王大洲郭天笑鄭實商穎，許文濤

（1. 昆明理工大學食品安全研究院，昆明 650500；2. 中國農業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院，北京100083）

核酸等溫擴增技術在微生物快速檢測中的研究進展

王大洲1郭天笑2鄭實1商穎1，2許文濤2

（1. 昆明理工大學食品安全研究院，昆明 650500；2. 中國農業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院，北京100083）

等溫擴增技術在近20多年，得到了快速發(fā)展，依靠其等溫反應的優(yōu)勢正逐漸取代傳統的體外擴增技術聚合酶鏈式反應（Ploymerase chain reaction，PCR），其已經在臨床醫(yī)學、檢驗醫(yī)學、分子生物學、基因組學、食品安全等不同領域中的發(fā)揮著重要作用，特別是在致病菌、病毒等微生物的檢測中。將選取10余種關注度較高的等溫擴增技術，主要針對其反應原理、優(yōu)缺點以及發(fā)展應用等方面進行簡要概述和對比，最后展望了等溫擴增技術未來的發(fā)展趨勢，以期對相關研究領域的發(fā)展起到積極的促進作用。

等溫擴增；微生物；核酸；快速檢測

核酸體外擴增技術在分子生物和生物分析等領域是一項重要的技術，可用于定性、定量地分析和檢測微量核酸，其在臨床醫(yī)學、檢驗醫(yī)學、分子生物學、基因組學及食品安全等相關的各個領域發(fā)揮著重要的作用，是生命科學發(fā)展不可或缺的一種重要檢驗方法。隨著生物技術在臨床和現場檢測方面要求的不斷提升，越來越多的研究人員開始把目光專注于核酸體外擴增新技術的研究。聚合酶鏈式反應（Polymerase chain reaction，PCR）由于其特異性強，靈敏度高等優(yōu)點，是目前應用最為廣泛的核酸體外擴增技術。雖然PCR技術已經應用于分子生物學等各個領域，但是該技術需要通過不斷的變化溫度才能實現核酸擴增，因此，熱循環(huán)儀是不可或缺的設備。然而，由于熱循環(huán)儀體積大、價格較高，使其在基層的推廣和現場檢測受到了極大的限制［1］。因此，陸續(xù)出現了不同的等溫擴增技術，這些技術反應溫度單一，不受熱循環(huán)儀的制約，正逐漸成為PCR的最佳替代方法。

20世紀90年代初，很多研究人員看到了突破傳統核酸體外擴增技術將會帶來核酸體外擴增的新革命，從而嘗試創(chuàng)新發(fā)展無須熱變性的核酸恒溫擴增技術，并挖掘其在各領域應用的潛力，這些核酸等溫擴增的新技術應用于生命科學及相關的各個領域是必然趨勢，也吸引了越來越多研究者的目光。

等溫擴增技術的基本原理和反應成分各不相同，依據等溫擴增的基本原理和步驟，本文將現有等溫擴增總結為兩大類，第一類是第一步反應依賴于特異性引物延伸的等溫擴增技術；第二類是第一步反應依賴于限制性內切酶的等溫擴增技術。本文概述并比較分析了核酸等溫擴增技術的優(yōu)缺點及反應原理等，以期對相關領域的研究起到積極的促進作用。

1 依賴于特異性引物延伸的等溫擴增技術

與傳統PCR技術相似，為了保證目的片段特異性擴增，避免非特異產物的形成，在眾多等溫擴增方法中，依然使用特異性引物退火延伸作為等溫擴增的起始步驟，如依賴核酸序列擴增技術、滾環(huán)擴增技術、環(huán)介導等溫擴增等。但是，由于引物與目的模板退火結合的機理，這就不可避免地要對非單鏈的起始靶物質進行高溫變性處理，這些方法并不是徹底的等溫擴增。隨著技術的發(fā)展，為了避免高溫熱變性步驟，DNA解旋酶、單鏈結合蛋白等被引入等溫擴增體系。

1.1 依賴核酸序列擴增技術

依賴核酸序列擴增技術（Nucleic acid sequencebased amplification，NASBA）于1991年由Compton等［2］首次提出，該方法結合了轉錄依賴擴增系統（Transcription-based amplification system，TAS）［3］和自主序列復制系統（Self-sustained sequence replication，3SR）2種方法［4］，并對其進行改進。

NASBA技術與3SR相似，依賴AMV逆轉錄酶、RNase H和T7 RNA聚合酶和一對引物來完成等溫擴增，整個反應包含非循環(huán)相和循環(huán)相。在對目的RNA片段進行擴增時，以指數擴增方式大量生成單鏈RNA［5］。不過，與3SR相比，NASBA使用了DMSO（二甲基亞砜，Dimethyl sulfoxide，DMSO），反應溫度也適當地從37℃提高到41℃，有效地提高了反應的特異性［6］。隨后，Gene-Probe公司基于NASBA成功研制出依賴轉錄介導擴增（Transcription mediated amplification，TMA）檢測試劑盒［7］，帶有RNase H 活性和逆轉錄酶活性的MMLV逆轉錄酶（鼠白血病逆轉錄酶）取代了AMV逆轉錄酶、RNase H。由于3SR，NASBA和TMA的原理十分相似，所以較多文獻將這3種技術或其中兩種視為同一種［5，7-9］。

