符智榮 李雪峰 周登維

摘要 [目的]優(yōu)化八月瓜果皮超聲水解提取總多酚的工藝條件。[方法]以八月瓜果皮為研究對(duì)象，通過(guò)單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)考察了水解pH、水解溫度和水解時(shí)間對(duì)總多酚得率的影響，建立了數(shù)學(xué)模型。[結(jié)果]用乙醇作為溶劑，按1∶20（g/mL）固液比加60%乙醇水溶液，在最優(yōu)條件下（pH 5.23，水解溫度53.76 ℃，水解時(shí)間115.66 min），模型對(duì)總多酚得率的預(yù)測(cè)值為5.63%。優(yōu)化條件組合（pH 5.23，水解溫度54 ℃，水解時(shí)間116 min）試驗(yàn)下總多酚得率為5.58%，模型預(yù)測(cè)值與組合試驗(yàn)結(jié)果吻合。[結(jié)論]試驗(yàn)結(jié)果為八月瓜的開(kāi)發(fā)提供了理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞 八月瓜；總多酚；水解；響應(yīng)面法

中圖分類(lèi)號(hào) TS201.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2017）34-0001-03

Abstract [Objective] The aim was to optimize extraction technology of total polyphenol by ultrasonichydrolysis. [Method] With Akebia trifoliate pericarp as the research object， Influence of pH， hydrolysis temperature and time on extraction yield of total polyphenol was investigated by single factor experiment and response surface method. Mathematical model of the experiment was established. [Result] The results show that using ethanol as solvent， according to 1∶20（g/mL） solidliquid ratio addition 60% ethanol aqueous solution， model on predictive value of total polyphenols extraction yield was 5.63% at pH of 5.23， 53.76 ℃ hydrolysis 115.66 min. Extraction ratio of total polyphenols under combination experiment of optimal condition was 5.58%. The model predicted values and the combination experiment result was identical. [Conclusion] The results provide reference for the exploitation of Akebia trifoliate.

Key words Akebia trifoliate；Total polyphenol；Hydrolysis；Response surface method

八月瓜（Akebia trifoliate），又名八月炸、牛滾瓜，主要分布在我國(guó)西南各省、區(qū)、市。八月瓜是木通科植物三葉木通的果實(shí)，可入藥和食用，是一種藥食兩用綠色水果[1]。研究表明，八月瓜含有豐富的有機(jī)酸、可溶性糖、維生素、氨基酸、多酚和微量元素，具有良好的醫(yī)療保健作用[2-3]。隨著野生八月瓜的引種種植，八月瓜的研究也不斷精細(xì)化。歐陽(yáng)玉祝等[4-5]對(duì)八月瓜籽油提取和營(yíng)養(yǎng)成分進(jìn)行了分析，并對(duì)油中脂肪酸組成與含量進(jìn)行了研究；符智榮等[6]用GC-MS分析了八月瓜果皮揮發(fā)油的化學(xué)成分；吳瑩等[7]用GC-MS分析了八月瓜果實(shí)香氣的化學(xué)成分；謝小霞等[8]綜述了三葉木通的藥學(xué)現(xiàn)狀；林卉等[9]對(duì)八月瓜果皮齊墩果酸的超臨界CO2萃取工藝條件進(jìn)行了優(yōu)化。八月瓜果皮中含有豐富的多酚，多酚化合物通過(guò)苷鍵或酯鍵與其他生物大分子結(jié)合，這些鍵的斷裂直接影響多酚的得率。筆者根據(jù)Box-behnken試驗(yàn)原理[10-11]，優(yōu)化了八月瓜果皮超聲水解提取總多酚的工藝條件，以期為八月瓜的開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要儀器。

日本島津UV-2450型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)；KQ-250E型超聲波清洗器；SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器；JA2003N型電子天平；M22中量制備儀。

