程新 李昆太 黃林

（江西農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，南昌 330045）

一株枯草芽孢桿菌的生長(zhǎng)特性及抑藻效果研究

程新 李昆太 黃林

（江西農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，南昌 330045）

溶藻微生物能引起水華藍(lán)藻的快速消亡，從而達(dá)到控制水華之目的。為了探討枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）對(duì)銅綠微囊藻（Microcystis aeruginosa）及小球藻（Chlorell）的抑制效果，在實(shí)驗(yàn)室條件下研究了枯草芽孢桿菌對(duì)兩種藻類生長(zhǎng)的影響、抑制藻類生長(zhǎng)的作用方式以及發(fā)酵液處理下銅綠微囊藻丙二醛（MDA）及谷胱甘肽（GSH）含量、超氧化物歧化酶（SOD）及過氧化氫酶（CAT）活性。試驗(yàn)結(jié)果表明，篩選出的菌株具有較好的環(huán)境適應(yīng)性和抑制藻類生長(zhǎng)的能力，其抑制效果是通過分泌胞外物質(zhì)實(shí)現(xiàn)的。經(jīng)過枯草芽孢桿菌處理后，銅綠微囊藻的葉綠素a及藻體蛋白含量均顯著低于對(duì)照組，而胞內(nèi)MDA及GSH含量顯著升高，SOD及CAT活性也有增高的趨勢(shì)。

枯草芽孢桿菌；藻類；抑制；生長(zhǎng)特性

水體的富營(yíng)養(yǎng)化已成為世界各地水污染治理中普遍遇到的環(huán)境問題， 而因此產(chǎn)生的藻類過度繁殖進(jìn)而引起水華是導(dǎo)致水環(huán)境惡化的關(guān)鍵因子之一［1］。除了造成水體生物化學(xué)性質(zhì)發(fā)生改變和水體功能下降之外，部分藻類還會(huì)向水體釋放的有毒次生代謝物質(zhì)，嚴(yán)重危害到人類和動(dòng)物的健康［2］。如何控制和消除富營(yíng)養(yǎng)化水體中有害藻類的暴發(fā)性增長(zhǎng)是生態(tài)學(xué)和環(huán)境科學(xué)領(lǐng)域的重要研究課題。

與化學(xué)和物理控藻方法相比，生物控藻技術(shù)具有成本低、持續(xù)周期長(zhǎng)等特點(diǎn)，近年來成為研究的熱點(diǎn)［3］，已有大量研究表明采用溶藻細(xì)菌、水生植物分泌的化感物質(zhì)、食藻微小動(dòng)物和魚類等生物控制技術(shù)防治藻類爆發(fā)，都具有較好的效果［4］。但綜合現(xiàn)有的研究報(bào)道來看，篩選得到的溶藻生物除藻能力低、生長(zhǎng)速度慢、治理成本高等缺點(diǎn)仍然是制約生物除藻的關(guān)鍵因素［5］，而枯草芽孢桿菌由于具備菌體密度高、培養(yǎng)及運(yùn)輸方便等優(yōu)點(diǎn)，在水體污染治理方面具有巨大的應(yīng)用潛力［6］。本研究以銅綠微囊藻（Microcystis aeruginosa）和小球藻（Chlorella）為目標(biāo)藻體，篩選對(duì)其具有較好抑制作用的枯草芽孢桿菌，并對(duì)其生長(zhǎng)特性和溶藻方式進(jìn)行研究，以期為富營(yíng)養(yǎng)化水體處理及生物控藻提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、銅綠微囊藻（Microcystis aeruginosa）及小球藻（Chlorella）均為課題組自行保存。

1.1.2 培養(yǎng)基 枯草芽孢桿菌培養(yǎng)基采用LB固體培養(yǎng)基［7］，115℃滅菌25 min；藻種培養(yǎng)采用BG11培養(yǎng)基［8］，115℃滅菌25 min。

