程廣東 張強(qiáng) 岳麗紅

摘要 [目的]研究內(nèi)毒素和連翹酯苷A對雞脾淋巴細(xì)胞中白介素-17（IL-17）水平的影響。[方法]將1日齡雛雞正常飼養(yǎng)至50日齡時(shí)，心臟采血處死，表面消毒后，剖檢用脾淋巴細(xì)胞分離液分離脾淋巴細(xì)胞，將脾淋巴細(xì)胞分為20個組，具體為4個劑量組×5個時(shí)間點(diǎn)。4個劑量組分別為：對照組、LPS組（5 μg/mL）、連翹酯苷A預(yù)防低劑量組（200 μg/mL連翹酯苷 A+5 μg/mL LPS）、連翹酯苷A預(yù)防高劑量組（400 μg/mL連翹酯苷 A+5 μg/mL LPS）。5個時(shí)間點(diǎn)分別為0、6、12、24、48 h。通過采用ELISA和Real time-PCR方法檢測脾臟淋巴細(xì)胞中IL-17水平。[結(jié)果]ELISA結(jié)果顯示，與正常組相比，LPS組脾臟淋巴細(xì)胞中炎癥因子IL-17含量升高；與LPS組比較，連翹酯苷A組脾臟淋巴細(xì)胞中上述炎癥因子含量下降，表明脾臟中炎癥因子的變化呈正相關(guān)性，通過抑制LPS誘導(dǎo)的雞脾臟中上述炎癥因子的升高，減輕炎癥反應(yīng)。Real time-PCR結(jié)果顯示，與正常組相比，LPS組脾臟淋巴細(xì)胞中炎癥因子IL-17 mRNA 表達(dá)量升高；與LPS組比較，連翹酯苷A組預(yù)防組脾臟淋巴細(xì)胞中上述炎癥因子表達(dá)量下降，變化呈相關(guān)性，試驗(yàn)表明連翹酯苷A可以通過轉(zhuǎn)錄水平抑制LPS誘導(dǎo)的雞脾臟淋巴細(xì)胞中上述炎癥因子表達(dá)量的升高，減輕炎癥反應(yīng)。[結(jié)論]連翹酯苷A抑制雞脾臟淋巴細(xì)胞中IL-17水平，可起到抗炎功能。

關(guān)鍵詞 連翹酯苷A；內(nèi)毒素；淋巴細(xì)胞；白介素-17

中圖分類號 S853.7 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 0517-6611（2017）34-0106-03

Abstract [Objective] Effect of Forsythiaside A on IL17 level in spleen lymphocyte of chickens induced by lipopolysaccharide was studied.[Method]Dayold chickens were fed normally for 50 days， chickens were killed， collecting the spleen sterilely， by lymphotocyte separation medium， spleen lymphocytes were divided into 20 groups（4 doses×five time points）.Four groups included control group， LPS injection group（5 μg/mL），F(xiàn)orsythiaside A low dose treatment group （Forsythiaside A 200 μg/kg+LPS 5 μg/mL）， Forsythiaside A high dose treatment group （Forsythiaside A 400 μg/kg+LPS 5 μg/mL）.Five time points were：0 h，6 h，12 h，24 h，48 h.Lymphocyte IL17 level was determined by ELISA and Real timePCR. [Result]ELISA results showed that protein content of IL17 of spleen lymphocytes increased in LPS groups compared with control group. Forsythiaside A decreased content of above inflammation factor compared with LPS group.Decrease inflammation response showed positive correlation with inflammation factor change of spleen lymphocytes through inhibiting IL17 of spleen lymphocytes in the chicken by LPS to reduce inflammation reactions. Real timePCR results showed that IL17 mRNA expression level of inflammation factor of spleen lymphocytes increased in LPS groups compared with control group.While Forsythiaside A decreased mRNA expression of IL17.Decreasing inflammation response showed positive correlation with inflammation factor change of spleen lymphocytes through inhibiting inflammation factor of spleen in the chicken by LPS to reduce inflammation reactions.[Conclusion]Forsythiaside A perhaps decreased IL17 level，it had antioxidant and antiinflammatory function.

