袁敏齊玉榮王瑞菊

（1. 華北理工大學生命科學學院 基因組學與計算生物學研究中心，唐山 063000；2. 河北師范大學生命科學學院，石家莊 050024）

蛋白激酶BIN2的純化及活性分析

袁敏1齊玉榮2王瑞菊2

（1. 華北理工大學生命科學學院 基因組學與計算生物學研究中心，唐山 063000；2. 河北師范大學生命科學學院，石家莊 050024）

BIN2是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在油菜素內酯（BR）信號轉導中發(fā)揮重要作用。為了獲得具有激酶活性且不帶標簽的BIN2蛋白，將BIN2基因構建到帶eXact標簽的pPAL8表達載體上，獲得BIN2基因的原核表達載體eXact-BIN2，轉化大腸桿菌表達菌株BL21（DE3）。摸索合適的誘導條件后成功誘導出51 kD 的eXact-BIN2蛋白。經eXact純化介質純化并切除標簽，獲得質量較高、不帶標簽的BIN2蛋白。該BIN2蛋白具有較高的激酶活性，能夠在體外磷酸化MBP-BZR1蛋白。

BIN2；磷酸化；蛋白激酶；蛋白純化

BIN2（Brassinosteroid Insensitive 2）是類糖原合成酶激酶3（Glycogen synthase kinase 3，GSK3）家族的成員。GSK3是一類在真核生物中非常保守的基因家族，廣泛參與調控眾多的生物學過程，具有典型的結構特征，從N端到C端依次由可變域、保守激酶域及C末端域組成［1，2］。擬南芥中GSK-LIKE家族共有10個成員，依據序列同源性又可細分為4個亞家族，其中BIN2是II亞家族中的AtSK21。擬南芥GSK-LIKE成員在植物BR（Brassinosteroid，油菜素內酯）信號轉導，生長素信號轉導、花發(fā)育、側根的發(fā)育、非生物脅迫響應和氣孔發(fā)育等多方面發(fā)揮重要作用［3-9］。

在擬南芥中BIN2作為負調控因子參與BR信號通路。BR是一種重要的植物內源激素，在植物細胞伸長，維管組織分化，植物的抗逆抗病等諸多生長發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用，它是目前公認的繼生長素、赤霉素、細胞分裂素、脫落酸、乙烯之后被發(fā)現的第六大類植物激素。BR合成缺失突變體或對BR不敏感的突變體表現為植株矮小、葉片暗綠及暗中光形態(tài)建成等表型［10，11］。近年來，關于BR信號轉導方面的研究一直是生物學領域研究的熱點問題之一，并且取得了很多重大的科研成果，鑒定出了很多參與BR信號轉導的組分，BR 通過一條磷酸化信號轉導通路調節(jié)基因表達。當植物體內BR濃度較低時，BIN2持續(xù)磷酸化轉錄因子BZR1（Brassinazole Resistant 1）和BES1（bri1-Ethylmethane Suppressor 1）。隨著BR濃度升高，BIN2的活性受到抑制，失活的BIN2不能繼續(xù)磷酸化下游的BZR1和BES1，而BZR1和BES1會被蛋白磷酸酶PP2A（Protein Phosphatase 2A）去磷酸化進而調控下游基因的表達。在這一系列的蛋白質可逆磷酸化修飾過程中，激酶BIN2與磷酸酶PP2A相互配合控制核心轉錄因子BZR1/BES1的磷酸化狀態(tài)在BR信號轉導通路中發(fā)揮十分重要的作用［12-16］。近年來的研究表明，BIN2可以磷酸化并抑制MAPKKK（YDA）活性而參與植株氣孔發(fā)育［4，17］。BIN2在BR信號轉導與植株氣孔發(fā)育的交叉互作中發(fā)揮核心作用。基于BIN2功能的重要性，純化BIN2蛋白并解析其晶體結構將更有助于理解其結構與功能的關系。

目前，純化蛋白通常利用融合表達的親和標簽，獲得帶有標簽蛋白的融合蛋白。常用的標簽有兩類：一類是一些多肽表位，能夠與固定在樹脂上的分子配體或多肽結合。如Flag 標簽，生物素受體多肽標簽以及鈣調蛋白結合多肽標簽等；另一類是能夠與固定在層析介質上的小分子配體結合的大蛋白標簽，如GST，MBP標簽等。無論哪種標簽都會干擾蛋白的生物學活性，影響其晶體結構。通常情況下可以用一種高度特異性的蛋白內切酶切割和去除標簽，但是這些蛋白酶對不同蛋白質的切割效率差異很大，并且蛋白切割操作步驟比較復雜，很可能在切割過程中對蛋白造成影響，比如蛋白質變性、降解等。本研究中利用Bio-Rad公司的Profinity eXact 純化系統(tǒng)很好的解決了上述問題。該系統(tǒng)把eXact標簽與固定在純化介質上的突變的絲氨酸蛋白酶結合，利用鹵素離子氟離子或者疊氮化鈉在標簽和目的蛋白之間剪切，使標簽滯留在純化介質上，而目的蛋白從層析柱上洗脫下來。蛋白洗脫與切割一步完成，切割下來的目的蛋白不含有eXact純化標簽的殘留，能夠保持目的蛋白本身的生理特性［18-20］。本研究擬利用Profinity eXact 純化系統(tǒng)來純化不帶標簽的、且具有較好激酶活性的BIN2蛋白，為進一步研究其蛋白晶體結構及生物學功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

