趙忠娟 魏艷麗 李紀(jì)順 王貽蓮 楊合同

（山東省科學(xué)院生態(tài)研究所，濟(jì)南 250014）

一種根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的耐鹽椒樣薄荷含芽莖段轉(zhuǎn)化系統(tǒng)

趙忠娟 魏艷麗 李紀(jì)順 王貽蓮 楊合同

（山東省科學(xué)院生態(tài)研究所，濟(jì)南 250014）

椒樣薄荷的轉(zhuǎn)基因技術(shù)是提高精油產(chǎn)量和品質(zhì)的重要手段，為解決耐鹽椒樣薄荷葉片不定芽誘導(dǎo)過(guò)程中易褐化，難分化，不適合作為轉(zhuǎn)基因外植體的問(wèn)題，利用含芽的椒樣薄荷莖段作為外植體建立了一種根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的外源基因轉(zhuǎn)化體系。利用正交試驗(yàn)對(duì)轉(zhuǎn)化所用的根癌農(nóng)桿菌菌液濃度、轉(zhuǎn)化時(shí)間和共培養(yǎng)時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果顯示：3個(gè)因素對(duì)轉(zhuǎn)化效果的影響作用表現(xiàn)為轉(zhuǎn)化時(shí)間（B）>菌液濃度（A）>共培養(yǎng)時(shí)間（C），篩選出的最優(yōu)轉(zhuǎn)化條件為菌液濃度為OD600=0.8，轉(zhuǎn)化時(shí)間為15 min，共培養(yǎng)時(shí)間為3 d。對(duì)不同轉(zhuǎn)化液組分進(jìn)行優(yōu)化篩選，結(jié)果獲得最適的轉(zhuǎn)化液組分為：1/5MS+ 0.5 g/L MES（2-（N-嗎啡啉）乙磺酸）+1%葡萄糖+2%蔗糖，PH5.4。利用不同植物表達(dá)載體進(jìn)行轉(zhuǎn)化，并通過(guò)基因組PCR和GUS染色進(jìn)行轉(zhuǎn)化植株的陽(yáng)性檢測(cè)，結(jié)果表明該轉(zhuǎn)化體系適用于多種植物表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化，容易獲得再生植株，為耐鹽椒樣薄荷的基因轉(zhuǎn)化提供新的方法與體系。

椒樣薄荷；莖段；根癌農(nóng)桿菌；植物表達(dá)載體；基因組PCR；GUS染色

椒樣薄荷（Mentha piperita L.）是唇形科薄荷屬多年生草本植物，別名歐洲薄荷、胡椒薄荷、黑薄荷，系水薄荷（Mentha aquatica）和綠薄荷（Mentha spicata）雜交而成的六倍體不育系，至今已有250年［1］。椒樣薄荷的主要產(chǎn)品薄荷精油含薄荷酮、薄荷醇、乙酸薄荷酯等118 種有效成分，香氣純正，清爽宜人，具有清涼特性和鎮(zhèn)痛作用，被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥和日用化妝品行業(yè)［2-4］?！翱圃?號(hào)”是本研究室篩選出，可在黃河三角洲地區(qū)大規(guī)模推廣種植的耐鹽椒樣薄荷，該椒樣薄荷對(duì)NaCl脅迫具有較強(qiáng)的耐受性，并具有較好的脫鹽效果［5-7］。

農(nóng)桿菌（Agrobacterium）是一類生活在植物根的表面，依靠根組織滲透出來(lái)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)生存的，普遍存在于土壤中的革蘭氏陰性細(xì)菌。農(nóng)桿菌具有天然感染植物細(xì)胞的能力，可以誘發(fā)植物冠癭瘤。農(nóng)桿菌中存在一種巨大質(zhì)粒，稱為Ti質(zhì)粒。Ti質(zhì)?？勺鳛橥庠椿虻妮d體，介導(dǎo)外源基因的轉(zhuǎn)化［8，9］。目前農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化已經(jīng)廣泛應(yīng)用于雙子葉植物和單子葉植物中，應(yīng)用的農(nóng)桿菌主要為根癌農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）和發(fā)根農(nóng)桿菌（Agrobacterium rhizogenes）2種。

