李佳慧袁丹陸建明楊麗濤李楊瑞邢永秀

（1. 廣西大學農學院 亞熱帶農業(yè)生物資源保護與利用國家重點實驗室，南寧 530004；2. 中國農業(yè)科學院甘蔗研究中心 農業(yè)部廣西甘蔗生物技術與遺傳改良重點實驗室 廣西農業(yè)科學院 廣西甘蔗遺傳改良重點實驗室，南寧 530007）

氮肥對甘蔗葉片內生固氮菌nifH基因表達的影響

李佳慧1袁丹1陸建明1楊麗濤1李楊瑞2邢永秀1

（1. 廣西大學農學院 亞熱帶農業(yè)生物資源保護與利用國家重點實驗室，南寧 530004；2. 中國農業(yè)科學院甘蔗研究中心 農業(yè)部廣西甘蔗生物技術與遺傳改良重點實驗室 廣西農業(yè)科學院 廣西甘蔗遺傳改良重點實驗室，南寧 530007）

為了探究氮肥對甘蔗葉片內生固氮菌nifH基因表達的影響，從RNA和蛋白質水平，采用RT-PCR和Western blot等技術分析施氮和不施氮處理下3個甘蔗品種葉片中nifH基因表達的差異性及對固氮酶相對表達量的影響。結果表明，在大田生長的甘蔗，在施氮肥和對照處理的葉片內，都可檢測到固氮菌nifH基因在基因水平和蛋白質水平的表達。施氮處理會抑制或降低葉片內固氮菌的nifH基因的表達，但有利于nifH在蛋白質水平的表達，3個甘蔗品種內生固氮菌nifH基因的相對表達量都是施氮處理下較高，尤其是甘蔗品種ROC22，處理與對照間達到了顯著差異。

甘蔗；內生固氮菌；固氮酶；nifH基因

甘蔗是禾本科植物中最高大的作物之一，生長周期長，施肥量大。在甘蔗的各項農資投入中，化肥尤其是氮肥所占比重大，對甘蔗產量的影響也最大。生物固氮是地球生態(tài)系統(tǒng)固氮作用的最主要途徑之一，每年的全球總固氮量中約60%以上來是自于生物固氮［1］。通過生物固氮作用固定的氮素能與有機物結合且不易流失，能被生物完全利用而不會對環(huán)境造成污染。因此研究生物固氮在改善生態(tài)平衡和促進農業(yè)可持續(xù)發(fā)展上具有重要意義。

D?bereiner實驗室于1958年首次從熱帶甘蔗的根際分離到固氮細菌，證實了甘蔗存在生物固氮潛能［2］。內生固氮菌位于植物體內部，在植物組織內生活而不引起植物病癥或者傷害，在植物組織內部建立聯(lián)合固氮體系進行固氮作用。內生固氮菌存在最多的部位是根皮層細胞間、葉肉和葉薄壁組織、維管組織中的木質部，根（根毛）表皮細胞內也是內生固氮菌分布較多的部位［2，3］。國內對甘蔗內生固氮菌的研究越來越多，邢永秀等［4］從甘蔗體內分離培養(yǎng)了一批內生固氮菌；魏春燕等［5］用熒光蛋白標記法研究內生固氮菌的定殖規(guī)律；楊仲榮等［6］用15N標記法測定甘蔗葉片生物固氮量；林麗［7］和桂意云等［8］用乙炔還原法測定甘蔗不同器官的固氮酶活性。nifH基因是編碼固氮酶鐵蛋白的基因，是所有固氮微生物含有的最保守的功能基因，在進化上與16S RNA有較高的相關性［9-12］。研究表明可以直接檢測nifH基因的多樣性來檢測植物內生固氮菌的多樣性［11，13］。Ando等［14］報道，在工藝成熟期的甘蔗體內存在 Bradyrhizobium sp.、Klebsiella sp.和Serratia sp. 等固氮微生物。Thaweenut等［15］在甘蔗移栽后的59 d和100 d，應用RT-PCR方法在甘蔗的根部和莖部都成功檢測到nifH基因的表達。