NASBA除了應用于RNA擴增，經過適當的改良也可以擴增DNA［6］：一種方法是使用限制性內切酶切割雙鏈DNA，使其末端產生T7 RNA聚合酶啟動子序列［2］；另一種方法是在非循環(huán)相里進行兩次95℃變性，第一次變性，雙鏈DNA解離成單鏈DNA，引物退火結合上后，在AMV反轉錄酶的作用下，延伸形成新的雙鏈DNA，接下來進行第二次變性，從而獲得了5' 端含有T7 RNA聚合酶啟動子序列的單鏈DNA。

NASBA由于其快速高效、操作簡便、設備要求低、擴增對象廣等特點，已被廣泛應用與發(fā)展。Lau等［10］分別使用NASBA-電化學發(fā)光法（NASBAECL）和NASBA-酶連接寡核苷酸捕獲技術（NASBAEOC）兩種檢測方法檢測出口蹄疫病毒；Zhao等［11］通過微流控芯片實時免疫NASBA檢測出水傳染病原菌；Clancy等［12］開發(fā)出一種帶有擴增內標的雙重實時NASBA診斷方法，成功檢測引起細菌性腦膜炎的流感嗜血桿菌，腦膜炎奈瑟氏菌和腦炎鏈球菌。H?nsvall等［13］使用實時NASBA技術擴增微小隱孢子蟲和人隱孢子蟲的MIC1轉錄本，成功區(qū)分以上兩種隱孢子蟲，在10 μL保存懸液中，檢測靈敏度可低至5個隱孢子蟲卵囊。Zeng等［14］結合NASBA和ELISA兩種技術優(yōu)勢，開發(fā)出NASBA-ELISA檢測方法，實現高效簡便檢測草魚呼腸孤病毒。盡管NASBA存在眾多優(yōu)勢，但是其缺點也不能被忽視：首先，其不是完全意義上的等溫擴增技術，不能進行一步擴增；其次，酶的熱穩(wěn)定性差，不能在反應之前加入；最后，有效擴增片段的長度較短，僅100-250 bp之間［6］。

1.2 滾環(huán)擴增技術

Fire等［15］于1995年首次提出滾環(huán)擴增技術（Rolling circle amplification，RCA），該技術是借鑒微生物環(huán)狀DNA復制過程建立起來的一種體外等溫擴增技術。在RCA反應中，phi29 DNA聚合酶是至關重要的組成部分，具有持續(xù)DNA合成能力和鏈置換活性［16，17］。

RCA的反應模板通常是單鏈環(huán)狀DNA，因此，須對雙鏈DNA樣品進行處理。如果樣品是雙鏈環(huán)狀DNA，則變性處理即可；但如果樣品是雙鏈線狀DNA，在進行變性處理后，還需用T4多核苷酸激酶與T4 DNA連接酶環(huán)化單鏈線狀DNA［15］。RCA按引物數量可分為單引物RCA，雙引物RCA和多引物RCA［18］。

1.2.1 單引物RCA 只需要一條引物P1即可完成擴增。引物P1與單鏈環(huán)狀DNA結合后，在phi29 DNA聚合酶的作用下開始延伸，當合成至自身5' 端時，在phi29 DNA聚合酶鏈置換活性的作用下，5'端DNA開始被置換下來，并繼續(xù)以環(huán)狀DNA為模板進行線性合成，最終生成一條具有重復序列且與模板DNA完全互補的線狀單鏈DNA。

1.2.2 雙引物RCA 也稱為超分支滾環(huán)擴增［19］，在單引物RCA的基礎上，再增加一條與擴增產物互補的引物P2，P2可與單引物RCA的產物退火延伸。隨著反應的進行，P2延伸鏈開始將下游P2的延伸鏈置換下來，被置換下來的P2延伸鏈作為模板與P1結合。同樣地，上游P1延伸鏈會把下游P1延伸鏈置換下來，如此形成指數擴增，最終得到一系列長短不一的雙鏈DNA產物。

1.2.3 多引物RCA［20］由phi29 DNA聚合酶、單鏈環(huán)狀DNA模板和隨機引物組成。多引物RCA原理與雙引物RCA相似，隨機引物可以在環(huán)狀DNA的不同位置同時延伸產生多個復制叉，然后在聚合酶的作用下置換非模板鏈，在置換非模板鏈的同時，其他隨機引物也開始與非模板鏈退火延伸，進而合成雙鏈DNA［21］。與單引物RCA和雙引物RCA相比，多引物RCA在合成速率和產量方面得到了明顯提高［20］。