根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法主要有整體植株接種共感染法［10］和葉盤轉(zhuǎn)化法［11］。葉盤轉(zhuǎn)化法是由Horsch等發(fā)展起來(lái)的一種轉(zhuǎn)化方法，其操作過(guò)程中利用打孔器從消毒葉片上取得葉圓片，亦稱之葉盤［11］。后來(lái)這一共培養(yǎng)系統(tǒng)被廣泛用于幼胚［12］、葉片［13］、莖切段［14］、子葉切段［13，15］、下胚軸切段［15，16］、萌動(dòng)胚［17］、愈傷組織［18］、懸浮培養(yǎng)細(xì)胞［19］等離體材料的轉(zhuǎn)化。目前，根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的椒樣薄荷轉(zhuǎn)化多采用葉盤法，外植體主要為葉片［20-22］。本研究室前期研究發(fā)現(xiàn)，以葉片作為外植體建立耐鹽椒樣薄荷再生體系比較困難，葉片容易褐化且分化效率較低。相比而言，含有腋芽的莖段分化和獲得再生植株較容易，可以用來(lái)作為根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的外植體。本研究利用含芽的椒樣薄荷莖段作為外植體，對(duì)轉(zhuǎn)化所需的根癌農(nóng)桿菌菌液的濃度、轉(zhuǎn)化時(shí)間、共培養(yǎng)時(shí)間和轉(zhuǎn)化液組分等條件進(jìn)行優(yōu)化篩選，建立一種利用耐鹽椒樣薄荷莖段作為外植體的根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)外源基因轉(zhuǎn)化體系，且該轉(zhuǎn)化體系適用于多種植物表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料 本實(shí)驗(yàn)所用椒樣薄荷為本研究室前期篩選的耐鹽椒樣薄荷“科院1號(hào)”的無(wú)菌苗，所用根癌農(nóng)桿菌菌株為GV3101，所用轉(zhuǎn)化載體為植物表達(dá)載體pCAMBIA1304和pB2GW7。

1.1.2 培養(yǎng)基與轉(zhuǎn)化液 本實(shí)驗(yàn)所用的培養(yǎng)基見(jiàn)表1。所用轉(zhuǎn)化液主要成分為MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基、MES、葡萄糖和蔗糖，各成分含量如表2所示。

1.2 方法

1.2.1 椒樣薄荷莖段預(yù)培養(yǎng) 將耐鹽椒樣薄荷無(wú)菌苗去掉莖部葉片，用無(wú)菌剪刀剪成長(zhǎng)度大約為1-2 cm的含腋芽的莖段，用無(wú)菌刀片在腋芽處輕輕劃幾刀，暴露損傷部位，然后將莖段放入預(yù)培養(yǎng)的培養(yǎng)基中，用鋁箔紙包裹避光，（25±3）℃黑暗條件下預(yù)培養(yǎng)3 d。

1.2.2 根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的外源基因轉(zhuǎn)化 將-80℃保存的含有植物表達(dá)載體pCAMBIA1304和pB2GW7的根癌農(nóng)桿菌GV3101按1∶100接種到含有50 mg/L利福平和50 mg/L卡那霉素（pCAMBIA1304）或100 mg/L 壯觀霉素（pB2GW7）的10 mL YEP液體培養(yǎng)基中，30℃，200 r/min過(guò)夜震蕩培養(yǎng)，將活化的菌液再按照1∶50重新接種到含有50 mg/L利福平和50 mg/L卡那霉素或100 mg/L 壯觀霉素的50 mL YEP液體培養(yǎng)基中，30℃，200 r/min震蕩培養(yǎng)16-18 h。將活化的菌液置于滅菌的50 mL離心管中，5 000 r/min離心5 min，收集菌體，用轉(zhuǎn)化液重懸菌體，5 000 r/min離心5 min，洗滌菌體，然后再次用轉(zhuǎn)化液重懸菌體，調(diào)整OD600為0.6-1.0，加入30 mg/L AS（乙酰丁香酮），備用。將預(yù)培養(yǎng)3 d的耐鹽椒樣薄荷莖段置于重懸的根癌農(nóng)桿菌菌液中，抽真空8-15 min，黑暗條件下，30℃，200 r/min震蕩培養(yǎng)30 min。