雖然甘蔗生物固氮研究取得了很大進展，但是原位檢測固氮基因表達的研究還較少，尤其是以大田甘蔗葉片為材料研究nifH序列多樣性及固氮酶相對表達量的報道還未見有報道。本研究以大田甘蔗葉片為材料，用RT-PCR方法及Western blot技術分析氮肥對甘蔗內生固氮菌nifH的基因表達及相對表達量的影響，以期探明氮肥及甘蔗基因型對甘蔗內生固氮菌nifH表達的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗樣品種植在廣西大學農學院試驗田，為第一年宿根蔗，上季新植蔗砍收的時間是2016年3月12日。試驗的3個甘蔗品種分別為GXB9、ROC22和GT11。試驗地土壤基本性質如下：土壤質地為赤紅壤，pH6.83、有機質含量4.97 g/kg、全氮含量0.44 g/kg、全磷含量0.45 g/kg、全鉀含量 10.25 g/kg、水解性氮含量21.76 mg/kg、速效磷含量14.92 mg/kg、速效鉀含量64 mg/kg［16］。大腸桿菌DH5α購與北京全式金生物公司，pMD18-T載體試劑盒及反轉錄試劑盒均購自 TaKaRa寶生物工程有限公司，TRIzon總RNA提取試劑盒和nifH抗體購于Agrisera 公司，其他抗體及EsTaqMix均購于康為世紀生物有限公司，引物合成及測序由上海生工完成。

1.2 方法

1.2.1 甘蔗樣品處理及葉片采集 施氮處理（N-），施用300 kg/ha的尿素（含N 46%，廣西河池化工股份有限公司生產），同時施用適量鉀肥和磷肥；不施氮處理（W-），不施氮肥只施適量鉀肥和磷肥。施肥時間是2016年4月20日。于2016年7月18日上午8點到11點采集試驗材料。每個樣品隨機選取6張葉片（+1葉），用滅菌的剪刀減去葉片最下方和最上方部位，大概留2/3的葉片，先用蒸餾水沖洗一次，用75%的酒精擦拭一次，再用滅菌水沖洗兩次，用滅菌的濾紙擦干，剪碎用錫箔紙包起來放入液氮里，-80℃保存，用于RNA和蛋白質的提取。

1.2.2 甘蔗葉片總RNA提取及反轉錄 采用康為世紀TRIzon總RNA提取試劑盒（CW0580）提取葉片總RNA，用0.8%的瓊脂糖凝膠檢測提取RNA的質量，用核酸濃度測定儀測定濃度。提取的RNA按照TaKaRa公司的PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒（DRR820A）說明書反轉錄成cDNA，保存在-80℃。

1.2.3 甘蔗葉片總蛋白質的提取 用酚抽提法提取甘蔗葉片總蛋白質，考馬斯亮藍法測定蛋白濃度［17］。取25 μg蛋白用12.5%的SDS-PAGE配體膠檢測蛋白質，剩余的蛋白保存在-80℃，裂解的蛋白液體保存在-20℃。

1.2.4 nifH基因的PCR檢測 以cDNA為模板，用PolyF和PloyR引物［18］進行第一輪PCR擴增；反應體系（25 μL）包含12.5 μL EsTaqMix（康為世紀，CW0939），9.5 μL滅菌水，10 μmol/L上下游引物各1 μL和1 μL cDNA模板；反應程序為：94℃ 5 min，94℃ 45 s，55℃ 60 s，72℃ 60 s，30個循環(huán)，最后72℃延伸5 min。nifH-Rev（ACCCGCCTGATCCTGCACGCCAAGG）和nifH-For（ACGATGTAGATTTCCTGGGCC TTGTT）［19］作為第二輪擴增引物，反應體系及反應程序同上。PCR產物用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，正對照為本實驗從ROC22中分離到的內生固氮菌DX120E。