基因克隆所用酶類及試劑購于康為世紀公司；IPTG誘導劑購于Sigma公司；eXact純化介質購于美國Bio-Rad 公司。

1.2 方法

1.2.1 BIN2基因的克隆及eXact-BIN2原核表達載體的構建 利用BIN2的基因特異引物擴增獲得其全長基因。將BIN2擴增片段與空載體pPAL8分別用SpeⅠ和NotⅠ雙酶切，回收目的條帶，經連接酶連接后轉化大腸桿菌DH5α。挑取一些克隆進行雙酶切鑒定，選取酶切鑒定的陽性克隆測序。測序正確的重組載體eXact-BIN2轉化大腸桿菌BL21（DE3）。1.2.2 IPTG誘導濃度、誘導溫度和誘導時間對eXact-BIN2蛋白表達的影響 將轉化eXact-BIN2重組載體的BL21大腸桿菌在LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，1∶200擴培后繼續(xù)培養(yǎng)至菌液OD600在0.6-0.8之間，分別使用終濃度為0.1 mmol/L和0.5 mmol/L的IPTG，在37℃、30℃和23℃ 3種不同溫度下誘導1-6 h收集菌體。SDS-PAGE電泳檢測eXact-BIN2蛋白表達情況，確定合適的IPTG濃度、誘導溫度以及誘導時間。

1.2.3 BIN2蛋白的純化 利用eXact介質進行純化。收集經IPTG誘導的菌體，棄去上清，用樣品緩沖液（0.1 mol/L 磷酸鹽緩沖液，pH7.2）重懸菌體，超聲破碎后，14 000 r/min 4℃離心15 min。收集上清液與eXact介質低溫混勻1-2 h。1 500-2 000 g/min離心，棄去上清。用加入0.2% Triton-X100的樣品緩沖液洗滌eXact介質數次除去雜蛋白。利用蛋白洗脫緩沖液（0.1 mol/L 磷酸鹽緩沖液，pH7.2，0.1 mol/L NaF）與eXact介質孵育5-10 min，離心收集洗脫液，重復洗脫多次。取0.5-1 μg獲得的蛋白進行SDS-PAGE電泳，檢測蛋白純化效果。

1.2.4 體外蛋白激酶試驗 準備50 mmol/L Tris.HCl，pH7.4，10 μmol/L ATP，1 mmol/L MgCl2作為激酶反應液。將1 μg BIN2蛋白與0.5 μg MBP-BZR1蛋白加入到激酶反應液中至總體系20 μL，室溫孵育10-30 min。然后利用SDS-PAGE電泳通過分析電泳遷移率的變化判斷MBP-BZR1是否被BIN2磷酸化。蛋白質被磷酸化后，分子量變大，電泳時遷移速度變慢，使用合適濃度的蛋白分離膠可以區(qū)分出磷酸化前后蛋白質分子量的差異。因此，可以通過分析底物蛋白質在激酶反應前后的電泳遷移情況來判斷MBPBZR1是否被BIN2磷酸化。

2 結果

2.1 BIN2基因的克隆及eXact-BIN2原核表達載體的構建

利用基因特異性引物擴增獲得1 143 bp的BIN2全長基因（圖1-A），經SpeⅠ和NotⅠ雙酶切鑒定獲得大約1 000 bp的小片段和大約6 000 bp的大片段，分別與基因片段和空載體大小相符。再利用SpeⅠ進行單酶切鑒定，獲得大約7 000 bp 的片段，與BIN2基因加空載體的總大小相符（圖1-B）。挑取克隆測序后獲得正確的eXact-BIN2原核表達載體。

圖1 eXact-BIN2原核表達載體的構建

2.2 IPTG誘導濃度、誘導溫度和誘導時間對BIN2蛋白表達的影響

將轉化eXact-BIN2重組載體的BL21大腸桿菌分別使用終濃度為0.1 mmol/L和0.5 mmol/L的IPTG，在37℃、30℃和23℃ 3種不同溫度下誘導1-6 h收集菌體。SDS-PAGE檢測結果（圖2）表明，誘導的eXact-BIN2融合蛋白為51 kD，并且該蛋白對誘導條件的要求并不十分嚴格，在37℃、30℃和23℃溫度下eXact-BIN2蛋白表達量均較高，0.1 mmol/L和0.5 mmol/L IPTG的誘導效果也沒有明顯差異。