表1 實(shí)驗(yàn)所用培養(yǎng)基配方

表2 轉(zhuǎn)化液組成成分與含量

1.2.3 轉(zhuǎn)化材料共培養(yǎng)并誘導(dǎo)再生植株產(chǎn)生 將抽真空轉(zhuǎn)化的耐鹽椒樣薄荷莖段從根癌農(nóng)桿菌菌液中取出，用無(wú)菌濾紙吸去表面殘留的菌液，置于共培養(yǎng)培養(yǎng)基上，（25±3）℃ 暗培養(yǎng)3-7 d。然后將耐鹽椒樣薄荷莖段用含有100 mg/mL頭孢霉素的無(wú)菌水清洗3-4次，用無(wú)菌濾紙吸干多余水，轉(zhuǎn)至不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，（25±3）℃，16 h光照/8 h黑暗條件下對(duì)椒樣薄荷莖段進(jìn)行抗生素篩選和不定芽的誘導(dǎo)?？股睾Y選后未發(fā)黃顏色仍為綠色的不定芽轉(zhuǎn)移至生根誘導(dǎo)培養(yǎng)基上誘導(dǎo)生根，產(chǎn)生再生植株。統(tǒng)計(jì)不定芽在抗生素篩選培養(yǎng)基中的存活率。

存活率（%）=存活的不定芽數(shù)目/莖段誘導(dǎo)產(chǎn)生不定芽數(shù)目×100% 1.2.4 轉(zhuǎn)化條件優(yōu)化 本研究利用L9（34）正交試驗(yàn)對(duì)菌液濃度（OD600=0.6、0.8、1.0）、抽真空時(shí)間（8、10、15 min）和共培養(yǎng)時(shí)間（3、5、7 d）進(jìn)行優(yōu)化，篩選出最合適的菌液濃度、抽真空時(shí)間和共培養(yǎng)時(shí)間的組合（表3）。在篩選出最適組合的基礎(chǔ)上，利用不同轉(zhuǎn)化液重懸菌體，篩選最適的轉(zhuǎn)化液組分。每種轉(zhuǎn)化液轉(zhuǎn)化椒樣薄荷莖段30個(gè)，抗生素篩選后計(jì)算不定芽存活率，選擇最適的轉(zhuǎn)化液，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

表3 L9（34）正交試驗(yàn)因素水平表

1.2.5 基因組PCR驗(yàn)證植株陽(yáng)性 兩種表達(dá)載體pCAMBIA1304和pB2GW7利用轉(zhuǎn)化液2和轉(zhuǎn)化液6進(jìn)行轉(zhuǎn)化，經(jīng)抗生素篩選獲得的陽(yáng)性植株，生長(zhǎng)至7-8個(gè)葉時(shí)，從植株上剪取2-3片葉片，用CTAB法提取耐鹽椒樣薄荷基因組DNA。以基因組DNA為模板，利用35S引物（35S-F：TGTAGAGAGAGACTGGTGATTTCAG，35S-R：TATTGGCTAGAGCAGCTTGCCA）進(jìn)行PCR驗(yàn)證。并利用載體質(zhì)粒作為陽(yáng)性對(duì)照，未轉(zhuǎn)化的耐鹽椒樣薄荷基因組DNA作為陰性對(duì)照。

1.2.6 陽(yáng)性植株GUS染色檢測(cè) 植物表達(dá)載體pCAMBIA1304含有GUS報(bào)告基因，可以利用GUS染色技術(shù)檢測(cè)含植物表達(dá)載體pCAMBIA1304的根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化椒樣薄荷后的陽(yáng)性植株。GUS染色方法為：（1）取材，固定：剪取轉(zhuǎn)基因耐鹽椒樣薄荷植株的莖段，加-20℃保存的90%丙酮，沒(méi)過(guò)材料即可，冰浴20 min。（2）漂洗：用漂洗液（0.1 mol/L磷酸鈉緩沖液，2.5 mmol/L K3Fe（CN）6，2.5 mmol/L K4Fe（CN）6）漂洗3次。（3）染色：加入X-Gluc染色液（100 mg X-Gluc用9.58 mLDMSO溶解，溶解液200 μL加入5 mL漂洗液即為染色液），抽真空5min，37℃染色2 h以上。（4）觀察：用70%酒精清洗染色后莖段，用體視顯微鏡觀察GUS染色結(jié)果并拍照。

2 結(jié)果

2.1 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的椒樣薄荷莖段轉(zhuǎn)化

根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的椒樣薄荷轉(zhuǎn)化如圖1所示，椒樣薄荷含芽莖段較易生成不定芽，且生成的不定芽生長(zhǎng)迅速，容易生根獲得陽(yáng)性植株。轉(zhuǎn)化周期大約3個(gè)月，轉(zhuǎn)化效率最高可以達(dá)到8.14%。

