陳瑩 王遠(yuǎn)卓 楊娟娟 郭興國(guó) 喬惠麗

（南陽(yáng)師范學(xué)院農(nóng)業(yè)工程學(xué)院 河南省伏牛山昆蟲生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南陽(yáng) 473061）

家蠶GAPDH內(nèi)參蛋白多克隆抗體的制備及其檢測(cè)

陳瑩 王遠(yuǎn)卓 楊娟娟 郭興國(guó) 喬惠麗

（南陽(yáng)師范學(xué)院農(nóng)業(yè)工程學(xué)院 河南省伏牛山昆蟲生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南陽(yáng) 473061）

制備家蠶GAPDH內(nèi)參蛋白多克隆抗體，并對(duì)該抗體進(jìn)行檢測(cè)。利用PCR技術(shù)從家蠶中克隆GAPDH基因，構(gòu)建其原核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白并純化。純化后的蛋白作為抗原免疫新西蘭大白兔制備GAPDH多克隆抗體。用酶聯(lián)免疫吸附法和Western blot檢測(cè)抗體的效價(jià)和特異性。結(jié)果顯示，成功構(gòu)建GAPDH/pET-28a原核表達(dá)載體，獲得高純度的GAPDH重組融合蛋白；經(jīng)SDS-PAGE和抗His單抗檢測(cè)，純化后蛋白的分子量大小與預(yù)測(cè)的一致；以該蛋白為免疫抗原，采用4次免疫方式對(duì)新西蘭大白兔進(jìn)行免疫，獲得GAPDH多克隆抗體血清。酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)結(jié)果表明，GAPDH抗體的效價(jià)為1：8 000，并能與天然家蠶蛋白特異性結(jié)合。成功制備了家蠶內(nèi)參蛋白GAPDH多克隆抗體，為深入研究家蠶中不同蛋白的生理功能和作用奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

家蠶；甘油醛-3-磷酸脫氫酶；多克隆抗體

甘油醛-3-磷酸脫氫酶（Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）是一種重要的糖酵解酶，它催化三磷酸甘油酸氧化磷酸化成為1， 3-二磷酸甘油酸，主要有參與能量代謝、DNA修復(fù)、蛋白表達(dá)調(diào)節(jié)等多種生理功能。關(guān)于哺乳動(dòng)物GAPDH蛋白各種生物性能的鑒定已有較多報(bào)道［1］，包括運(yùn)輸和膜融合中的作用、微管組裝、核輸出和蛋白磷酸轉(zhuǎn)移酶/激酶反應(yīng)。同時(shí)也發(fā)現(xiàn)真核生物GAPDH 與細(xì)胞附著有關(guān)，可能起到增強(qiáng)細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)的作用［2］。GAPDH作為管家基因，在真核和原核生物中高度保守，氨基酸序列同源性高達(dá)70%-100%，且在同種組織或細(xì)胞的不同時(shí)期表達(dá)量相對(duì)恒定，因而被作為內(nèi)參蛋白廣泛應(yīng)用［3］。

目前對(duì)基因進(jìn)行表達(dá)定量的常用方法有實(shí)時(shí)定量PCR、RNA印跡、核糖核酸酶保護(hù)分析、基因芯片等，在蛋白水平進(jìn)行定量的方法有蛋白印跡、免疫共沉淀等，都需應(yīng)用內(nèi)參基因?qū)δ康幕蚝偷鞍走M(jìn)行校正，以獲得真實(shí)可靠的結(jié)果。管家基因有幾百種，最常用的有甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）［4-7］、肌動(dòng)蛋白（Actin）［4，6-8］、微管蛋白（Tubulin）［6，9］、組蛋白3（H3）［10，11］、核糖體蛋白L3（RPL3）［7，12］和泛素結(jié)合蛋白（UBC）［13，14］等。GAPDH作為內(nèi)參基因的一種，它具有高度的保守性，在各種類型組織和細(xì)胞中均恒定表達(dá)。