到目前為止，出現了許多原理與RCA相似或衍生于RCA的核酸擴增技術，如利用T7 RNA聚合酶建立的以單鏈環(huán)狀DNA為模板的滾環(huán)擴增技術［22］；用于擴增基因組DNA的多重置換擴增技術（Multiple displacement amplification，MDA）［23-25］；利用鎖式探針的信號擴增RCA［19］。在微生物檢測方面，Rockett等［26］開發(fā)出依賴特異性引物的dRCA技術，在存在人源DNA的情況下，成功特異擴增BKV，HPyV6，HPyV7，TSPyV和STLPyV等7種人多瘤病毒，相比使用隨機引物的傳統RCA法，dRCA具有更強的靈敏度和更高的產量。Wen等［27］使用RCA技術擴增埃博拉病毒基因，同時基于氧化石墨烯吸附FAM的性質，開發(fā)出一款新型熒光生物傳感器，成功對擴增產物進行檢測，檢出限低至1.4 pM，即使在1%人血清中，也可檢測出目的基因。Hao等［28］基于RCA技術和WS2納米片，發(fā)明了一種用于檢測金黃色葡萄球菌的加強化學發(fā)光能量共振轉移傳感器，其檢出限可達15 CFU/mL。RCA與其他核酸擴增方法相比，其主要優(yōu)點為：反應機制簡單，僅需一種聚合酶即可實現核酸擴增；靈敏度高，一條引物可達到105倍擴增［29］，而兩條引物的擴增效率可達到109倍［19］；不需要PCR儀，避免了熱循環(huán)過程對反應組分的影響。RCA的不足之處在于：前期處理繁瑣，反應模板要求是單鏈環(huán)狀DNA，須對不符合要求的樣品進行退火和環(huán)化處理；反應時間較長，至少需要4 h［15，20］。

1.3 環(huán)介導等溫擴增

環(huán)介導等溫擴增（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是Notomi等［30］于2000年開發(fā)的一種具有快速高效、特異性強、錄敏度高等特點的等溫擴增技術。LAMP的反應過程可分為3個階段：循環(huán)模板合成階段、循環(huán)擴增階段和伸長再循環(huán)階段［18，30］。LAMP使用4條引物，分別是正向內引物FIP（包括F1c和F2兩部分序列，其中c代表反向互補序列），反向內引物BIP（包括B1c和B2），正向外引物F3和反向外引物B3。

反應初始，FIP和F3先后與單鏈DNA模板結合，引發(fā)循環(huán)模板合成，隨著F3的延伸，FIP產生的延伸鏈被置換出來，同時，其5' 端發(fā)生自我堿基配對，形成環(huán)狀結構。隨即，BIP和B3以環(huán)狀結構DNA作為模板延伸，引發(fā)新一輪鏈置換反應，最終形成一條啞鈴狀單鏈DNA，即循環(huán)模板。進入循環(huán)擴增階段后，啞鈴狀單鏈DNA 3'端以自身為模板進行延伸，打開5' 端環(huán)狀結構，形成一條雙鏈莖環(huán)DNA。隨后，FIP的F2區(qū)域與莖環(huán)DNA環(huán)狀結構中的F2c區(qū)域互補配對，發(fā)生延伸置換反應，自此引發(fā)循環(huán)擴增和伸長再循環(huán)擴增，進入指數擴增階段。隨著FIP與BIP不斷與環(huán)狀結構結合，鏈置換反應持續(xù)發(fā)生，最終大量生成不同長度地多環(huán)花椰菜結構DNA，而每條DNA則是由交替反向重復靶序列構成［5，30］。LAMP原理雖然復雜，但是實際操作簡單，是一種簡單、快速、有效的核酸擴增技術。

LAMP的主要優(yōu)點是特異性強，多條互補序列的引入使得即使存在非目的DNA的情況下，也不會對靶序列的擴增產生明顯影響；其次，LAMP擴增效率高，由于存在多個循環(huán)體系，可實現高效擴增，其檢測限可低至幾個拷貝，遠優(yōu)于PCR［18，30］。再次，LAMP擴增產物檢測方便，LAMP會產生焦磷酸鎂白色沉淀，通過肉眼或濁度儀即可判定體系是否發(fā)生DNA擴增，適合用于即時檢測（Point-of-care testing，POTC）。

在10多年的時間里，不斷有研究者從模板性質［31］、反應抑制因子［32］、環(huán)引物的引入［33］及多重檢測［34-37］等方面對LAMP進行改進。到目前為止，由于引物設計的復雜性，僅發(fā)展到五重檢測。由于LAMP反應成本低、擴增時間短，無論是實驗室研究還是現場檢測都可以準確、快速、靈敏的完成，所以在基層檢驗的推廣中具有良好的前景，是真正普及型的核酸檢測方法?？茖W家們已經將LAMP技術成功應用于病毒、致病菌及轉基因作物的檢測［38］。

盡管LAMP擴增技術應用十分廣泛，但是不可避免的，LAMP也存在一定的缺陷：首先，由于LAMP產物鑒定結果只有擴增與不擴增，所以如果發(fā)生非特異性擴增，則不易識別。其次，其基本原理是基于鏈置換和鏈取代兩種過程，LAMP的擴增片段長度一般在200-300 bp，限制了LAMP 在擴增長片段方面的應用。另外，由于高靈敏度，操作過程中極易發(fā)生污染從而產生假陽性結果；LAMP在產物的回收、鑒定、克隆和單鏈分離等方面也存在很大的操作障礙。