Key words Forsythiaside A；Lipopolysaccharide；Lymphocyte；IL17

連翹酯苷A具有鎮(zhèn)痛、解熱、抗氧化、抗病毒及抗菌等藥理學(xué)活性，是連翹的主要有效成分之一，其可介導(dǎo)各種炎癥因子，調(diào)控機(jī)體免疫應(yīng)答。脂多糖是革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁的成分之一，可引起機(jī)體炎癥反應(yīng)，常被用于復(fù)制炎癥模型[1]。IL-17等炎癥因子往往作為免疫反應(yīng)的重要指示物，IL-17是一種強(qiáng)力炎癥細(xì)胞因子，IL-17包括IL-17A～F等6個家族成員，其主要是由Th17細(xì)胞（新近發(fā)現(xiàn)的CD4+ T細(xì)胞亞群）產(chǎn)生的[2-3]。IL-17F具有獨(dú)特的生物學(xué)功能，可誘導(dǎo)多種趨化因子和細(xì)胞因子的表達(dá)，參與免疫細(xì)胞應(yīng)答及炎癥反應(yīng)，在發(fā)揮抑制腫瘤細(xì)胞進(jìn)展的同時(shí)，亦有促進(jìn)腫瘤進(jìn)展和轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)[4]。當(dāng)炎癥發(fā)生時(shí)，除了脾臟作為機(jī)體外周免疫器官，產(chǎn)生免疫應(yīng)答外，IL-17與IL-17受體（IL-17 receptor，IL-17R）后引起生物學(xué)效應(yīng)。IL-17募集、活化中性粒細(xì)胞，進(jìn)而放大炎性效應(yīng)，引起機(jī)體IL-6等細(xì)胞因子生成，加速炎癥反應(yīng)，在機(jī)體的腫瘤和免疫性疾病中等也起到重要作用[5]。故采用LPS誘導(dǎo)雞脾淋巴細(xì)胞炎癥模型，在連翹酯苷A作用下，從體外模型研究雞脾淋巴細(xì)胞炎癥因子的變化和相關(guān)性，探討體外雞脾淋巴細(xì)胞因子與炎癥的關(guān)系，從調(diào)控炎癥因子的角度，闡明連翹酯苷A抗LPS誘導(dǎo)的雞脾炎癥中的機(jī)制，為連翹酯苷A在雞免疫調(diào)控中的作用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1日齡AA肉雞均購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所動物中心。

主要試劑盒：連翹酯苷 A（純度>98%）購于成都瑞芬思生物科技有限公司。內(nèi)毒素LPS（血清型O55：B5，Sigma產(chǎn)品，批號L-2880）購自美國SIGMA 公司。

主要儀器：LightCycler480（FACS CantoⅡ，美國Roche公司），酶標(biāo)儀型號（DENLEY DRAGON Wellscan MK3，Thermo，荷蘭）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)分組與處理。

脾淋巴細(xì)胞的分離：將1日齡雛雞正常飼養(yǎng)至50日齡時(shí)，心臟采血處死，表面消毒后，移至超凈工作臺中剖檢，無菌取出脾臟，按程廣東[6]的方法，用配好的淋巴細(xì)胞分離液分離淋巴細(xì)胞，用加10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液稀釋，將獲得淋巴細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，然后稀釋到4×106個/mL，移到一次性培養(yǎng)瓶中，每瓶加入10 mL培養(yǎng)液。然后將連翹酯苷 A和LPS按如下4種劑量組分別加入到含淋巴細(xì)胞的DMEM培養(yǎng)液中，該試驗(yàn)將脾淋巴細(xì)胞共分為20個組，具體為4個劑量組×5個時(shí)間點(diǎn)。4個劑量組分別為：對照組、LPS組（5 μg/mL）、連翹酯苷A預(yù)防低劑量組（200 μg/mL連翹酯苷 A+5 μg/mL LPS）、連翹酯苷A預(yù)防高劑量組（400 μg/mL連翹酯苷 A+5 μg/mL LPS）。5個時(shí)間點(diǎn)分別為0、6、12、24、48 h。

1.2.2 ELISA檢測雞脾淋巴細(xì)胞中IL-17蛋白含量。

收集不同處理組脾淋巴細(xì)胞后，按程廣東[6]的方法檢測各組血清樣品IL-17含量。

1.2.3 qRT-PCR檢測雞脾淋巴細(xì)胞中IL-17 mRNA表達(dá)量。

收集各不同處理組脾淋巴細(xì)胞后，直接加入TRIZOL試劑0.9 mL，提取RNA，按程廣東[6]的方法，將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA為模板，用于檢測脾臟IL-17的CP值，經(jīng)內(nèi)參 β-actin校正，以歸一法比較各組雞血液中IL-17的mRNA表達(dá)量。

其中提取RNA所用物品均應(yīng)嚴(yán)格按消除RNase的常規(guī)方法處理。

1.3 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)

試驗(yàn)數(shù)據(jù)通過SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以（±s）表示數(shù)據(jù)，采用P檢驗(yàn)進(jìn)行試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)，*P<0.05和**P<0.01表示與對照組比較，#P<0.05和##P<0.01表示與LPS組比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 脾淋巴細(xì)胞中IL-17蛋白含量