圖2 不同誘導條件下eXact-BIN2融合蛋白的表達

2.3 BIN2蛋白的純化

經過摸索，確定IPTG誘導濃度為0.1 mmol/L，然后在37℃、30℃和23℃溫度下分別對BIN2蛋白進行誘導和純化。SDS-PAGE表明獲得的eXact-BIN2融合蛋白純度質量均較高，洗脫后切除eXact標簽的BIN2蛋白分子量大小為43 kD（圖3）。測定蛋白濃度，發(fā)現37℃誘導后純化的蛋白濃度較低，為93.4 μg/L；30℃誘導后純化的蛋白濃度為420.4 μg/L；23℃誘導后純化的BIN2蛋白濃度最高，為997.2 μg/L，可能是23℃誘導時產生的可溶性BIN2蛋白量最多。

2.4 蛋白激酶BIN2能夠磷酸化MBP-BZR1

將試驗所獲得的BIN2蛋白通過體外蛋白激酶試驗檢測其活性，結果如圖4所示，跟孵育前的MBP-BZR1（泳道2）相比，與BIN2共同孵育后的MBP-BZR1分子量變大，電泳遷移變慢，表明MBPBZR1已經被BIN2磷酸化成為磷酸化狀態(tài)的BZR1（pBZR1）（泳道3）。泳道1為單獨的MBP蛋白，泳道4為單獨的BIN2蛋白。

圖3 切除eXact標簽的BIN2蛋白的洗脫結果

圖4 BIN2能夠體外磷酸化MBP-BZR1

3 討論

可逆磷酸化是一種重要的蛋白質翻譯后修飾方式，廣泛參與植物體內細胞分裂和伸長、激素信號轉導、植物對逆境脅迫的反應、光合作用和衰老等眾多生物學過程。植物體內蛋白激酶種類很多，BIN2作為一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，屬于GSK3家族成員，對其大部分底物都以負調節(jié)的作用方式發(fā)揮作用。BIN2通過磷酸化BZR1在BR信號轉導通路中發(fā)揮負調控作用［12］。

研究蛋白質修飾的試驗中經常會利用標簽來純化目的蛋白，然而，標簽蛋白作為融合蛋白的一部分會一起被純化出來，并且標簽的大小、親疏水性，以及帶電荷情況都會對目的蛋白的表達、可溶性以及活性等方面產生影響。為了避免標簽的干擾，獲得更接近生理條件下的蛋白，純化不帶標簽的蛋白是一種非常重要的手段。不帶標簽的蛋白可以通過純化后對融合蛋白進行標簽剪切獲得，但是分離去除標簽蛋白操作步驟比較復雜，并且可能在剪切過程中導致蛋白質變性、降解等。Bio-Rad公司的Profinity eXact 純化系統(tǒng)將蛋白洗脫與蛋白切割一步完成，切割下來的目的蛋白不含有純化標簽，能夠保持目的蛋白本身的生理特性。這是與傳統(tǒng)的蛋白純化標簽相比而具有的一個極大的優(yōu)點［19，20］。本研究獲得的不帶標簽的BIN2蛋白保留了很好的激酶活性，能夠在體外磷酸化底物MBP-BZR1蛋白。在純化過程中，多次重復試驗，收集的第一管蛋白洗脫液中都含有一個分子量大約70 kD的蛋白，推測可能是對維持BIN2正確構象與激酶活性密切相關的伴侶蛋白，也可能是與純化介質非特異結合的雜蛋白。

4 結論

本研究成功構建了eXact-BIN2原核表達載體，誘導出51 kD的eXact-BIN2融合蛋白。利用eXact純化介質成功獲得了不帶標簽的，大小約為43 kD的BIN2蛋白，該BIN2蛋白具有較好的激酶活性，能夠在體外磷酸化底物MBP-BZR1蛋白。

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（責任編輯 狄艷紅）

Purification and Activity Analysis of Tag- free Protein Kinase BIN2

YUAN Min1QI Yu-rong2WANG Rui-ju2
（1. Center for Genomics and Computational Biology，College of Life Sciences，North China University of Science and Technology，Tangshan 063000；2. College of Life Sciences，Hebei Normal University，Shijiazhuang 050024）

BIN2 is a kind of Ser/Thr protein kinase，and plays important roles in BR signal transduction pathway. In order to obtain the active and tag-free BIN2 protein，the BIN2 gene was cloned into the prokaryotic expression vector pPAL8 to obtain BIN2-pPAL8 expression vector. The correct plasmid BIN2-pPAL8 was transformed into E.coli expression strain BL21（DE3）. After exploring the proper induction conditions，the 51 kD eXact-BIN2 protein was successfully induced and purified using eXact purification system. The high-quality and tag-free BIN2 protein was obtained through cleaving the eXact tag. The purified BIN2 protein is highly active，which could phosphorylate MBP-BZR1 in vitro.

BIN2；phosphorylation；protein kinase；protein purification

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016-1167

2016-12-26

國家自然科學基金項目（31401212，31201063），河北省自然科學基金（C2014209134，C2012205042）

袁敏，女，博士，研究方向：植物生長發(fā)育；E-mail：yuanmin308@163.com

王瑞菊，女，博士，研究方向：植物激素信號轉導；E-mail：15100149962@126.com