家蠶是重要的經(jīng)濟(jì)昆蟲和鱗翅目模式生物，在研究昆蟲遺傳發(fā)育、基因調(diào)控分子機(jī)制和功能基因組學(xué)中具有重要作用。內(nèi)參基因在家蠶的相關(guān)基因功能研究中發(fā)揮著必不可少的作用。本研究以家蠶為研究對(duì)象，通過(guò)對(duì)家蠶GAPDH基因進(jìn)行克隆、原核表達(dá)和純化，獲得GAPDH蛋白的多克隆抗體，并檢測(cè)GAPDH多克隆抗體在家蠶不同時(shí)期不同組織樣品中的雜交效果，旨在為家蠶不同蛋白表達(dá)水平分析提供了前提，同時(shí)為家蠶和其他同源物種昆蟲的蛋白功能研究提供更加高效的抗體。

1 材料與方法

1.1 材料

pET-28a表達(dá)載體和原核表達(dá)菌株Rosetta由南陽(yáng)師范學(xué)院河南省伏牛山昆蟲生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存，辣根過(guò)氧化物標(biāo)記的羊抗兔抗體購(gòu)自北京中山金橋；福氏完全佐劑，福氏不完全佐劑購(gòu)自Sigma公司；2.5 kg左右雄性新西蘭純種大白兔 購(gòu)自鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 方法1.2.1 家蠶總RNA的提取及cDNA的合成 利用Trizol試劑（Invitrogen）提取家蠶細(xì)胞的總RNA，按照大連寶生物的PrimeScript II 反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成第一條鏈cDNA。

1.2.2 家蠶GAPDH基因的克隆及測(cè)序 根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中編碼家蠶GAPDH序列（LOC692786）設(shè)計(jì)特異引物（表1），以家蠶RNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系：10×buffer 2 μL，dNTP 1.6 μL cDNA 1 μL，rTaq酶 0.2 μL，上下游引物各0.8 μL，加無(wú)菌水補(bǔ)至20 μL。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min，30個(gè)循環(huán)（95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s），72℃延伸10 min。檢測(cè)正確的PCR產(chǎn)物通過(guò)膠回收試劑盒對(duì)目的條帶進(jìn)行切膠回收。將回收的目的片段連接pMD-19T載體（TaKaRa），轉(zhuǎn)化大腸桿菌，通過(guò)藍(lán)白斑篩選挑取陽(yáng)性克隆，經(jīng)PCR和雙酶切鑒定后送深圳華大基因科技服務(wù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.3 原核表達(dá)載體GAPDH/pET-28a的構(gòu)建與鑒定 將測(cè)序正確的GAPDH/pMD-19T用BamH I和EcoR I進(jìn)行雙酶切，并切膠純化目的片段，將純化產(chǎn)物連接到帶有His標(biāo)簽的pET-28a載體，對(duì)陽(yáng)性菌落進(jìn)行PCR和雙酶切鑒定，經(jīng)鑒定正確的重組質(zhì)粒用于轉(zhuǎn)化Rosetta感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行蛋白誘導(dǎo)表達(dá)。1.2.4 GAPDH融合蛋白的原核表達(dá)純化及鑒定 將重組質(zhì)粒GAPDH/pET-28a轉(zhuǎn)入大腸桿菌Rosetta感受態(tài)細(xì)胞中，37℃，220 r/min振蕩培養(yǎng)過(guò)夜；次日，按照1∶100的比例（V/V），取1 mL菌液加入到100 mL新的含有卡那霉素培養(yǎng)基中，37℃，220 r/min至OD600值為0.6-0.8時(shí)按1∶1 000的比例（V/V）加入終濃度為0.4 mmol/L IPTG，37℃，220 r/min誘導(dǎo)3 h，SDS-PAGE檢測(cè)目的蛋白表達(dá)情況。誘導(dǎo)后有目的蛋白表達(dá)的菌液，4℃，6 000 r/min離心10 min收集菌體，棄上清，用2 mL pH7.4，50 mmol/L Tris-HCl緩沖液重懸沉淀，超聲破碎30 min并離心，SDS-PAGE檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)形式。結(jié)果表明，GAPDH以包涵體的形式存在于沉淀中。