1.2.5 nifH基因的克隆測序及序列比對 將nifH的PCR反應產物進行PCR產物純化，純化產物連接到PMD-18T載體上，轉進大腸桿菌中。通過藍白斑篩選初篩，使用M13-47和M13-48引物檢測陽性克隆。施氮和不施氮處理下3個甘蔗品種共6個樣品，每個樣品挑取10個陽性克隆送去測序（上海生工生物公司）。將測序結果用NCBI Blast比對檢測是否為nifH基因，選取典型克隆用NTI軟件對所得的nifH基因進行序列比對。

1.2.6 nifH進化樹構建 將測序結果于 NCBI上進行 Blast比對分析，獲取相近典型菌株序列。然后利用Clustal X 1.83和Mega5.0中的鄰接法（Neighbor-Joining）構建固氮微生物nifH基因的發(fā)育樹，其中的遺傳距離用Tamura_Nei 公式計算，分支長度代表了分歧程度，各支上的數字是1 000次bootstrap 重抽樣分析的支持百分比。

1.2.7 nifH蛋白的Western blot 檢測 取20 μg蛋白質，跑SDS-PAGE電泳將蛋白質分離，然后采用濕轉的轉模方法將蛋白質轉移至硝酸纖維膜上（轉膜條件40 V，90 min）。然后將膜放到含有5%脫脂牛奶的0.01 mol PBST中室溫封閉2 h。將膜從封閉液中取出，用PBST清洗3次，每次5 min，然后轉入10 ml含0.1%脫脂牛奶的PBST中，按1∶1 000的比例加入10 μL的nifH鐵蛋白一抗（Agrisera，AS01021A），放到搖床上輕搖，室溫下孵育2 h。將敷完一抗的膜在PBST中清洗3次，每次5 min，然后轉入含0.5%脫脂牛奶的PBST溶液中，按1∶ 5 000比例加入二抗（康為世紀，CW0205），室溫下封閉1.5 h。最后再用PBST清洗3次，每次5 min，將配置好的ECL顯色液滴加到膜上，在成像儀系統(tǒng)下觀察蛋白的表達。

1.2.8 氮肥對甘蔗葉片固氮酶鐵蛋白相對表達量的影響 用軟件計算nifH蛋白與內參蛋白的灰度值大小，然后用nifH蛋白的灰度值比上其內參蛋白的灰度值，得到nifH蛋白的相對表達量。每個樣品重復2次，取平均值。本試驗用的內參蛋白為β-actin蛋白，內參蛋白的一抗是鼠抗β-actin的單克隆抗體（康為世紀，CW0264M），二抗是山羊抗鼠單克隆抗體（康為世紀，CW0102A）。

2 結果

2.1 甘蔗葉片內生固氮菌nifH基因表達的PCR檢測

本實驗以甘蔗葉片的cDNA為模板，進行PCR檢測，結果（圖1、圖2）發(fā)現(xiàn)不施氮處理和施氮處理的各個甘蔗品種葉片樣品中均可擴增出nifH條帶，檢測到nifH表達，證實自然生長狀態(tài)下的甘蔗葉片中存在的內生固氮菌表達了nifH基因（目的片段的大小約314 bp是根據參考文獻中前人擴增結果判斷）。

圖1 不施氮處理甘蔗葉片nifH基因的PCR檢測

圖2 施氮處理甘蔗葉片nifH基因的PCR檢測

2.2 氮肥對甘蔗葉片內生固氮菌nifH基因表達的影響

nifH基因克隆測序的結果在NCBI上進行Blast，結果顯示，從同一個樣品中得到的10個克隆nifH序列幾乎完全相同，但不同樣品間表現(xiàn)不一樣（表1）。對克隆出的nifH序列用NTI序列比對軟件進行序列比對的結果（圖3-圖5）發(fā)現(xiàn)：對于施氮和不施氮處理，從3個甘蔗品種葉片中克隆的nifH基因序列均存在差異，除了從GT11克隆的nifH基因序列差異相對較小外，另外兩個品種克隆的nifH基因序列差異很大，施用氮肥改變了甘蔗葉片內生固氮菌的nifH序列部分堿基。同一個甘蔗品種施氮和不施氮處理下甘蔗葉片中存在的內生固氮菌種類有差別。在施氮條件下，3個甘蔗品種中克隆到的nifH序列幾乎不存在差異（圖6）；不施氮處理下從3個甘蔗品種中克隆到的nifH序列存在差異（圖7），說明施用氮肥可能減少了葉片中發(fā)生固氮作用的內生固氮菌的種類，甘蔗葉片中內生固氮菌存在的差異與品種有關。