1.2 方法

1.2.1 溶藻菌的篩選 將銅綠微囊藻及小球藻菌種接至BG11培養(yǎng)基，課題組自行保存的枯草芽孢桿菌采用LB培養(yǎng)基活化8 h（菌細(xì)胞濃度大約為1.0×108cells/mL）后按1∶9的比例接入BG11培養(yǎng)基，28℃，光照4.8±0.2 klx（日光燈源）培養(yǎng)，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照，培養(yǎng)4 d 后分別測(cè)定葉綠素a 濃度和藻體蛋白含量，計(jì)算溶藻菌對(duì)葉綠素a及藻體蛋白合成的抑制率。葉綠素a測(cè)定采用丙酮提取法，具體測(cè)定及計(jì)算方法見參考文獻(xiàn)［9］。蛋白質(zhì)含量測(cè)定參照文獻(xiàn)［5］進(jìn)行，略有改動(dòng)。培養(yǎng)4 d后，分別取培養(yǎng)液2 000 r/min 離心10 min，用無菌水進(jìn)行洗滌，重復(fù)上述操作4次，最終獲得藻泥，然后用細(xì)胞破碎儀對(duì)藻泥進(jìn)行細(xì)胞破碎，破碎液在4℃下10 000 r/min離心15 min，收集上清液，采用紫外線測(cè)定其中蛋白質(zhì)濃度，測(cè)定波長(zhǎng)為280 nm和260 nm，蛋白質(zhì)含量（g/L）計(jì)算公式如下：蛋白質(zhì)含量（g/L）=1.55×OD280-0.76×OD260。

1.2.2 菌株及共培養(yǎng)生長(zhǎng)曲線測(cè)定 將保存在固體培養(yǎng)基上的5#菌株接種到裝有15 mL滅菌LB液體培養(yǎng)基試管中，經(jīng)過8 h 培養(yǎng)活化后用無菌移液槍按1.0%的接種量接種到裝有100 mL LB液體培養(yǎng)基的三角瓶中，于28℃，150 r/min進(jìn)行振蕩培養(yǎng)，定時(shí)取樣，在721分光光度計(jì)上測(cè)OD600值。共培養(yǎng)生長(zhǎng)曲線方法如下：將生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的5#菌培養(yǎng)液

（菌細(xì)胞濃度大約為1.0×108cells/mL），按體積比1 :9 加入到藻培養(yǎng)液中進(jìn)行共培養(yǎng)。菌藻共培養(yǎng)條件為28℃，光照4.8±0.2 klx（日光燈源），每隔48 h取藻菌培養(yǎng)液，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)數(shù)方法采用直接計(jì)數(shù)法，以藻單獨(dú)培養(yǎng)液做對(duì)照。藻細(xì)胞計(jì)數(shù)參照文獻(xiàn)進(jìn)行，將藻培養(yǎng)液用力振蕩混勻，然后于無菌操作臺(tái)取1 mL加入到2.5 mL EP 管中，再加入1滴KI-I2溶液，染色15 min。每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)平行，將染色后液體滴入藻細(xì)胞計(jì)數(shù)板，于光學(xué)顯微鏡（100×）觀察并計(jì)數(shù)，每樣計(jì)數(shù)10次，計(jì)算平均數(shù)。1.2.3 環(huán)境條件對(duì)溶藻菌生長(zhǎng)的影響 設(shè)置不同溫度、pH 值及鹽度條件研究5#菌株對(duì)環(huán)境條件的耐受能力。采用LB 液體培養(yǎng)基于28℃、150 r/min條件下進(jìn)行振蕩培養(yǎng)，24 h后測(cè)定發(fā)酵液OD600值。