GAPDH包涵體蛋白按照文獻(xiàn)報(bào)道的KCl染色切膠方法進(jìn)行純化［15］。將超聲破碎后的樣品4℃，12 000 r/min離心5 min，棄上清，沉淀加入適量蛋白上樣緩沖液重懸，沸水浴加熱10 min后SDSPAGE電泳分離，然后用適量的0.25 mol/L 的KCl 溶液染色5 min，用手術(shù)刀片切下染成銀白色的目的條帶，用PBS 洗3 次后，將膠條碾碎并移入EP 管中，并加入適量PBS 于4℃振蕩透析過(guò)夜。離心后取上清，電泳檢測(cè)目的蛋白的純度和濃度，并利用His單抗與純化后GAPDH融合蛋白進(jìn)行Western blot 雜交鑒定。

1.2.5 GAPDH多克隆抗體的制備和效價(jià)測(cè)定 選取新西蘭純種大白兔，將純化后的GAPDH蛋白作為抗原與等體積的弗氏完全佐劑進(jìn)行1∶1充分混合乳化，在雙肩周圍皮下進(jìn)行多點(diǎn)注射，注射前取少量正常血清作為陰性對(duì)照。首次免疫10 d后，以相同抗原與等體積的弗氏不完全佐劑1∶1充分混合進(jìn)行第2次免疫，之后每隔7-10 d免疫1次。免疫3次后取少許血清檢測(cè)免疫效果。經(jīng)4次免疫10 d后，進(jìn)行心臟采血，分離血清進(jìn)行效價(jià)檢測(cè)。

采用酶聯(lián)免疫吸附（Enzyme-linked immuno sorbent assay，ELISA）測(cè)定方法檢測(cè)抗體的效價(jià)，用濃度為 0.5 mg/mL融合His-GAPDH于4℃過(guò)夜包被ELISA板，采用3%牛血清蛋白緩沖液進(jìn)行封閉，將兔抗GAPDH的多抗血清按照1∶500、1∶1 000、1∶2 000、1∶4 000、1∶8 000、1∶16 000和1∶ 32 000進(jìn)行稀釋，一抗孵育2 h，二抗孵育1 h，最后加入顯色液反應(yīng)15 min，用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm處吸光值，未免疫前的血清為陰性對(duì)照。

1.2.6 Western blot 檢測(cè)GAPDH多克隆抗體的特異性 將家蠶幼蟲不同齡期以及家蠶成蟲各個(gè)組織進(jìn)行液氮研磨，然后加入適量含1 mmol/L PMSF蛋白酶抑制劑的50 mmol/L pH7.4 Tris-HCl緩沖液，充分混勻后在4℃，12 000 r/min離心20 min，取上清通過(guò)12% SDS-PAGE電泳檢測(cè)。將家蠶各樣品的總蛋白通過(guò)半干轉(zhuǎn)印系統(tǒng)（15 V，10 min）轉(zhuǎn)到PVDF膜上，用PBST + 2.5%的脫脂牛奶室溫封閉2 h，然后加入1：500稀釋的GAPDH多克隆抗體室溫孵育2 h，洗膜后加入1∶1 000稀釋的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG，室溫孵育1 h，最后用增強(qiáng)型DAB顯色試劑盒（Solarbio）顯色至條帶清晰。