表1 不同樣品中擴增出來的nifH序列 Blast 結果

圖3 GT11在施氮和不施氮處理的nifH序列比對

2.3 nifH基因的系統(tǒng)發(fā)育分析

nifH基因的系統(tǒng)進化關系表明（圖8），克隆出的內生固氮菌屬于變形菌門固氮菌，可以分為兩類。N-GXB9、N-ROC22、N-GT11和W-GT11聚為一類；第二類包括W-GXB9和W-ROC22。N-G-XB9和N-ROC22與β-變形菌門的伯克氏菌目（Burkholderiales）親緣性較近，而N-GT11與α-變形菌亞門親緣性較近。對于不施氮處理的樣品，W-GT11屬于為未培養(yǎng)細菌，W-GXB9與r-變形菌門腸桿菌科固氮菌較近，W-GXB9與α-變形菌亞門的根瘤菌較近。

圖4 ROC22在施氮和不施氮處理的nifH序列比對

圖5 GXB9在施氮和不施氮處理的nifH序列比對

圖6 施氮處理不同甘蔗品種的nifH序列比對

圖7 不施氮處理不同甘蔗品種的nifH序列比對

圖8 甘蔗葉片內生固氮菌nifH基因的系統(tǒng)發(fā)育樹（臨近法）

2.4 nifH基因在蛋白質水平的檢測

提取葉片的總蛋白質，用nifH的多克隆抗體特異性地識別nifH鐵蛋白的特性，Western blot檢測甘蔗葉片中nifH基因的表達。結果（圖9）顯示，3個甘蔗品種的葉片部位都有nifH蛋白表達，證明了在大田中生長的甘蔗葉片中確實有固氮菌進行了固氮酶的表達，甘蔗葉片具有固氮能力。施氮處理的3個品種的葉片也檢測到了固氮酶的表達（圖10）。

圖9 不施氮處理甘蔗葉片內生固氮菌nifH鐵蛋白檢測

圖10 施氮處理甘蔗葉片內生固氮菌nifH鐵蛋白檢測

2.5 氮肥對甘蔗葉片固氮酶相對含量的影響

以施氮和不施氮處理3個甘蔗品種的葉片為材料，進行固氮酶nifH鐵蛋白的相對表達量的檢測，結果見圖11和圖12。3個甘蔗品種葉片中的固氮酶的相對表達量均為施氮條件下較高，說明施氮處理下葉片中內生固氮酶的含量可能更高。品種間相比較，ROC22葉片中的固氮酶相對表達量，對照與處理間達到了顯著差異。