1.4 依賴解旋酶擴增技術

DNA體內復制主要依賴于DNA解旋酶、DNA聚合酶以及各種輔助因子，根據以上復制機制，Vincent等［39］模擬出依賴解旋酶擴增技術（Helicasedependent amplification，HDA）。HDA是一種徹底的等溫DNA體外擴增技術，目前，能夠達到反應全過程恒溫這一條件的體外等溫擴增技術屈指可數，其全程等溫的實現主要依賴于大腸桿菌UvrD解旋酶。

HDA的原理分為兩個階段：第一階段，核酸解旋酶打開DNA雙鏈，使目的模板鏈解鏈為單鏈狀態(tài)；單鏈結合蛋白與之結合，它的作用是保證單鏈結構不發(fā)生復性；第二階段，DNA聚合酶各自以單鏈為模板由引物為起始生成新鏈，新生成的雙鏈DNA作為下一輪擴增的模板，如此反復循環(huán)擴增實現靶DNA量的指數增加。HDA的反應步驟與PCR相似，均包括雙鏈DNA解鏈、退火及延伸等步驟，但最大的區(qū)別是采用酶維持單鏈作用替代升溫解雙鏈過程。

HDA的出現引起了許多研究者的關注，并對其進行了大量的研究及改進。An等［40］報道了嗜熱HDA（Thermophilic helicase-dependent amplification，tHDA），該技術將原先使用的大腸桿菌UvrD換成了來自騰沖嗜熱桿菌Thermoanaerobacter tengcongensis的耐熱UvrD解旋酶（Tte-UvrD）。該酶的應用使反應可在60-65℃之間進行，溫度的提升增強了該技術的靈敏度和特異性。Li等［41］在未提取DNA的前提下，直接使用tHDA成功檢測出人體血液中的瘧原蟲，檢出限達到50拷貝。Motré等［42］研發(fā)出了一種具有兩種不同功能的新酶，既可以解旋雙鏈DNA，又可以進行聚合反應，解決了解旋酶與聚合酶協作效率低的問題。這種酶實質上是Tte-UvrD和Bst DNA聚合酶通過卷曲螺旋域連接在一起的復合體。該新酶的使用明顯提高了擴增片段的長度。除了前面提到的兩種發(fā)展外，Xu等［43］的cHDA和Goldmeyer等［44］的RT-tHDA也對傳統HDA進行了改良。

HDA作為新型等溫核酸擴增技術的優(yōu)勢在于：反應全程溫度恒定，無需調節(jié)溫度，克服了傳統PCR通過“變性-退火-延伸”過程的多次變溫循環(huán)的瓶頸；反應機制簡單，僅需兩條簡單的引物；反應時間較短，在1-1.5 h就可以實現擴增。然而HDA也存在其缺陷，目前，常用的解旋酶是大腸桿菌MvrD解旋酶，其解鏈速度為20 bp/s，解旋速度慢及持續(xù)能力差，因此HDA只適用于擴增短片段［39］。

1.5 重組酶聚合酶擴增

繼HDA之后，Piepenburg等［45］于2006年創(chuàng)建了一種新型的全程等溫擴增技術，其與HDA相似，也使用酶來打開雙鏈DNA，該技術稱為重組酶聚合酶擴增（Recombinase polymerase amplification，RPA）。RPA是參照了T4噬菌體DNA復制系統，該反應系統中除了需要一種常溫下能工作的DNA聚合酶外，還包含噬菌體μvsX重組酶和單鏈DNA結合酶gp32，目前有些實驗中還會加入輔助μvsX重組酶的μvsY蛋白。

重組酶介導等溫擴增（Recombinase aid amplification，RAA）是基于RPA的一種改良，最大的突破是重組酶的選擇上。RPA使用的是噬菌體μvsX重組酶，而RAA使用的是從細菌或真菌中獲得的重組酶。這類酶不僅來源更為廣泛，而且最重要的是它在37℃恒溫下便可與引物緊密結合形成酶-引物聚合體，反應的溫度適應性更強［46］。

兩種方法的擴增原理為：引物常溫條件下與重組酶結合形成一種結構穩(wěn)定的復合物，當引物在模板DNA上搜索到與之完全互補的序列時發(fā)生退火；退火發(fā)生的同時單鏈DNA結合蛋白被激發(fā)，發(fā)生作用使模板DNA保持單鏈狀態(tài)，引物在DNA聚合酶催化作用下延伸形成新的DNA互補鏈。RAA和RPA反應迅速快捷，通常在1 h內即能得到可以用瓊脂糖凝膠電泳檢測到的擴增產量［47］。