表1 GAPDH的PCR克隆引物

2 結(jié)果

2.1 家蠶GAPDH的PCR克隆及序列分析

以家蠶RNA反轉(zhuǎn)錄后的cDNA為模板，用設(shè)計(jì)的特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果（圖1）顯示在1 000 bp處有一條與預(yù)期大小相同的目的帶。經(jīng)試劑盒回收純化后與pMD19T載體連接，并篩選陽(yáng)性重組子，經(jīng)測(cè)序鑒定后用ClustalW軟件與家蠶GAPDH序列比對(duì)，結(jié)果一致。該基因全長(zhǎng)999 bp，共編碼333個(gè)氨基酸（圖2-A），理論分子量為35.428 kD，等電點(diǎn)為8.31。在NCBI上用Blast分析發(fā)現(xiàn)家蠶GAPDH與部分鱗翅目昆蟲的氨基酸序列一致性達(dá)到90%以上。利用MEGA5軟件對(duì)不同物種模式生物的GAPDH氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，通過(guò)Neighbor Joining法重復(fù)1 000次，其他參數(shù)采用默認(rèn)設(shè)置。結(jié)果（圖2-B）表明，GAPDH在不同物種中具有一定的保守性，其中家蠶與棉鈴蟲（Helicoverpa armigera）的氨基酸保守性最為接近，氨基酸序列一致性達(dá)到93%，黑腹果蠅（Drosophila melanogaster）和意大利蜜蜂（Apis mellifera）為83%，小家鼠（Mus musculus）為78%，人類（Homo sapiens）為77%，斑馬魚（Danio rerio）為75%。

圖1 GAPDH基因的PCR產(chǎn)物電泳檢測(cè)

2.2 家蠶GAPDH原核表達(dá)的載體構(gòu)建

測(cè)序鑒定后的GAPDH/pMD19T載體用BamH I和EcoR I酶切后連接到表達(dá)載體pET-28a轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，陽(yáng)性重組子提取質(zhì)粒后雙酶切鑒定經(jīng)電泳檢測(cè)可看到大小為1 000 bp的目的基因片段（圖3）。鑒定正確的質(zhì)粒經(jīng)華大基因測(cè)序后用ClustalW分析表明，測(cè)序結(jié)果與家蠶GAPDH氨基酸序列一致，說(shuō)明原核表達(dá)載體構(gòu)建成功。

2.3 GAPDH蛋白的原核表達(dá)、蛋白純化及鑒定

將重組質(zhì)粒GAPDH/pET-28a轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta感受態(tài)細(xì)胞，IPTG誘導(dǎo)前后的菌液樣品的SDS-PAGE電泳檢測(cè)結(jié)果顯示，誘導(dǎo)后的樣品中有一條明顯的大小約為39 kD的條帶，與融合His標(biāo)簽的目的蛋白分子量一致。大量誘導(dǎo)表達(dá)后的菌液經(jīng)超聲破碎、離心后，上清和沉淀通過(guò)SDS-PAGE檢測(cè)，結(jié)果表明GAPDH蛋白以包涵體的形式表達(dá)。進(jìn)一步用切膠回收的方式純化包涵體中的目的蛋白，純化后蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測(cè)結(jié)果（圖4-A）顯示，目的條帶單一。為了驗(yàn)證純化后的蛋白為帶His標(biāo)簽的融合蛋白，利用His單抗與純化后GAPDH融合蛋白進(jìn)行Western blot 雜交，雜交結(jié)果（圖4-B）顯色有一條單一的條帶，并與目的蛋白理論分子量一致，由此表明該蛋白為帶His標(biāo)簽的融合目的蛋白，可作為抗原用于后續(xù)多克隆抗體制備。

圖2 家蠶GAPDH基因的cDNA序列、氨基酸序列及不同物種GAPDH系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

圖3 重組表達(dá)載體GAPDH/pET-28a的雙酶切產(chǎn)物電泳檢測(cè)

