濃度，UPLC/MS/MS法在0.5～10.0 μg/L范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好線(xiàn)性關(guān)系，以響應(yīng)面積為縱坐標(biāo)，以濃度值為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線(xiàn)性回歸，回歸方程Y=805.584 X+96.233 2，線(xiàn)性相關(guān)系數(shù)為0.999 1。通過(guò)實(shí)驗(yàn)確定，堿性玫瑰精B在水產(chǎn)品中的檢出限為0.1 μg/kg，方法靈敏度高，可滿(mǎn)足低含量樣品殘留檢測(cè)需求。根據(jù)堿性玫瑰精的溶解性能，為了得到盡可能高的回收率，選擇萃取效率高的無(wú)水乙醇作為萃取溶劑，并采用HLB固相小柱凈化方式，操作簡(jiǎn)便，保證了實(shí)驗(yàn)條件可操作性。在空白水產(chǎn)品中分別添加 0.1 μg/kg、0.4 μg/kg、2.0 μg/kg 三個(gè)高中低標(biāo)準(zhǔn)品濃度，每個(gè)水平各做3次平行，以外標(biāo)法計(jì)算來(lái)驗(yàn)證方法的回收率。實(shí)驗(yàn)證明，在不同添加水平下，不同水產(chǎn)品基質(zhì)的加標(biāo)回收結(jié)果在70%～120%之間，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于15%，說(shuō)明堿性玫瑰精的回收率比較穩(wěn)定，該方法具有一定的可靠性。取一標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行精密度測(cè)試，平行測(cè)定6次，UPLC/MS/MS法的RSD為1.25%，也符合方法學(xué)要求。

2.3 堿性玫瑰精多級(jí)質(zhì)譜裂解規(guī)律

對(duì)堿性玫瑰精對(duì)照品進(jìn)行LCMS-IT-TOF研究，在ESI正離子模式下有良好信號(hào)，采用direct模式，進(jìn)行了五級(jí)質(zhì)譜分析，推測(cè)的裂解規(guī)律如圖2。

圖2 堿性玫瑰精的裂解途徑Fig.2 Fragmentation pathways of Rhodamine B

從電噴霧-離子阱/飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用檢測(cè)結(jié)果分析，堿性玫瑰精的一級(jí)質(zhì)譜以準(zhǔn)分子離子峰m/z 443.2329[M+H]+為基峰，其主要碎片離子分別為 m/z 399.170 3、355.107 7、326.077 8、311.117 9、282.091 3、255.080 4。堿性玫瑰精準(zhǔn)分子離子m/z 443.232 9失去-C3H8產(chǎn)生碎片m/z 399.170 3，一級(jí)碎片又失去-C3H8產(chǎn)生二級(jí)碎片m/z 355.107 7。三級(jí)碎片離子m/z 326.077 8和311.117 9分別由二級(jí)碎片m/z 355.107 7失去-C3N和-CO2得到。三級(jí)碎片離子m/z 326.077 8和311.117 9分別失去-CO2和-C3N都得到四級(jí)碎片m/z 282.091 3，由碎片m/z 282.091 3失去HCN得到五級(jí)碎片m/z 255.080 4。

常規(guī)液質(zhì)分析可以根據(jù)化合物質(zhì)荷比來(lái)排除基質(zhì)干擾提高靈敏度，但是由于低分辨率和低質(zhì)量數(shù)準(zhǔn)確度的缺點(diǎn)，加上傳輸效率的限制也會(huì)降低被檢測(cè)物的靈敏度；四級(jí)桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜具備高分辨率和高質(zhì)量數(shù)準(zhǔn)確度的特點(diǎn)，但只能進(jìn)行2級(jí)質(zhì)譜分析，而離子阱飛行時(shí)間質(zhì)譜不僅具有高分辨率和高質(zhì)量數(shù)準(zhǔn)確度，還具有10級(jí)質(zhì)譜功能，有利于化合物復(fù)雜裂解規(guī)律的推導(dǎo)。與傳統(tǒng)的LC-MS/MS相比，LCMS-ITTOF系統(tǒng)可獲得高精度的多級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)，提供更多的化學(xué)結(jié)構(gòu)信息，提高了結(jié)構(gòu)解析的準(zhǔn)確性，從而為堿性玫瑰精的定性提供了更可靠的依據(jù)。