圖1 椒樣薄荷莖段轉(zhuǎn)化系統(tǒng)

2.2 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化條件優(yōu)化

利用L（934）正交試驗(yàn)對(duì)轉(zhuǎn)化條件進(jìn)行優(yōu)化篩選，結(jié)果（表4）表明，正交優(yōu)選轉(zhuǎn)化條件為A2B3C1，即使用OD600=0.8的根癌農(nóng)桿菌菌液，抽真空轉(zhuǎn)化15 min，共培養(yǎng)3 d時(shí)轉(zhuǎn)化效果最好，不定芽存活率為21.9%。同時(shí)由正交試驗(yàn)結(jié)果的R值分析發(fā)現(xiàn)，菌液濃度（A）、轉(zhuǎn)化時(shí)間（B）和共培養(yǎng)時(shí)間（C）3個(gè)因素對(duì)轉(zhuǎn)化效果的影響作用表現(xiàn)為（B）>（A）>（C）。

2.3 轉(zhuǎn)化液組分的優(yōu)化

所用轉(zhuǎn)化液的主要組分為MS培養(yǎng)基、MES、蔗糖和葡萄糖，對(duì)各組分的配比進(jìn)行優(yōu)化，共使用9種不同配方的轉(zhuǎn)化液對(duì)椒樣薄荷莖段進(jìn)行轉(zhuǎn)化，結(jié)果（表5）顯示：4種組分都含有的轉(zhuǎn)化液2和6轉(zhuǎn)化后抗生素篩選的存活率分別為16.6±1.86%和19.9±2.20%，轉(zhuǎn)化效果明顯優(yōu)于缺少任何一種組分的轉(zhuǎn)化液。轉(zhuǎn)化液2和6的差別在于MS基本培養(yǎng)基的濃度，二者相比轉(zhuǎn)化液6的轉(zhuǎn)化效果優(yōu)于轉(zhuǎn)化液2的轉(zhuǎn)化效果，說(shuō)明所用的9種轉(zhuǎn)化液中，最適的轉(zhuǎn)化液組分為1/5MS+ 0.5 g/L MES+1%葡萄糖+2%蔗糖，pH 5.4。

表4 L9（34）正交試驗(yàn)結(jié)果

表5 不同轉(zhuǎn)化液對(duì)轉(zhuǎn)化效果的影響

2.4 轉(zhuǎn)基因植株的陽(yáng)性檢測(cè)

兩種表達(dá)載體pCAMBIA1304和pB2GW7，利用不同轉(zhuǎn)化液進(jìn)行轉(zhuǎn)化，植株利用基因組PCR進(jìn)行檢測(cè)分析，結(jié)果如圖2，陽(yáng)性植株和陽(yáng)性對(duì)照（質(zhì)粒）PCR擴(kuò)增得到一條約900 bp的條帶，說(shuō)明外源載體已經(jīng)轉(zhuǎn)入椒樣薄荷基因組中，擴(kuò)增結(jié)果未獲得條帶的株系為抗生素篩選時(shí)出現(xiàn)的假陽(yáng)性。

pCAMBIA1304載體轉(zhuǎn)化的椒樣薄荷莖段，用轉(zhuǎn)化液2轉(zhuǎn)化的莖段分化不定芽數(shù)為198，用抗生素篩選獲得植株數(shù)目為16，利用基因組PCR檢測(cè)陽(yáng)性植株為7株，轉(zhuǎn)化率為3.54%；用轉(zhuǎn)化液6轉(zhuǎn)化的莖段分化不定芽數(shù)目為236，用抗生素篩選獲得植株24株，PCR檢測(cè)陽(yáng)性植株為16株，轉(zhuǎn)化率為6.78%（圖2-A、2-B，表6）。

pB2GW7載體轉(zhuǎn)化的椒樣薄荷莖段，用轉(zhuǎn)化液PCR驗(yàn)證獲得的陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因幼苗進(jìn)行GUS染色鑒定，結(jié)果（圖3）顯示，PCR驗(yàn)證獲得的陽(yáng)性植株GUS染色為藍(lán)色，能夠檢測(cè)到GUS表達(dá)，進(jìn)一步驗(yàn)證了基因組PCR檢測(cè)的正確性。