圖4 重組GAPDH誘導(dǎo)前后、超聲前后、純化后的SDSPAGE電泳檢測(cè)（A）及His單抗的Western blot雜交檢測(cè)（B）

2.4 ELISA檢測(cè)兔抗GAPDH抗體效價(jià)及其特異性

在GAPDH蛋白免疫新西蘭大白兔4次后，將制備的GAPDH多抗血清以不同比例稀釋后作為一抗進(jìn)行ELISA檢測(cè)。結(jié)果如圖5所示，不同稀釋比例的抗血清均可與GAPDH融合蛋白進(jìn)行特異結(jié)合，由此表明GAPDH多抗血清具有較好的免疫原性。按照酶標(biāo)儀檢測(cè)的OD450值大于陰性對(duì)照2倍并且數(shù)值大于0.25的標(biāo)準(zhǔn)，能夠檢測(cè)到抗原抗體特異結(jié)合信號(hào)的最大稀釋濃度為1∶8 000，即GAPDH抗體的效價(jià)為1∶8 000。

為了進(jìn)一步檢測(cè)制備抗體在家蠶中的特異性，采用Western blot方法分別與家蠶幼蟲（圖6-A）、家蠶雄性成蟲（圖6-B）和家蠶雌性成蟲（圖6-C）不同部位的總蛋白進(jìn)行雜交檢測(cè)。結(jié)果顯示，所有樣品中在分子量為35 kD處都有一清晰的條帶，與GAPDH的理論分子量一致。由此表明，GAPDH抗體能特異的結(jié)合家蠶幼蟲各齡期蛋白、家蠶成蟲雄性與雌性不同部位的GAPDH蛋白，從而為后續(xù)研究家蠶中其他蛋白的功能奠定了基礎(chǔ)。

圖5 ELISA檢測(cè)GAPDH多克隆抗血清的效價(jià)

3 討論

目前，對(duì)于功能蛋白的定性和定量分析最常用的方法即Western雜交，而用于Western雜交的內(nèi)參蛋白抗體的種類和來(lái)源也很多。其中國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道中使用GAPDH內(nèi)參的較多［4-7］，對(duì)于細(xì)胞核蛋白，組蛋白H3使用較多［10，11］，而對(duì)于植物樣本常用ACTIN蛋白作為內(nèi)參［16-18］。市場(chǎng)上商品化的動(dòng)物多克隆和單克隆抗體、內(nèi)參抗體的抗原為同時(shí)具有蛋白特異性和種屬通用性的內(nèi)參蛋白部分序列，其檢測(cè)種屬較為廣泛。如目前商品化的GAPDH、ACTIN和TUBULIN的抗體在大部分動(dòng)物和部分昆蟲中都具有保守性，但其在昆蟲中的雜交結(jié)果不太穩(wěn)定。

GAPDH是真核細(xì)胞和細(xì)菌都表達(dá)的具有關(guān)鍵作用的蛋白［19-20］，同時(shí)作為一種多功能蛋白參與許多亞細(xì)胞水平活動(dòng)，包括催化圍觀聚合，參與膜融合和膜轉(zhuǎn)運(yùn)、參與蛋白磷酸化修飾、調(diào)節(jié)蛋白表達(dá)、促進(jìn)細(xì)胞凋亡、參與DNA損傷修復(fù)、作為鐵蛋白受體等［21-23］。GAPDH廣泛存在于眾多生物體中，在細(xì)胞中含量豐富，占總蛋白的10%-20%［24］。GAPDH作為內(nèi)參基因的一種，具有高度的保守性，在各種類型組織和細(xì)胞中均恒定表達(dá)?；贕APDH的特點(diǎn)及其在蛋白功能研究中的作用，利用PCR技術(shù)對(duì)家蠶GAPDH基因進(jìn)行克隆，并連接到pET-28a載體上，通過(guò)原核表達(dá)最終得到了GAPDH蛋白，為制備家蠶GAPDH 抗體提供了前提。家蠶GAPDH基因序列全長(zhǎng)999 bp，編碼333個(gè)氨基酸，理論分子量為35 kD，等電點(diǎn)為8.31。將切膠回收后的GAPDH蛋白免疫純種新西蘭大白兔，獲得了家蠶GAPDH的兔抗血清。ELISA檢測(cè)GAPDH抗體的效價(jià)為1∶8 000，Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示該血清能與前期純化的His-GAPDH融合蛋白和天然家蠶總蛋白結(jié)合，表明該血清具有較好的特異性。