1.1.2 材料與試劑。

八月瓜購(gòu)自湘西古丈市場(chǎng)，鮮果購(gòu)回后將果皮和果肉分開(kāi)，果皮曬干，用粉碎機(jī)打碎至30目，備用。試劑包括無(wú)水乙醇、鹽酸、氫氧化鈉、沒(méi)食子酸、氫氧化鈣、鎢酸鈉、鉬酸鈉、磷酸、硫酸鋰和單質(zhì)溴（國(guó)產(chǎn)分析純）。

1.2 方法

1.2.1 總多酚的超聲提取。

取5 g八月瓜果皮粉末于200 mL圓底燒瓶中，按1∶20（g/mL）料液比加100 mL 60%乙醇水溶液，加稀鹽酸調(diào)節(jié)pH，置于超聲波清洗器中，控制一定溫度攪拌水解一定時(shí)間，抽濾得提取液。提取液中加過(guò)量飽和的澄清石灰水溶液，50 ℃沉淀50 min，過(guò)濾，沉淀用足量3%稀硫酸溶解，抽濾，濾液用60%乙醇定容至50 mL容量瓶中，用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定總多酚含量。

1.2.2 分析方法。

1.2.2.1 沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制。

稱(chēng)取48 mg沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品，用無(wú)水乙醇溶解，定容至10 mL容量瓶中，配制4.8 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)母液。吸取標(biāo)準(zhǔn)母液，用濃度稀釋法制得0.24、0.20、0.16、0.12、0.08、0.04 mg/mL系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。取1 mL樣品，按參考文獻(xiàn)[12]加入1 mL 20%碳酸鈉，再加入1 mL Folin-Ciocaileu試劑定容至25 mL容量瓶中，用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定760 nm波長(zhǎng)處吸光度，以吸光度為橫坐標(biāo)，濃度為縱坐標(biāo)繪圖，數(shù)據(jù)用計(jì)算機(jī)進(jìn)行線(xiàn)性回歸，得回歸方程：

1.2.2.2 樣品總多酚的測(cè)定。

取1 mL樣品溶液，按“1.2.2.1”方法用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定760 nm波長(zhǎng)處吸光度，將吸光度代入回歸方程計(jì)算總多酚濃度，計(jì)算總多酚的質(zhì)量，按下式計(jì)算總多酚的得率：

總多酚得率=提取液中總多酚質(zhì)量八月瓜果皮粉末質(zhì)量×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素影響試驗(yàn)

2.1.1 pH的影響。

八月瓜果皮中的多酚化合物通過(guò)苷鍵或酯鍵與其他生物大分子結(jié)合，這些苷鍵或酯鍵在不同的pH下水解成多酚化合物，水解程度大小直接影響總多酚得率。為了考察水解pH對(duì)總多酚得率的影響，取50 mL提取液，按“1.2.1”方法50 ℃超聲水解60 min。由圖1可知，水解pH對(duì)總多酚得率有較大影響，pH太大或太小都不利于水解反應(yīng)的發(fā)生，pH=4時(shí)達(dá)最大值，多酚得率為4.78%。堿性條件下水解效率比酸性條件下低，由于苷鍵易在酸性條件下水解，說(shuō)明多酚在植物中可能是通過(guò)苷鍵與生物大分子結(jié)合。

2.1.2 水解時(shí)間的影響。

水解時(shí)間長(zhǎng)短對(duì)水解程度有直接的影響，因此，水解時(shí)間對(duì)多酚得率有直接影響。為了考察水解時(shí)間的影響，取50 mL提取液，調(diào)節(jié)pH至5，按“1.2.1”方法在50 ℃下水解60～150 min。由圖2可知，隨水解時(shí)間的增加，總多酚得率增加，到90 min達(dá)最大值（5.04%），隨后減小。水解時(shí)間太短，水解不完全，萃取效率低；水解時(shí)間太長(zhǎng)，多酚易氧化。