與HDA相同，用于檢測PCR產物的方法也可用于RPA。Piepenburg等設計了含有一個四氫呋喃（Tetrahydrofuran，THF）分子的熒光探針，并在THF兩側的核苷酸上分別標記一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團。同時，為了防止探針被作為引物延伸，對其3' 端進行修飾。當探針結合到模板上時，來自大腸桿菌的核酸內切酶IV（Nfo）識別切割THF，上游探針形成新的3' 端，在Bsu聚合酶的作用下，作為引物延伸，置換出下游探針，從而使兩個熒光基團分離，產生熒光信號。為了實現無需實驗室的即時檢測，Piepenburg等還設計了用于側向流試紙條檢測的探針。該探針與熒光探針相似，其正向引物標記羧基熒光素（Carboxyfluorescein，FAM），反向引物標記生物素，因此，在Nfo和Bsu聚合酶的作用下，最終生成帶有雙標記的擴增產物。在試紙條上，擴增產物先與帶有FAM抗體的膠體金結合，再在檢測線上被生物素抗體捕捉，使檢測線顯色，達到檢測目的。目前，英國公司TwistDX Inc基于以上兩種探針，已分別開發(fā)出TwistAmp?exo試劑盒和TwistAmp?nfo試劑盒。TwistAmp?exo試劑盒是用于熒光檢測，不過將Nfo替換成了核酸外切酶III（exo），而TwistAmp?nfo試劑盒是用于試紙條檢測。目前，RPA已經可以替代傳統PCR實現檢測，特別是在病毒檢測方面頗具競爭力，如裂谷熱病毒［48］，檢出限達到19個拷貝；艱難梭狀芽孢桿菌［49］，檢出限為1 000個DNA拷貝，相當于1fg DNA；布魯氏菌［50］，檢出限可低至3個拷貝。

RPA其優(yōu)點在于：反應全程等溫進行，不需熱變性；引物設計簡單；靈敏度高，最低能檢測出僅含一個拷貝的樣品；特異性強，可進行多重RPA。RPA的主要缺點：由于引物（30-35 nt）與探針（46-54 nt）較長，不適合較短靶序列的檢測［5］；RPA反應條件較苛刻，不適合直接擴增粗樣品［7］。

1.6 信號介導RNA擴增技術

Wharam等［51］于2001年創(chuàng)建了信號介導RNA擴增技術（Signal-mediated amplification of RNA technology，SMART）。SMART與NASBA一樣，是一種依賴RNA轉錄的等溫擴增技術。但是，SMART不是通過增加靶序列拷貝數實現檢測，而是通過信號的放大來進行。

SMART體系含有兩條探針，分別是延伸探針和模板探針。兩條探針均有一個區(qū)域可分別與靶序列互補結合，同時還含有另一個可相互互補結合的區(qū)域，從而兩條探針與靶序列形成SMART反應中關鍵的三通結構（Three-way junction，3WJ）。延伸探針在Bst DNA聚合酶的作用下，以模板探針為模板，形成雙鏈T7 RNA聚合酶啟動子和雙鏈轉錄模板。雙鏈啟動子激活T7 RNA聚合酶不斷對轉錄模板進行轉錄，線性合成RNA信號。為了獲得更佳的檢測靈敏度，可進一步擴增RNA信號，將已生成的RNA信號與另一條探針結合，該探針結構與模板探針結構相似，也有T7 RNA聚合酶啟動子以及轉錄模板。后續(xù)的擴增過程與先前的擴增相同，雙鏈T7 RNA聚合酶啟動子和雙鏈轉錄模板生成，T7 RNA聚合酶不斷對轉錄模板進行轉錄，線性合成新的RNA信號。RNA信號用酶聯寡核苷酸吸附實驗（Enzyme-linked oligosorbent assay，ELOSA）進行檢測［51］。

SMART是一種特殊的等溫擴增技術，通過擴增信號來檢測靶序列。Wharam等使用SMART成功檢測大腸桿菌基因組DNA和總RNA中的特異性序列，甚至不需要提取核酸，直接進行檢測。Hall等［52］選用g20基因，使用SMART成功區(qū)分海洋噬藻體的兩個種——S-PM2和S-BnM1，證明SMART可直接檢測粗樣品。Murakami等［53］首次將3WJ結構與PG-RCA聯合使用，成功檢測人CD4mRNA，其中PG-RCA起著信號放大的作用；周敏等［54］使用相同的方法也成功檢測到腸道病毒71型，其檢測限低至埃摩爾級，靈敏度極強。經實驗驗證，SMART的主要優(yōu)點為：檢測范圍廣，既可檢測DNA，也可檢測RNA；探針設計簡單，只需設計與靶序列結合的區(qū)域，其它的都是通用序列區(qū)域；特異性強，只有形成3WJ結構，RNA信號才能生成；可直接檢測粗提樣品［55］。由于SMART還存在較多的不足，如反應時間長、靶序列須是單鏈核酸片段、操作繁雜、靈敏度較低等，目前相關的應用報道還較少。SMART在接下里的發(fā)展中，應該專注于提高檢測靈敏度，發(fā)展比ELOSA更高效的檢測方法，以及將擴增與檢測集中于一個試管中［5，51］。