2.4 陽(yáng)性樣品的確證

在UPLC-MS/MS試驗(yàn)條件下，自制陽(yáng)性樣品中檢出的堿性玫瑰精與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)具有相同的保留時(shí)間，且樣品圖譜中各組分定性離子的相對(duì)豐度與濃度接近的混合基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)校準(zhǔn)溶液中對(duì)應(yīng)的定性離子的相對(duì)豐度進(jìn)行比較，偏差小于5，可判定樣品中存在對(duì)應(yīng)的堿性玫瑰精。

在LCMS-IT-TOF試驗(yàn)條件下，通過(guò)比較自制陽(yáng)性樣品與對(duì)照品的多級(jí)質(zhì)譜碎裂特征，一級(jí)質(zhì)譜圖因基質(zhì)干擾無(wú)法判斷，但是MS2到MS4的質(zhì)譜圖信息清晰，同時(shí)m/z399.170 3提取離子流圖出峰時(shí)間也與標(biāo)準(zhǔn)品相符。LCMS-IT-TOF具有多級(jí)質(zhì)譜掃描功能，選定母離子碎裂出子離子，MSn質(zhì)譜圖中可大大降低基質(zhì)干擾，因此具有極佳的定性準(zhǔn)確性。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)，建立了水產(chǎn)品中堿性玫瑰精的檢測(cè)方法，該方法可操作性強(qiáng)，定性可靠，定量準(zhǔn)確。對(duì)自制陽(yáng)性樣品本文還應(yīng)用離子阱飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)進(jìn)行了確證，檢測(cè)結(jié)果令人滿(mǎn)意。新儀器、新方法、新手段的快速應(yīng)用，各方法之間相互驗(yàn)證，保證了檢測(cè)結(jié)果的可靠性和準(zhǔn)確性。

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Determination of Rhodamine B in Fishery Products based on UPLC-MS/MS and LCMS-IT-TOF

HUANG Li-ying1,WANG Yong-chao2,GU Jie1
(1.Marine and Fisheries Institute of Zhejiang Ocean University,Marine Fisheries Institute of Zhejiang Province,Zhoushan 316021;2.Marine Science and Technology School of Zhejiang Ocean University,Zhoushan 316022,China)

A comprehensive analytical method based on ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry(UPLC-MS/MS)and high performance liquid chromatography ion tap-time-of-flight mass spectrometry(LCMS-IT-TOF)has been developed for confirmation and quantification of Rhodamine B in fishery products.The Samples were homogenized and extracted by ultrasound extraction in the solution of 25 mL anhydrous alcohol,then centrifuged at the rate of 8 000 r/min.The obtained upper clear liquid after twice extractions was distilled and the residues were redissolved with 10 mL deionized water followed by a further cleanup procedure using Oasis HLB solid phase extraction column.The residues retained in the column were rinsed with the mixture of ammonium hydroxide and methanol(4:96 by volume).Then the analysis was carriedout by UPLC-MS/MS.The results showed a good linearity in the range of 0.5-10.0 μg/mL and a LOQ of 0.1 μg/kg,with the correlation coefficient of 0.999 1.The absolute recovery ranges from 70%to 120%,with the relative standard deviation less than 15%.Further studies on confirmation of self-made positive sample was carried out with LCMS-IT-TOF.The fragmentation pathways of the compound of Rhodamine B were concluded.By compared the mass spectrometry information from self-made positive sample and the reference substance,the objective compound in the complex matrix was identified successfully.The developed method is accurate,reliable for both screening and determination the Rhodamine B pollutant in fishery products.

Rhodamine B;UPLC/MS/MS;LCMS-IT-TOF;fishery products

TS254.7

：A

2016-12-10

國(guó)家自然科學(xué)基金（31502182）；浙江海洋大學(xué)“海洋科學(xué)”省重中之重開(kāi)放課題（20160107）

黃麗英（1981-），女，浙江義烏人，高級(jí)工程師，研究方向：水產(chǎn)品加工與質(zhì)量安全.E-mail:hlypcd@163.com

1008－830X(2017)01－0025－04