圖11 施氮和不施氮處理下3個甘蔗品種nifH蛋白的表達

圖12 甘蔗葉片固氮酶nifH鐵蛋白的相對表達量

3 討論

3.1 氮肥對nifH基因表達的影響

本實驗克隆到的nifH基因都屬于變形菌門，從同一個樣品中克隆的10個nifH基因序列差異較小，這可能和本試驗采用巢式PCR進行擴增有關，同時也可能與實驗樣本數較少有關。Gaby和Buckley［20］對固氮酶nifH基因引物的綜合評價認為：巢式PCR會大大降低引物的覆蓋面，可能會大大降低對不同種類固氮菌nifH基因擴增的能力。也有研究報道，氮肥會抑制部分內生固氮菌在甘蔗體內的定殖，如G. diazotrophicus，但是對Herbaspirillum屬的固氮菌定殖卻沒有關系［21］。Kirchhof等［22］研究發(fā)現(xiàn)固氮菌細菌數量在沒有氮肥使用的情況下，要高于在使用氮肥種植條件下的數量。Yanni等［23］證實早期的氮肥用量對甘蔗固氮并沒有太大的影響，甘蔗體內的G. diazotrophicus的分離頻率隨田間氮肥用量的增加而下降。氮肥和基因型都是影響內生固氮菌的因素，而究竟是氮肥對內生固氮菌的影響更大還是基因型對內生固氮菌的影響更大，不同研究有不同的觀點。Sano等［24］認為植物與固氮菌的聯(lián)合由植物基因型控制，并經馴化而得到加強；Coelho等［25，26］研究表明氮肥是影響高粱根際固氮群落的決定性因素，而氮肥和基因型對高粱內生固氮菌同等重要。在本研究中，從nifH的序列比對可以看出，不同甘蔗品種中擴增到的nifH基因序列差異相對同一品種不同處理下的nifH基因序列差異較小，說明氮肥對于內生固氮菌的影響可能較品種對內生固氮菌的影響更為顯著。在本研究中，從同一個甘蔗品種得到的nifH基因序列在施氮和不施氮條件下差異很大，從3個甘蔗品種葉片得到的nifH基因序列也存在較大差異，但在施氮肥條件下，3個甘蔗品種得到的nifH序列差異性降低。說明在本試驗條件下，施用氮肥后，甘蔗葉片內的固氮菌nifH基因的表達受到抑制，沒有進行表達或表達量減少，不施氮條件下有利于葉片內的固氮菌nifH基因的表達。本實驗主要目的是采用PCR技術定性檢測大田生長的甘蔗體內存在的固氮菌是否能進行nifH基因表達，但由于用于測序的克隆數偏少，可能也是造成葉片內存在的固氮菌nifH序列差異性降低的原因之一。本實驗在個別樣品中得到了另外一些nifH克隆，但是往往克隆數很少，并且不同樣品間得到的nifH克隆序列相似，懷疑數據錯誤或污染，當然也有可能是從本樣品中擴增出來的其他種類的固氮菌。

3.2 氮肥對甘蔗葉片內生固氮菌固氮酶表達量的影響

內生固氮菌的繁殖代謝需要甘蔗提供一定的碳源及其他生長物質，在施氮條件下甘蔗代謝產物充足，就能為內生固氮菌提供足夠的能源讓其繁殖，合成固氮酶蛋白，提高它們的生物固氮能力。Roesch和Olivares［19］在研究基因型、氮肥和植物生長時期對玉米內生固氮菌的影響時指出：在施氮后植物生長的第一個生長階段，約發(fā)芽后30 d，氮肥會顯著地抑制內生固氮菌的數量，而在植物生長其他階段氮肥和固氮菌數量并沒有顯著關系，氮肥會抑制某些種類的內生固氮菌的定殖，但是可能不影響內生固氮菌的數量。在本研究中，施氮條件下甘蔗葉片中內生固氮菌的種類減少，但是固氮酶的相對表達量卻增高。生物固氮作用是耗能過程，一般認為能源是影響生物固氮的主要因素之一。施一定量的氮肥有助于甘蔗的生長，促進甘蔗的光合產物增加。雖然氮肥分解產物如氨對于一些內生固氮菌固氮酶活具有抑制作用，但氨對固氮酶活的抑制可能是短期的。Dommergues等［27］曾在水稻根部施用銨肥，雖然短期內抑制水稻根際的固氮活性，但當氨離子被水稻吸收后，促進了水稻生長和光合作用，從而提高了根際的聯(lián)合固氮活性。在本研究中采樣時間大約是施氮后90 d，這時候土壤中的無機氮化物大多被甘蔗吸收利用，應該對固氮酶的影響減少。

4 結論

以大田生長的甘蔗葉片為材料，用RT-PCR和Western blot 方法證明了內生固氮菌nifH基因的表達。施氮肥處理抑制或降低了nifH基因表達的多樣性，但是卻增加了nifH蛋白的相對表達量，且不同品種間存在差異。

［1］洪國藩, 宋鴻遇. 固氮之光［M］. 湖南：湖南科學科技出版社, 1998, 128-143.

［2］Mohanta S, Sharma GD, Deb B. Diversity of endophytic diazotrophs in non-leguminous crops-A review. Assam University Journal of Science & Technology：Biological and Environmental Sciences［J］. 2010, 6（1）：109-122.