表6 不同植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化后PCR鑒定獲得的轉(zhuǎn)化率

3 討論

椒樣薄荷作為重要的油料作物，薄荷精油為其最主要產(chǎn)品。利用基因工程和代謝工程提高薄荷精油的含量與品質(zhì)一直是研究的熱點(diǎn)。有研究人員通過(guò)將薄荷醇合成途徑中基因進(jìn)行超表達(dá)來(lái)提高精油含量的方法進(jìn)行了評(píng)價(jià)和分析［23］，該研究中利用椒樣薄荷葉片作為外植體進(jìn)行薄荷醇合成途徑中各基因的轉(zhuǎn)化，將整個(gè)葉片浸泡在根癌農(nóng)桿菌菌液中，滲透轉(zhuǎn)化后切除葉片基部包含葉柄的部分在不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織和不定芽［20，22］。本實(shí)驗(yàn)室篩選獲得的耐鹽椒樣薄荷，因?yàn)槿~片含有大量的多糖，在體外不定芽誘導(dǎo)過(guò)程中很容易褐化，再生頻率低，利用葉片作為外植體進(jìn)行外源基因轉(zhuǎn)化難以實(shí)現(xiàn)。因?yàn)橐秆糠稚M織細(xì)胞全能性較強(qiáng)，易誘導(dǎo)不定芽的產(chǎn)生，本研究選用含芽的莖段作為外植體，通過(guò)根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的外源基因轉(zhuǎn)化，建2轉(zhuǎn)化莖段數(shù)為68，獲得的不定芽數(shù)為98，用抗生素篩選獲得植株數(shù)目為8，利用基因組PCR檢測(cè)陽(yáng)性植株為5株，轉(zhuǎn)化率為5.10%；用轉(zhuǎn)化液6轉(zhuǎn)化的莖段數(shù)為50，分化不定芽數(shù)目為86，用抗生素篩選獲得植株12株，PCR檢測(cè)陽(yáng)性植株為7株，轉(zhuǎn)化率為8.14%（圖2-C、2-D，表6）。

兩種載體轉(zhuǎn)化獲得的轉(zhuǎn)化率存在一定差異，pB2GW7載體轉(zhuǎn)化率略高于pCAMBIA1304載體，但兩者相差不大，都有較高的轉(zhuǎn)化率。兩種轉(zhuǎn)化液介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化效果也存在差異，轉(zhuǎn)化液6的轉(zhuǎn)化率高于轉(zhuǎn)化液2，與上述轉(zhuǎn)化液組分優(yōu)化結(jié)果相符（表6）。

pCAMBIA1304載體中含有GUS報(bào)告基因，對(duì)立了一種新的椒樣薄荷轉(zhuǎn)化體系。該轉(zhuǎn)化體系的轉(zhuǎn)化效率最高可達(dá)到8.14%，明顯高于利用葉片作為外植體的轉(zhuǎn)化效率（1.0%）［20］。

根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的外源基因轉(zhuǎn)化體系中，影響轉(zhuǎn)化效率的因素有很多，其中菌液濃度、轉(zhuǎn)化時(shí)間和共培養(yǎng)時(shí)間是大量外源基因轉(zhuǎn)化的研究中關(guān)注的重要因素［18，24］。本研究也對(duì)這幾個(gè)因素進(jìn)行了優(yōu)化，同時(shí)通過(guò)正交試驗(yàn)對(duì)3個(gè)因素對(duì)轉(zhuǎn)化效果的影響大小進(jìn)行了分析，結(jié)果表明：3個(gè)因素對(duì)轉(zhuǎn)化效果的影響作用表現(xiàn)為轉(zhuǎn)化時(shí)間（B）>菌液濃度（A）>共培養(yǎng)時(shí)間（C）。