1.7 單引物等溫擴增

單引物等溫擴增技術（Single primer isothermal amplification，SPIA）由Kurn等［56］于2005年首次報道。該技術主要通過使用一條嵌合引物“5'-RNADNA-3'”、RNase H和具有強鏈置換活性的DNA聚合酶來實現核酸等溫擴增。

反應初期，嵌合引物與單鏈DNA模板互補結合，在DNA聚合酶的聚合作用下開始延伸。同時，RNase H降解嵌合引物與模板形成的雜合鏈DNA：RNA中的RNA鏈［57］，使未結合引物RNA部分與模板結合，在DNA聚合酶的鏈置換活性下，新引物置換舊引物的延伸產物，并開始延伸。與此同時，新引物與模板形成的雜合鏈中的RNA鏈再次被RNase H降解，如此循環(huán)，進行線性擴增，從而產生大量與單鏈DNA模板互補的單鏈DNA產物。若想限制產物的長度，可使用鏈終止多聚核苷酸（Blocker）。Blocker能與單鏈DNA模板結合，當引物延伸至blocker時，將停止延伸，這是因為blocker中的部分堿基已被修飾，其與模板的結合力大大增強，DNA聚合酶無法置換出blocker。為防止blocker發(fā)生延伸反應，其3' 端也需要進行修飾［18，56］。在SPIA的基礎上，通過添加逆轉錄酶，可實現以RNA為模板擴增DNA，該技術被稱為Ribo-SPIA，其檢出限為1 ng RNA，且具有很好的重復性［56］。

SPIA的主要優(yōu)點在于：使用單引物，減少了引物二聚體的形成；不受RNA干擾；反應機制簡單，效率高。目前，其已被用于基于表達分析以及病原菌檢測［58-60］，同時證明該技術在檢測沙門氏菌方面比qPCR（quantitative PCR，qPCR）具有更好的靈敏度和特異性。但是，SPIA也存在其缺點：模板是單鏈核酸，需對雙鏈核酸進行熱變性處理；需對blocker進行堿基修飾，提高擴增成本；引物是嵌合引物，設計較復雜。

1.8 嵌合引物引發(fā)的核酸等溫擴增

嵌合引物引發(fā)的核酸等溫擴增技術（Isothermal and chimeric primer-initiated amplification of nucleic acids，ICAN）［61，62］與SPIA相似，均主要依靠嵌合引物、RNase H和具有強鏈置換活性的DNA聚合酶，不過ICAN需要一對引物，同時引物中的DNA與RNA序列排布位置與SPIA的引物相反，是“5'-DNA-RNA-3'”構型。ICAN的擴增產量高度依賴引物濃度，隨著濃度的增高，產量顯著提升。

重復“nick-and-run”是Mukai等［62］對ICAN擴增機制提出的第一個假設。一條引物與模板結合后，在DNA聚合酶的作用下開始延伸。隨即，RNase H切割引物RNA部分與引物延伸產物之間的結合點，形成缺口。DNA聚合酶再次作用于RNA 3' 端，在置換出下游DNA的同時，引物開始重新延伸，結合點再次形成。RNase H再次切割結合點，在DNA聚合酶的作用下，引物繼續(xù)重新延伸，進入循環(huán)擴增。得到的單鏈DNA則作為另一條引物的模板進行擴增，原理相同。依照重復“nick-and-run”擴增機制，擴增產物中不應含有RNA殘基，然而經序列分析，發(fā)現擴增產物中存在著大量帶有RNA殘基的產物。因此，Uemori等［63］認為ICAN還存在著其它反應機制，他們分別提出了“multi-priming”和“templateswitching”兩種新機制。經研究發(fā)現，RNase H引物存在2個或更多RNA殘基時，RNase H會優(yōu)先切割RNA殘基5' 端，并且是從引物上最后一個RNA殘基開始一個一個切割，即使只剩最后1個RNA殘基，RNase H也能有效切割殘基的5' 端。但是，“multipriming”和“template-switching”兩種新機制都是基于只切割引物上最后一個RNA殘基5' 端建立起來的，因此，實際上，ICAN的擴增機制可能會更加復雜。

與其它核酸擴增技術一樣，ICAN也可用于病原菌檢測。Isogai等［64］使用ICAN通過擴增invA基因來檢測死雞、蛋黃和牛糞中的沙門氏菌，且在死雞沖洗液的檢測中，ICAN的檢出率高于PCR。Horii等［65］結合層析技術，應用ICAN成功快速檢測出淋球菌對氟喹諾酮類藥物的抗藥性。Urasaki等［66］在ICAN的基礎上，引入環(huán)狀探針，對44個樣品中的柑橘黃龍病菌進行檢測，相比常規(guī)PCR，ICAN的檢測時間可以至少節(jié)約2 h，同時靈敏度更高。

綜上，ICAN的主要優(yōu)點在于擴增效率高、穩(wěn)定性好、擴增對象范圍廣，除了雙鏈DNA，還可作用于cDNA：RNA雜合鏈。但是，由于ICAN使用的引物是嵌合引物，由RNA和DNA構成，合成較復雜，且擴增機制不明確，進而不利于該技術的發(fā)展。