1.2.4 銨及磷酸鹽對(duì)溶藻菌生長(zhǎng)的影響 向基礎(chǔ)LB培養(yǎng)基中添加不同濃度的NH4Cl及KH2PO4，28℃，150 r/min進(jìn)行振蕩培養(yǎng)，24 h后測(cè)定發(fā)酵液OD600值。1.2.5 丙二醛（MDA）、谷胱甘肽（GSH）含量及相關(guān)酶活測(cè)定 藻細(xì)胞裂解液的制備同1.2.1。各種物質(zhì)含量及酶活測(cè)定均采用南京建成生物工程公司生產(chǎn)的測(cè)定試劑盒進(jìn)行，方法參照說明書。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)分析 除特別說明外，每個(gè)試驗(yàn)均設(shè)置3個(gè)對(duì)照。數(shù)據(jù)處理及繪圖采用ORIGIN 8.1進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 枯草芽孢桿菌對(duì)藻葉綠素a及藻體蛋白合成的抑制

以課題組保存的5株枯草芽孢桿菌為篩選對(duì)象，研究其生長(zhǎng)性能及其對(duì)兩種藻類葉綠素a及藻體蛋白合成的抑制效果，結(jié)果（圖1）顯示，5株枯草芽孢桿菌對(duì)兩種藻類都具有一定的抑制效果，其中以對(duì)銅綠微囊藻的抑制效果較好。5#菌株對(duì)兩種藻類葉綠素a的抑制率最高，而1#和5#菌株對(duì)兩種藻類蛋白抑制率最佳。從生長(zhǎng)能力來看，2#菌株的生長(zhǎng)速度最快，24 h后OD600可達(dá)2.8以上，而5#和1#菌株的生長(zhǎng)能力次之。綜上，選擇枯草芽孢桿菌5#作為代表菌株來進(jìn)行后續(xù)研究。

2.2 5#菌株的生長(zhǎng)曲線及其對(duì)藻生長(zhǎng)的影響

分別研究了5#菌株的生長(zhǎng)曲線及其對(duì)藻類生長(zhǎng)的影響，結(jié)果如圖2所示。從圖2-A可以看出，5#菌株的遲緩期較短，而對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期繁殖速度較快，當(dāng)培養(yǎng)到15 h左右時(shí)，5#菌株的生長(zhǎng)量達(dá)到最大，經(jīng)平板計(jì)數(shù)其最大生物量可達(dá)1.0×1010cells/mL以上，隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)菌體生物量略有降低。從圖2-B中可以看出，5#菌株與兩種藻類共培養(yǎng)過程中，銅綠微囊藻和小球藻的生長(zhǎng)均受到一定的抑制，其中以銅綠微囊藻所受影響最為顯著。

2.3 環(huán)境因子對(duì)枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)的影響

5#菌株在不同溫度、pH及NaCl濃度條件下的生長(zhǎng)情況（圖3）顯示，其在低溫條件下生長(zhǎng)會(huì)受到一定的抑制，而在30-37℃條件下生長(zhǎng)最為良好。從酸堿適應(yīng)情況來看，該菌株在中性條件下生長(zhǎng)最為良好，過酸或過堿的條件均會(huì)對(duì)其生長(zhǎng) 造成不利影響，而高濃度的鹽也會(huì)對(duì)其生長(zhǎng)造成不利的影響。

2.4 銨及磷酸鹽對(duì)枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)的影響

從圖4的結(jié)果可以看出，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基基礎(chǔ)上適當(dāng)增加氮、磷的含量，能夠提高5#菌株的生長(zhǎng)能力，但當(dāng)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)繼續(xù)升高時(shí)，菌體的生長(zhǎng)能力受到一定的抑制。

2.5 枯草芽孢桿菌溶藻方式的研究

不同處理?xiàng)l件下的發(fā)酵液對(duì)藻類生長(zhǎng)的抑制效果（圖5）可以看出，去除發(fā)酵液后重新懸浮的單一細(xì)胞對(duì)于銅綠微囊藻和小球藻只有很小的抑制能力，而無菌濾 液的抑制能力則高達(dá)60%以上，與未過濾的原菌株菌液的溶藻活性相當(dāng)，這表明菌株的溶藻活性主要來源于發(fā)酵后的濾液，并不需要細(xì)菌細(xì)胞與藻細(xì)胞直接接觸，即菌株對(duì)于藻類的抑制效應(yīng)并不是通過直接溶藻方式，而是通過產(chǎn)生溶藻活性物質(zhì)到濾液中以間接溶藻方式實(shí)現(xiàn)的。