由圖1可以看出，同一時(shí)間不同處理組進(jìn)行比較，與正常對照組比較，LPS組中雞脾淋巴細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)中IL-17蛋白含量明顯升高，差異極顯著（P<0.01）；與LPS組比較，不同劑量組的（200 μg/mL和400 μg/mL）連翹酯苷 A抑制LPS誘導(dǎo)的IL-17的蛋白含量升高，差異均極顯著（P<0.01），并成劑量依賴性。隨著連翹酯苷 A與LPS作用雞脾淋巴細(xì)胞作用時(shí)間延長，LPS作用時(shí)間組整體IL-17蛋白含量升高，且在作用6 h時(shí)IL-17蛋白含量達(dá)到最高值；連翹酯苷A預(yù)防低劑量組與連翹酯苷A預(yù)防高劑量組IL-17蛋白在0、6、12 h含量升高，且隨著作用時(shí)間延長，IL-17蛋白含量呈線性上升，且在12 h組IL-17蛋白含量達(dá)到最高值，在24、48 h，隨著作用時(shí)間延長，IL-17蛋白含量下降。

2.2 脾淋巴細(xì)胞中IL-17 mRNA表達(dá)量

由圖2可以看出，同一時(shí)間點(diǎn)不同處理組進(jìn)行比較，與正常組相比，LPS可顯著提高雞脾淋巴細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)中IL-17 mRNA含量，差異均極顯著（P<0.01）；連翹酯苷 A預(yù)防組抑制LPS引發(fā)的雞脾淋巴細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)中IL-17 mRNA含量上升，差異均極顯著（P<0.01），并成劑量依賴性。隨著連翹酯苷 A與LPS作用雞脾淋巴細(xì)胞作用時(shí)間延長，LPS作用時(shí)間12 h組IL-17 mRNA含量達(dá)到最高值；連翹酯苷A預(yù)防低劑量組與連翹酯苷A預(yù)防高劑量組IL-17 mRNA在12 h組達(dá)到最高值。表明連翹酯苷 A與LPS可以通過影響IL-17 mRNA含量影響炎癥反應(yīng)。

3 結(jié)論與討論

3.1 LPS致脾淋巴細(xì)胞炎癥機(jī)制

吳景華等[7]研究表明，青蒿素作用后肝癌組織中Caspase 3的表達(dá)較陰性對照組增加，較陽性對照組表達(dá)有所減少，但I(xiàn)L-17R的表達(dá)較陰性對照組及陽性對照組降低；青蒿素組荷瘤鼠血清IL-17的濃度明顯下降。阮洪生等[8]研究表明，LPS能明顯誘導(dǎo)小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW264.7分泌炎癥因子NO、TNF-α、IL-1β和IL-6，而表兒茶素可以明顯降低LPS誘導(dǎo)的RAW 264.7細(xì)胞釋放炎癥因子NO、TNF-α、IL-1β和IL-6。葛建彬等[9]研究表明，小鼠缺血再灌后缺血側(cè)大腦皮層p65蛋白水平明顯增高，枸杞多糖能顯著降低p65蛋白水平，能顯著降低缺血再灌后TNF-α、IL-6和IL-1β的蛋白生成。王玉明等[10]研究表明，與LPS組相比，芹菜素治療組可以顯著升高肺泡盥洗液中TNF-α、IL-1β、IL-6的表達(dá)水平，而芹菜素可以顯著降低肺泡盥洗液中TNF-α、IL-1β、IL-6的表達(dá)水平，并抑制NF-κB信號通路的激活，芹菜素可以通過抑制NF-κB的激活并降低炎性細(xì)胞因子的水平，從而對小鼠急性肺損傷產(chǎn)生抗炎保護(hù)作用。脾臟是雞體外周免疫器官，其對細(xì)胞免疫和體液免疫起著重要作用，在機(jī)體的免疫系統(tǒng)中起重要作用。而脾淋巴細(xì)胞是脾臟發(fā)揮免疫反應(yīng)的直接效應(yīng)細(xì)胞。體外試驗(yàn)觀察和分析LPS和連翹酯苷A對體外分離培養(yǎng)的雞脾淋巴細(xì)胞的炎癥因子水平，可更直觀地分析和比較效應(yīng)細(xì)胞的直接抗炎作用。該試驗(yàn)研究LPS和連翹酯苷A作用于雞脾淋巴細(xì)胞后，雞脾淋巴細(xì)胞中炎癥因子mRNA表達(dá)量與蛋白含量上升，但也存在時(shí)間和劑量效應(yīng)，雞脾臟和0、6、12、24和48 h組脾淋巴細(xì)胞IL-17的mRNA表達(dá)量升高，表明LPS 能引發(fā)機(jī)體炎癥，導(dǎo)致機(jī)體IL-17等炎癥因子上升，加劇炎癥反應(yīng)。