2 依賴于切刻內切酶的等溫擴增技術

解決不依賴高溫使DNA模板變性進而引發(fā)擴增反應，是實現真正等溫擴增反應的瓶頸。雖然，DNA解旋酶等被用來產生DNA單鏈，但是效果一般，反應機制復雜。切刻內切酶的發(fā)現，使得等溫產生DNA單鏈成為可能。切刻內切酶（Nicking Enzyme），也稱為切口酶，由美國NEB公司開發(fā)，其為一種限制性內切酶，能夠識別特異性的核苷酸序列，并且在序列內部或首尾處發(fā)生單鏈切割；該過程對底物DNA沒有要求，即不需要有任何化學修飾。因此，依賴切刻內切酶作為反應第一步的等溫擴增技術逐漸被發(fā)展起來。

2.1 鏈置換擴增技術（Strand displacement amplification，SDA）

置換擴增技術是一種DNA體外等溫擴技術，由美國Beetonniekinson研究中心Walke［67］博士團隊于1992年首次報道，此方法的建立標志著一種新型DNA擴增技術的誕生。

SDA反應全過程主要依賴于限制性內切酶對半硫代磷酸化堿基對應互補鏈的切割作用，以及聚合酶exo-klenow對切口的延伸作用和對下游DNA片段的置換作用。SDA由兩條引物P1和P2進行擴增，兩條引物的3' 端和5' 端分別含有特異性結合序列和Hinc II識別序列，其具體的擴增方式是：限制性內切酶首先識別半硫代磷酸化堿基對應的互補鏈，然后切割該位置并產生單鏈切口；被切割部分的5' 上游端能夠作為一條引物，在具有鏈置換活性的DNA聚合酶的作用下從5' 端向3' 端延伸擴增，從而剝離原本已經形成互補的DNA鏈；被取代下的單鏈DNA再與另一條引物結合，相同原理下延伸形成一條新的雙鏈DNA。SDA反應即是通過這種“切口-擴增-置換”循環(huán)往復的過程，達到靶序列高效擴增的目的，其一般反應條件為37-40℃，經過2 h循環(huán)靶序列可得到108倍的擴增量。

SDA被發(fā)明后，在20余年的發(fā)展更新中，該技術在細菌病毒檢測、核酸定量、重金屬檢測及芯片雜交等多個方面有相關報道，同時也衍生出了一些新方法。Little等［68］將SDA與熒光共振能量轉移技術結合，開發(fā)出新一代DNA探針系統—BD ProbeTecTMET系統，用于檢測沙眼衣原體、淋病奈瑟菌和人乳頭狀瘤病毒；Nuovo等［69］應用RT-SDA檢測丙型肝炎病毒；Li等［70］研發(fā)出一種SDA結合核酸酶高效檢測二價鉛離子的方法。

SDA提供了一種可用于核酸診斷分析的擴增方法，具有等溫核酸擴增的通用優(yōu)勢：無須熱變性、特異高效、操作簡便，只需一個恒溫器，大大簡化了對所需儀器的要求。但是SDA由于反應原理和反應體系的復雜性，不可避免的帶來了很多缺點：非標準核苷酸的使用，經硫基修飾的單核苷酸在價格上比普通的單核苷酸高出很多倍，增加了反應成本［71］；經硫基修飾的單核苷酸不是DNA聚合酶的天然底物，修飾的核苷酸與標準核苷酸存在競爭關系，聚合酶容易從DNA模板上掉落，大大降低了擴增效率降低了擴增效率，所以，SDA不可能合成較長的產物，一般不超過200 bp［18，72］；SDA產物末端帶有限制性核酸內切酶的識別序列或其殘端，使其不適合直接用于克隆，因此，該技術在基因工程方面不占優(yōu)勢［73］；SDA的等溫過程是兩步法，需要首先有變溫過程打開雙鏈與引物退火，這就需要酶體系在變溫環(huán)節(jié)后添加，增加了外源污染的可能性。2.2 指數擴增反應（Exponential amplification reaction，EXPAR）指數擴增反應由Van Ness等［74］于2003年開發(fā)，該技術利用擴增模板合成寡核苷酸，長度為8-16 mer，可用于位點多態(tài)性研究［7］。反應試劑中的N.BstNBI切口酶在反應中發(fā)揮著至關重要的作用，因此，也可以把該技術稱為切口酶擴增反應（Nicking enzyme amplification，NEAR）［7］。