圖1 不同菌株的生長(zhǎng)能力（A）及其對(duì)葉綠素a（B）及藻體蛋白（C）的去除率

圖2 5#菌株的生長(zhǎng)曲線（A）及其對(duì)藻類生長(zhǎng)的影響（B）

2.6 枯草芽孢桿菌對(duì)藻細(xì)胞抗氧化系統(tǒng)的影響

選擇銅綠微囊藻為目標(biāo)藻種，研究在細(xì)菌溶藻過程中細(xì)胞的抗氧化系統(tǒng)（MDA、GSH、SOD和CAT）含量（活性）的變化，結(jié)果如圖6所示。加入溶藻細(xì)菌后，銅綠微囊藻的MDA含量從第1天便開始上升，這可能與此時(shí)藻細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)受到嚴(yán)重?fù)p傷有關(guān)，而對(duì)照組MDA的測(cè)定值一直維持在較低水平，說明其脂膜過氧化水平很低。而GSH含量、SOD及CAT活性的變化也有類似的趨勢(shì)。說明加入溶藻細(xì)菌后，藻細(xì)胞受到氧化脅迫，其抗氧化系統(tǒng)啟動(dòng)以保護(hù)自身細(xì)胞不受損害。

圖3 溫度（A）、pH（B）及NaCl濃度（C）對(duì)5#菌株生長(zhǎng)的影響

圖4（A）及（B）對(duì)5#菌株生長(zhǎng)的影響

圖5 菌株5#對(duì)藻類生長(zhǎng)的影響

3 討論

工農(nóng)業(yè)和生活污染排放等因素所導(dǎo)致的水體富營(yíng)養(yǎng)化和浮游藻類污染目前有日益加劇的趨勢(shì)［10］，目前已引起研究人員的廣泛關(guān)注［11］。通過溶藻病毒、溶藻細(xì)菌、溶藻真菌、放線菌等微生物來控制藻體的水華已成為近年來研究的熱點(diǎn)，其中最為常見的是利用溶藻細(xì)菌的作用來抑制藻類生長(zhǎng)［12］。惡臭假單胞菌（Pseudomonas putida）［13］、熒光假單胞菌（Pseudomonas. fluorescens）、噬胞菌（Cytophaga）等微生物均對(duì)藻類有一定抑制作用［14］，但這些從水體等環(huán)境中直接篩選得到的微生物雖然有較好的溶藻特性，但普遍存在生長(zhǎng)速度緩慢、環(huán)境適應(yīng)性差等缺點(diǎn)，且部分菌株為條件致病菌，在水體治理領(lǐng)域容易造成二次污染，不能大規(guī)模使用?？莶菅挎邨U菌在自然界廣泛存在，具有生產(chǎn)成本低、生長(zhǎng)速度快、易形成芽孢方便運(yùn)輸?shù)葍?yōu)點(diǎn)，在水質(zhì)凈化、動(dòng)物飼料添加等方面有廣泛的應(yīng)用。尤為重要的是，枯草芽孢桿菌具有良好的生物安全性，不會(huì)造成環(huán)境的二次污染，因此我國(guó)《飼料添加劑品種目錄（2013）》及美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局《可直接飼用微生物目錄（1989）》中均將其列入其中［15］。本研究以課題組保存的枯草芽孢桿菌為篩選對(duì)象，不僅考慮其溶藻特性，同時(shí)兼顧生物安全性和應(yīng)用潛力。