［3］路國兵, 張瑤, 冀憲領, 等. 植物內生細菌的侵染定殖規(guī)律研究進展［J］. 生物技術通報, 2007, 3：88- 92.

［4］邢永秀. 甘蔗內生固氮細菌的分離、鑒定和生長特性［D］. 南寧：廣西大學, 2006.

［5］魏春燕, 邢永秀, 等. 綠色熒光蛋白基因標記的固氮菌DX120E在甘蔗植株內的定殖［J］. 作物學報, 2014, 40（6）：1132-1139.

［6］楊榮仲, 譚裕模, 桂意云, 等.15N 測定甘蔗生物固氮能力研究［J］. 安徽農業(yè)科學, 2008, 36（24）：10405-10406.

［7］林麗, 張新成, 李楊瑞, 等. 甘蔗器官固氮酶活性及其對接種固氮菌的響應［J］. 西北植物學報, 2008, 28（12）：2472-2477.

［8］桂意云, 劉昔輝, 楊榮仲, 等. 甘蔗不同部位的固氮酶活性檢測［J］. 植物生理學通訊, 2007, 45（2）：291-294.

［9］Huaak K, Lindastrm K, Young P. Three phylogenetic groups of nodA and nifH genes in Sinorhizobium and Me sorhizobium isolates from leguminous trees growing in African and Latin America［J］. Applied and Environmental Microbiology, 1998, 64（2）：419 -426.

［10］Hennecke H, Kaluza K, et al. Concurrent evolution of nitrogenase genes and 16S rRNA in Rhizobium species and other nitrogen fixing bacteria［J］. Arch Microbiol, 1985, 142：342-348.

［11］ Ueda T, Suga Y, et al. Remarkable N2-fixing bacteria diversity detected in rice roots by molecular evolutionary analysis of nifH gene sequences［J］. Journal of Bacteriology, 1995, 177（5）：1414-1417.

［12］ Yong JPW. Phylogenetic classification of nitrogen fixing organisms［M］//Stacey G, Burris RH, Evans HJ. Biological nitrogen fixation. New York：Chapman and Hall, 1992, 54（6）：43-86.

［13］ Hennecke H, Kaluza K, et al. Concurrent evolution of nitrogenase genes and 16S rRNA in Rhizobium species and other nitrogen fixing bacteria［J］. Archives of Microbiology, 1985, 142（4）：342-348.

［14］ Ando S, Goto M, Meunchang S. Detection of nifH Sequences in Sugarcane（Saccharurn offcinarurn L.）and Pineapple（Ananas cornosus［L.］Merr.）［J］. Soil Science and Plant Nutrition, 2005, 51（2）：303-308.

［15］ Thaweenut N, Hachisuka Y, Ando S, et al. Two seasons’ study on nifH gene expression and nitrogen fixation by diazotrophic endophytes in sugarcane（Saccharum spp. hybrids）：expression of nifH genes similar to those of rhizobia［J］. Plant and Soil, 2011, 338：435-449.

［16］蔣媛. 施氮水平對不同甘蔗品種氮素積累利用及產量品質的影響［D］. 南寧：廣西大學, 2016.

［17］郭晉隆, 葉冰瑩, 黃慶煌, 等. 甘蔗葉片總蛋白提取及雙向電泳條件的改進［J］. 生物技術通報, 2008, 5（35）：112-115.

［18］Poly F, Monrozier LJ, Bally R. Improvement in the RFLP procedure for studying the diversity of nifH genes in communities of nitrogen fixers in soil［J］. Research in Microbiology, 2001, 152：95-103.

［19］Roesch LFW, Olivares FL. Characterization of diazotrophic bacteria associated with maize：effect of plant genotype, ontogeny and nitrogen-supply［J］. World Journal of Microbiology & Biotechnology, 2006, 22：967-974.

［20］Gaby JC, Buckley DH. A Comprehensive Evaluation of PCR Primers to Amplify the nifH Gene of Nitrogenase［J］. PLoS ONE, 2012, 7（7）：142-149.