2.1.3 水解溫度的影響。

多酚為多環(huán)多羥基化合物，酚羥基具有良好的還原性，水解溫度過(guò)高將導(dǎo)致多酚的氧化，因此，水解溫度對(duì)多酚得率有較大影響。為了考察水解溫度的影響，取50 mL提取液，調(diào)節(jié)pH至5，按“1.2.1”方法在不同溫度下超聲水解60 min。由圖3可知，水解溫度為50 ℃時(shí)總多酚得率達(dá)最大值（5.11%），水解溫度低，水解效率低，水解溫度高，多酚易氧化。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

2.2.1 優(yōu)化試驗(yàn)水平表設(shè)計(jì)。

單因素試驗(yàn)得出pH=4、水解時(shí)間90 min、水解溫度50 ℃為最佳條件。單因素試驗(yàn)不能體現(xiàn)各因素的交互影響。為了考察各因素的交互影響，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)行響應(yīng)面組合優(yōu)化，設(shè)計(jì)3因素3水平優(yōu)化組合試驗(yàn)。因素與水平見(jiàn)表1。

2.2.2 試驗(yàn)方案設(shè)計(jì)及結(jié)果。

將表1試驗(yàn)因素與水平按照Design Expert 8.0軟件進(jìn)行因素組合設(shè)計(jì)，并按“1.2.1”方法進(jìn)行超聲水解試驗(yàn)，考察各單因素組合對(duì)總多酚得率的影響，結(jié)果見(jiàn)表2。

2.2.4 模型數(shù)據(jù)的回歸統(tǒng)計(jì)與方差分析。

表2數(shù)據(jù)用Box-behnken試驗(yàn)軟件進(jìn)行回歸統(tǒng)計(jì)，并進(jìn)行方差分析，解釋出模型和各因素相互影響的顯著性、凈誤差和模型的相關(guān)性。

結(jié)果表明，模型的F值為144.39，P<0.000 1，模型的相關(guān)系數(shù)（R）為0.994 6，根據(jù)Box-behnken分析，模型表現(xiàn)為極顯著。X3、X1X2、X2X3、X21、X22、X23 的P<0.000 1，表現(xiàn)為極顯著，表明3個(gè)所選因素對(duì)響應(yīng)值都有顯著影響，其中pH與時(shí)間、時(shí)間與溫度的交互影響極顯著。失擬和凈誤差較小。調(diào)整后的相關(guān)系數(shù)（RAdj2）為0.987 8，表明98.78%來(lái)自于所選變量，該模型對(duì)試驗(yàn)擬合情況較好，可以較好地分析和預(yù)測(cè)總多酚的水解[13-14]。

2.3 響應(yīng)面分析

將表2數(shù)據(jù)用Design-Expert 8.0軟件進(jìn)行三維圖像分析，考察3個(gè)因素的交互性影響，結(jié)果見(jiàn)圖4～6。分析響應(yīng)面圖的坡度陡峭程度，可以預(yù)測(cè)考察因素的交互影響大小。響應(yīng)面坡度越陡峭、等高線(xiàn)越密集，且呈橢圓形表示兩因素相互影響較大，反之影響較小[15]。圖4和圖6響應(yīng)面陡峭，等高線(xiàn)呈橢圓形，表明pH與時(shí)間、時(shí)間與溫度的交互影響較大，與方差分析結(jié)果一致。利用Design-Expert 8.0預(yù)測(cè)總多酚的水解條件：pH為5.23，水解時(shí)間為115.66 min，水解溫度為53.76 ℃。在上述最優(yōu)條件下，模型對(duì)總多酚得率的預(yù)測(cè)值為5.63%。

2.4 最佳工藝組合試驗(yàn)

為了考察該模型對(duì)總多酚預(yù)測(cè)值的合理性，對(duì)上述模型預(yù)測(cè)的水解條件進(jìn)行組合試驗(yàn)，平行試驗(yàn)5次，取平均值。試驗(yàn)中考慮到試驗(yàn)條件的可操作性，將水解時(shí)間調(diào)整為116 min，水解溫度調(diào)整為54 ℃，pH保持不變，為5.23。結(jié)果表明，組合試驗(yàn)得出總多酚得率的平均值為5.58%，5次試驗(yàn)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.98%。試驗(yàn)值與模型預(yù)測(cè)值吻合。