GAPDH作為應(yīng)用最廣泛的內(nèi)參抗體之一，在蛋白功能研究中仍存在障礙。目前商品化的GAPDH抗體大部分為哺乳動(dòng)物來(lái)源，價(jià)格昂貴。本課題組選擇同源性較高的商品化小鼠GAPDH單克隆抗體檢測(cè)家蠶總蛋白，但未能與家蠶蛋白特異性的結(jié)合。因而獲得GAPDH多克隆抗體是檢測(cè)家蠶及鱗翅目昆蟲中不同蛋白表達(dá)規(guī)律的前提條件。針對(duì)家蠶特殊的生命周期，其信號(hào)傳導(dǎo)、蛋白合成與代謝的變化快速顯著，其各組織的分化特異性高，組織之間的功能差異較大，選擇合適的內(nèi)參基因不僅可用于分析家蠶中基因和蛋白表達(dá)水平，也為進(jìn)一步比較分析GAPDH與ACTIN和TUBULIN抗體在家蠶不同發(fā)育時(shí)期、不同組織和不同刺激條件下的穩(wěn)定性和優(yōu)缺點(diǎn)奠定了基礎(chǔ)。

圖6 GAPDH抗體在家蠶不同齡期幼蟲（A）、雄性成蟲（B）和雌性成蟲（C）中的Western blot雜交檢測(cè)

4 結(jié)論

本研究從家蠶中克隆得到了GAPDH基因，構(gòu)建了其原核表達(dá)載體，并在原核中成功表達(dá)并純化了GAPDH蛋白。利用純化的融合GAPDH蛋白作為抗原免疫新西蘭大白兔，獲得針對(duì)家蠶GAPDH特異性較高，并能特異結(jié)合家蠶天然蛋白的多克隆抗體。

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（責(zé)任編輯 李楠）

Preparation and Detection of Polyclonal Antibody of GAPDH Protein from Bombyx mori

CHEN Ying WANG Yuna-zhuo YANG Juan-juan GUO Xing-guo QIAO Hui-li
（Henan Provincial Key Laboratory od Funiu Mountain in Insect Biology，College of Agricultural Engineering，Nanyang Normal University，Nanyang 473061）

This work is to prepare and detect the polyclonal antibody of GAPDH protein in Bombyx mori. GAPDH gene was cloned from silkworm by PCR，then prokaryotic expression vector was constructed and transformed into Escherichia coli competent cell. The recombinant protein was induced and purified. The purified protein was used as antigen to prepare the polyclonal antibody by immunizing New Zealand purebred rabbit. The titer and specificity of the polyclonal antibody was detected by enzyme-linked immune sorbent assay（ELISA）and Western blot. As results，GAPDH/pET-28a vector was constructed successfully，and recombinant GAPDH fusion protein in high purity was obtained. SDS-PAGE and anti-His monoclonal antibody detection showed that the molecular weight of the purified protein was consistent with that predicted. GAPDH polyclonal antiserum was obtained by immunized New Zealand purebred rabbit for four times using the purified protein as an antigen. The titer of GAPDH polyclonal antibody was 1：8 000 by ELISA，and the antiserum was able to bind specifically with the total protein of B mori. Conclusively，the polyclonal antibody of GAPDH is successfully prepared，which lays a solid foundation for further studying the physiological function of different proteins in B. mori.

Bombyx mori；glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase；polyclonal antibody

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0104

2017-02-19

河南省教育廳高等學(xué)校重點(diǎn)科研項(xiàng)目（17A180031）

陳瑩，女，碩士研究生，研究方向：昆蟲生理生化與分子生物學(xué)；E-mail：1142605287@qq.com

喬惠麗，女，博士，副教授，研究方向：昆蟲生理生化與分子生物學(xué)；E-mail：qiaohuili@nynu. edu.cn