目前利用微生物進(jìn)行藻類控制的研究可以分為兩大類型，一是利用微生物的次級(jí)代謝產(chǎn)物抑制藻類生長(zhǎng)，目前已有較多報(bào)道［16］。張化俊等［14］發(fā)現(xiàn)溶藻細(xì)菌BS01所產(chǎn)得二異丁氧基苯基胺能夠通過引起藻細(xì)胞內(nèi)部氧化損傷的方式引起藻細(xì)胞的死亡，同時(shí)該化合物僅針對(duì)少數(shù)幾種藻類具有殺藻效果，在赤潮的治理方面具有較好的應(yīng)用前景；孔赟等［17］發(fā)現(xiàn)橄欖網(wǎng)狀鏈霉菌SG-001的活性物質(zhì)能夠強(qiáng)烈抑制銅綠微囊藻的生長(zhǎng)，但對(duì)小球藻的生長(zhǎng)具有明顯的促進(jìn)作用；Sakata等［18］從日本海域中分離得到1株P(guān)seudomonas sp. C55a-2，對(duì)角毛藻、海洋卡盾藻等藻類均具有較好的抑制作用，經(jīng)過鑒定其主要活性成分為2，3-二氫吲哚二酮（2，3-indolinedione）。另外一類則是研究直接添加菌體對(duì)藻類的抑制效果［19，20］。從使用的角度來說，直接施用發(fā)酵菌體顯然成本更低，更具備規(guī)模化使用的潛力。

圖6 菌株5#對(duì)銅綠微囊藻MDA（A）、GSH（B）含量及CAT（C）、SOD（D）活性的影響

枯草芽孢桿菌在藻類控制等領(lǐng)域的研究尚處于起步階段［21-24］，本研究所得菌株不僅具有較好的抑制藻類生長(zhǎng)特性，同時(shí)在溫度、pH及鹽濃度等方面具有較好的環(huán)境適應(yīng)性，特別是在中溫（30-37℃）、pH接近中性的水體中生長(zhǎng)性能最為良好，可以考慮以直投式菌劑的形式應(yīng)用于富營(yíng)養(yǎng)化的水體，具備一定的開發(fā)的潛力。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)篩選得到一株對(duì)銅綠微囊藻和小球藻均具有較好抑制作用的枯草芽孢桿菌，其代謝產(chǎn)物對(duì)兩種藻類均有較好的抑制作用，且菌株具有較好的環(huán)境適應(yīng)性。將枯草芽孢桿菌與銅綠微囊藻共培養(yǎng)后，可引起藻體抗氧化系統(tǒng)的應(yīng)激反應(yīng)。

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（責(zé)任編輯 狄艷紅）

Research on Growth Characteristics and Algicidal Effects of Bacillus subtilis

CHE NG Xin LI Kun-tai HUANG Lin
（College of Biological Science and Engineering，Jiangxi Agricultural University，Nanchang 330045）

Algicidal microorganisms rapidly kill cyanobacteria，and subseq uently the purpose of controlling algal bloom in water bodies is achieved. To investigate the inhibition of Bacillus subtilis against Microcystis aeruginosa and Chlorell，the Bacillus subtilis cultures were used to study its inhibition and mode of action against these two kinds of algae. The MDA，GSH，SOD and CAT activity in M. aeruginosa when cultured with B. subtilis were measured. The results showed that B. subtilis had a solid adaptability to environment and inhibited the growth of the algae by secreting extracellular substances. The chlorophyll a and protein contents of M. aeruginosa in treated groups were significantly lower than that in the control group，while the MDA and GSH contents as well as the SOD and CAT activity increased obviously when M. aeruginosa was cultured with B. Subtilis.

Bacillus subtilis；algae；inhibition；growth characteristics

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0013

2017-01-16

江西省科技支撐計(jì)劃（20111BBF60031），江西省教育廳科技項(xiàng)目（GJJ11089）

程新，男，博士，副教授，研究方向：資源微生物學(xué)；E-mail：jx_chengxin@hotmail.com

李昆太，男，博士，教授，研究方向：微生物次級(jí)代謝；E-mail：atai78@sina.com