3 結(jié)論

超聲水解是集水解和超聲提取于一體的提取分離方法，在天然植物活性成分提取中的應(yīng)用已顯示出明顯的優(yōu)勢(shì)，已經(jīng)成為提取分離研究的常用方法。研究結(jié)果表明，Design-Expert優(yōu)化的最佳條件：pH為5.23，水解時(shí)間為115.66 min，水解溫度為53.76 ℃，上述條件下，模型對(duì)總多酚得率的預(yù)測(cè)值為5.63%。在pH為5.23、水解溫度54 ℃、水解時(shí)間116 min條件下組合試驗(yàn)，八月瓜果皮總多酚得率為5.58%，試驗(yàn)值與模型預(yù)測(cè)值吻合。

參考文獻(xiàn)

[1] 萬(wàn)明長(zhǎng)，劉學(xué)武，班小重，等.三葉木通栽培條件下果實(shí)性狀及營(yíng)養(yǎng)成分分析[J].貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，36（3）：121-122.

[2] 汪國(guó)龍，范玉，劉慶銀，等.八月瓜果實(shí)主要營(yíng)養(yǎng)成分含量測(cè)定[J].湖北農(nóng)機(jī)化，2008（5）：35.

[3] 班小重，萬(wàn)明長(zhǎng)，張朝君，等.野生果樹(shù)八月瓜的資源收集與利用評(píng)價(jià)[J].貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，36（4）：17-18.

[4] 歐陽(yáng)玉祝，李雪峰，姚懿桓.離子沉淀法分離八月瓜果皮中的總多酚[J].食品科學(xué)，2014，35（16）：76-79.

[5] 歐陽(yáng)玉祝，李勇，吳道宏，等.八月瓜籽中脂肪酸的超聲提取及GC-MS分析[J].食品科學(xué)，2010，31（20）：322-324.

[6] 符智榮，李雪峰，歐陽(yáng)玉祝，等.八月瓜果皮揮發(fā)油的GC-MS分析[J].廣東化工，2014，41（15）：42-43.

[7] 吳瑩，張百忍.八月瓜果實(shí)香氣的GC-MS分析[J].中國(guó)釀造，2012，31（6）：169-171.

[8] 謝小霞，葛發(fā)歡.三葉木通藥學(xué)研究現(xiàn)狀與展望[J].現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生，2009，25（14）：2165-2167.

[9] 林卉，陳秋銀，羅贊艷，等.超臨界CO2萃取八月瓜果皮中齊墩果酸條件優(yōu)化[J].山東化工，2015，44（4）：24-26.

[10] 歐陽(yáng)玉祝，李雪峰，魏燕，等.D101大孔樹(shù)脂對(duì)連翹中黃酮類(lèi)成分的吸附特性研究[J].核農(nóng)學(xué)報(bào)，2013，27（10）：1534-1538.

[11] 陳燕勤，陳德軍，楊再磊，等.基于響應(yīng)曲面法優(yōu)化文冠果種仁油的提取工藝研究[J].化學(xué)與生物工程，2012，29（2）：33-35.

[12] 曹艷萍，代宏哲，曹煒，等.Folin-Ciocaileu比色法測(cè)定紅棗總酚[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，36（4）：1299-1302.

[13] 郭元亨，馬李一，鄭華，等.響應(yīng)曲面法優(yōu)化微波輔助提取胭脂蟲(chóng)紅色素工藝[J].林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè)，2011，31（4）：87-92.

[14] 楊佳宇，徐勇威，孫亞麗，等.響應(yīng)面法優(yōu)化田基黃總黃酮的吸附工藝[J].吉首大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2012，33（6）：89-94.

[15] 劉奉強(qiáng)，肖鑒謀，劉太澤.應(yīng)用響應(yīng)面法優(yōu)化超聲波提取荊芥中總黃酮的工藝[J].南昌大學(xué)學(xué)報(bào)（工科版），2011，33（2）：149-155.