［21］Muthukumarasamy R, Revathi G, et al. Influence of N-fertilization on the isolation of Acetobacter diazotrophicus and Herbaspirillum spp. from Indian sugarcane varieties［J］. Biology and Fertility of Soils, 1999, 29：157-167.

［22］Kirchhof G, Eckert B, Stoffels M, et al. Herbaspirillum frisingense sp. nov. , a new nitrogen-fxing bacterial species that occurs in C4-fibre plants［J］. Int J Syst Evol Microbiol. 2001, 51：157-168.

［23］Yanni YG, El-Fattah FKA. Towards integrated biofertilization management with free living and associative dinitrogen fixers for enhancing rice performance in the Nile delta［J］. Symbiosis, 1999, 27：319-331.

［24］ Sano Y, Fujii T, et al. Nitrogen fixation in the rhizosphere of cultivated and wild rice strains［J］. Crop Science, 1981, 21：758- 760.

［25］Coelho MRR, de Vos M, Carneiro NP, et al. Diversity of nifH gene pools in the rhizosphere of two cultivars of sorghum（Sorghum bicolor）treated with contrasting levels of nitrogen fertilizer［J］. FEMS Microbiol Lett, 2008, 279：15-22.

［26］Coelho MRR, Marriel IE, Jenkins SN. Molecular detection and quantification of nifH gene sequences in the rhizosphere of sorghum（Sorghum bicolor）sown with two levels of nitrogen fertilizer［J］. Applied Soil Ecology, 2009, 42：48-53.

［27］ Dommergues Y, Balandreau J, Rinaudo G, et al. Non-symbiotic nitrogen fixation in the rhizospheres of rice, maize and different tropical grasses［J］. Soil Biology & Biochemistry, 1973, 5（1）：83-89.

（責任編輯 朱琳峰）

Effects of Nitrogen Fertilizer on the Expression of nifH Gene of Endophytic Azotobacter in Sugarcane Leaves

LI Jia-hui1YUAN Dan1LU Jian-ming1YANG Li-tao1LI Yang-rui2XING Yong-xiu1
（1. State Key Laboratory of Conservation and Utilization of Subtropical Agro-Bioresources，Agricultural College，Guangxi University，Nanning 530004；2. Sugarcane Research Center，Chinese Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of Sugarcane Biotechnology and Genetic Improvement（Guangxi），Ministry of Agriculture/ Guangxi Academy of Agricultural Sciences/Guangxi Key Laboratory of Sugarcane Genetic Improvement，Nanning 530007）

In order to investigate the effects of nitrogen fertilizer on the expression of nifH gene of endophytic diazotrophs in sugarcane leaves，we carried out a field experiment with and without nitrogen fertilization，and used RT-PCR and Western blot technology to analyze the differences of nifH expression and the relative expression quantity of nitrogenase in 3 sugarcane varieties，GXB9，ROC22 and GT11. The results showed that the expressions of nifH gene in endogenous azotobacter were detected at gene and protein levels in the leaves of sugarcane growing in field both with nitrogen fertilization and without nitrogen fertilization. Nitrogen fertilization treatment inhibited or decreased the expression of nifH gene in nitrogen-fixing bacteria，but it was beneficial to the expression of nifH at the protein level. The relative expressions of the nifH gene in the leaves of three sugarcane cultivars were all higher under nitrogen application than the control without nitrogen application；especially，the difference was significant for cultivar ROC22.

sugarcane；endogenous azotobacter；nitrogenase；nifH

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.20170002

2017-01-11

國家自然科學基金項目（3156100093、31471449），廣西八桂學者和特聘專家專項基金（2013），國家現(xiàn)代農業(yè)產業(yè)技術體系廣西甘蔗創(chuàng)新團隊項目（gjnytxgxcxtd-03），廣西農業(yè)科學院團隊項目（2015YT02）

李佳慧，女，碩士研究生，研究方向：代謝植物學；E-mail：1558779830@qq.com

邢永秀，女，副教授，研究方向：甘蔗氮高效利用及生物固氮；E-mail：document126@126.com李楊瑞，男，教授，研究方向：甘蔗栽培與育種；E-mail：liyr@gxass.net