轉(zhuǎn)化液也是影響轉(zhuǎn)化效率的重要因素，但目前對(duì)轉(zhuǎn)化液組分的研究較少，僅有少量添加的AS濃度對(duì)轉(zhuǎn)化效率影響的研究，研究表明，AS作為信號(hào)分析可以誘導(dǎo)根癌農(nóng)桿菌的vir基因活化及高效表達(dá)，從而促進(jìn)外源基因整合到植物基因組中［24］。本研究對(duì)含有不同組分的轉(zhuǎn)化液的轉(zhuǎn)化效率進(jìn)行比較分析，結(jié)果表明外源基因轉(zhuǎn)化耐鹽椒樣薄荷的體系中，MS、MES、蔗糖和葡萄糖4種組分俱全的轉(zhuǎn)化液能夠獲得最高的轉(zhuǎn)化效率。其中MS為外植體提供營(yíng)養(yǎng)，是轉(zhuǎn)化液中重要的組分，其濃度也能影響椒樣薄荷莖段的轉(zhuǎn)化效率。MES作為一種生物緩沖劑，能調(diào)節(jié)氫離子濃度的變化，維持轉(zhuǎn)化液的pH［25］，轉(zhuǎn)化液中缺失MES會(huì)降低轉(zhuǎn)化效率，說(shuō)明轉(zhuǎn)化液的PH對(duì)轉(zhuǎn)化效率有重要影響。轉(zhuǎn)化液中的蔗糖和葡萄糖通過(guò)不同比例的搭配為轉(zhuǎn)化提供合適的滲透環(huán)境。

圖2 利用基因組PCR對(duì)pCAMBIA1304和pB2GW7載體轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行陽(yáng)性檢測(cè)

圖3 利用GUS染色對(duì)含pCAMBIA1304載體的轉(zhuǎn)基因植株陽(yáng)性進(jìn)行檢測(cè)

4 結(jié)論

利用椒樣薄荷莖段作為外植體，通過(guò)對(duì)菌液濃度、轉(zhuǎn)化時(shí)間、共培養(yǎng)時(shí)間和轉(zhuǎn)化液組分的優(yōu)化，建立了一種根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的耐鹽椒樣薄荷莖段轉(zhuǎn)化體系。該轉(zhuǎn)化體系最優(yōu)轉(zhuǎn)化條件為：菌液濃度為OD600=0.8，抽真空時(shí)間為15 min，共培養(yǎng)時(shí)間為3 d；最適的轉(zhuǎn)化液為：1/5MS+ 0.5 g/L MES+1%葡萄糖+2%蔗糖，pH 5.4。該體系適用于多種植物表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化，容易獲得再生植株，可以運(yùn)用于椒樣薄荷基因轉(zhuǎn)化，為利用基因工程提高椒樣薄荷精油含量與品質(zhì)提供一種新的轉(zhuǎn)化方法。

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（責(zé)任編輯 朱琳峰）

An Efficient Transformation of Salinity-resistant Peppermint Stem Mediated with Agrobacterium tumefaciens

ZHAO Zhong-juan WEI Yan-li LI Ji-shun WANG Yi-lian YANG He-tong
（Ecology Institute of Shandong Academy of Sciences，Jinan 250014）

Transgenic technology is an important means to improve the essential yield and quality of peppermint（Mentha piperita L.）oil. An Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation using bud peppermint stem was established，in order to solve the problems in adventitious bud induction of salinity-resistant peppermint leave，such as easy browning and difficult differentiation. The orthogonal test was carried out to screen the optimal concentration of A. tumefaciens，transformation time and co-culture time. The results showed that the effect of the three factors on transformation displayed as the transformation time（B）> bacterial concentration（A）> co-culture time（C）. The bacterial concentration OD600= 0.8，the transformation time 15 min and the co-culture time 3 d proved to be the optimal transformation conditions. The optimal composition of transformants was screened to be 1/5MS + 0.5 g/L MES（2-（N-morpholino）ethanesulfonic acid）+ 1% glucose + 2% sucrose and PH 5.4. The transformation was conducted using different plant expression vectors，and the positive plants were detected by genomic PCR and GUS staining. And the results revealed that this transformation system was suitable for the transformation of many plant expression vectors，and the regenerated plants were easily obtained. This provides a new method and system for gene transformation of salinity-resistant peppermint.

peppermint；stem；Agrobacterium tumefaciens；plant expression vector；genomic PCR；GUS staining

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016-1199

2017-01-07

山東省科技重大專項(xiàng)（重大關(guān)鍵技術(shù)）項(xiàng)目（2015ZDJS03002），山東省重點(diǎn)研發(fā)項(xiàng)目（2015GNC111015），楊合同黃河三角洲學(xué)者項(xiàng)目，山東省農(nóng)業(yè)良種工程項(xiàng)目

趙忠娟，女，博士，研究方向：耐鹽植物選育；E-mial：zzjfrances@aliyun.com

楊合同，男，博士，研究員，研究方向：耐鹽植物與應(yīng)用微生物；E-mial：yanght@sdas.org