EXPAR能否順利開展，取決于觸發(fā)反應。而觸發(fā)反應存在著不同的機制，其中最簡單的一種機制是依賴基因組DNA上存在著切口酶的識別序列。單鏈基因組DNA與觸發(fā)模板退火結合，雙鏈識別序列形成，激活切口酶切割單鏈基因組DNA識別序列，缺口下游帶有3' 懸掛的DNA序列，其在60℃下自動解離，同時上游DNA序列以觸發(fā)模板為模板，在DNA聚合酶的作用下開始延伸，合成平末端的DNA序列。與此同時，新形成的識別序列再次被切割，缺口下游的DNA序列自動解離，成為觸發(fā)子。上游DNA序列繼續(xù)延伸，切口酶繼續(xù)切割，從而線性生成觸發(fā)子，反應進入指數擴增階段。形成的觸發(fā)子與擴增模板3' 端序列結合，在DNA聚合酶的作用下開始延伸，形成雙鏈DNA，切口酶切割識別序列，形成缺口，缺口下游序列自動解離，解離的單鏈片段隨即與自由的擴增模板結合形成短暫雙鏈結構，在DNA聚合酶的作用下，解離的片段一旦開始延伸，雙鏈結構就會穩(wěn)定下來，不會輕易解離，最終生成新的雙鏈DNA。新生成的雙鏈DNA重復之前的過程，繼續(xù)合成其它新的雙鏈DNA。在這個過程中，每個雙鏈DNA也會線性生成單鏈片段，從而達到指數擴增的目的。

EXPAR發(fā)展至今，已被廣泛應用于檢測蛋白質和DNA。Nie等［75］基于EXPAR，開發(fā)出GQEXPAR，這是一種依賴G-四鏈體的雙重擴增技術，可通過聯合比色法檢測DNA。Ma等［76］創(chuàng)建了一種用于檢測轉錄因子的技術，該技術是在GQ-EXPAR的基礎上，再加入RNA轉錄技術實現檢測的目的。Yu等［77］聯合EXPAR和HCR開發(fā)出一種電化學傳感器，可對H7N9病毒實現超靈敏檢測。EXPAR的主要優(yōu)點在于：反應形式多，可滿足不同的擴增需求；反應穩(wěn)定性好，速度快，靈敏度高。但由于反應機制復雜，產物產量易受擴增模板限制，使得后期會從指數擴增轉變?yōu)榫€性擴增。

2.3 切刻內切酶介導等溫核酸擴增技術（Nicking enzyme mediated amplification，NEMA）

切刻內切酶介導等溫核酸擴增技術是2006年研發(fā)的一種全新的核酸恒溫擴增技術，該技術是在SDA的基礎上發(fā)展而來的不依賴于特殊化學修飾的等溫方法［72］。NEMA反應體系中使用的切刻內切酶，是一種能夠識別特異性的位點并發(fā)生自然單鏈切割產生缺口的酶，切刻內切酶的使用克服了傳統SDA反應中需要添加化學修飾的非標準核苷酸的缺陷，簡化了反應體系，提高了反應效率，成本更低，并且可合成長鏈DNA。

NEMA反應體系包括兩對引物（剝離引物B1/B2，切割引物S1/S2）、一種具有鏈置換活性的DNA聚合酶、一種能夠識別特異性切割位點的切刻內切酶、額外添加的鎂離子以及適宜的緩沖溶液。NEMA技術是建立在SDA的原理技術上改進發(fā)明的，因此二者基本擴增原理相似。NEMA擴增分為“切割單鏈形成切口”和“鏈置換剝離舊鏈”兩個過程，在待擴增的DNA雙鏈模板上有一段切口酶特異識別的序列，在切口酶的作用下只切割其中一條鏈，然后DNA聚合酶以形成的切口為起點，以未被切斷的單鏈為引物延伸形成新鏈，置換舊鏈，產物作為新循環(huán)的模板不斷參與新一輪的指數擴增。體系中還存在另外一種模板，就是只上游或者下游一端引入了切刻內切酶識別位點的序列，這種狀態(tài)的靶序列同樣是以不斷結合雜交互補的切割引物參與擴增，然后發(fā)生單鏈切口切割，在DNA聚合酶作用下鏈置換，如此的往復循環(huán)過程。

相較于SDA和其他目前開發(fā)的等溫核酸技術，NEMA具有一些潛在的優(yōu)勢：酶體系和原材料體系的簡單減少了抑制因子的干擾；擴增迅速，反應時間短，在1 h之內就能達到電泳凝膠的觀察要求；低成本，操作簡單，對操作儀器的要求不高，為核酸擴增技術的推廣創(chuàng)造了條件。但是NEMA目前還處于探索階段，多數應用在微生物質粒DNA的檢測方面。

表1 核酸等溫擴增技術的參數比較

3 結語

本文介紹了10余種等溫擴增技術，其中每種技術均有各自的優(yōu)勢，表1比較了上文提到的幾種等溫核酸擴增方法的技術特點。盡管等溫擴增技術有著普通PCR擴增不可超越的優(yōu)勢，但是有些缺點也是不容忽視的。不過，隨著進一步研究，對生物過程的了解越來越深入，相信未來將會有更多更完善的新型等溫擴增技術不斷涌現。

等溫擴增技術是在單一溫度下對靶序列進行擴增或信號放大，不依賴便攜性差、價格昂貴的熱循環(huán)儀，進而在近20多年得到快速發(fā)展，尤其是在微生物檢測領域中。我國現行標準（GB/T，SN/T等）中有多項采用了等溫檢測的方法，包括金黃色葡萄球菌、產氣莢膜梭菌、創(chuàng)傷弧菌、阪崎腸桿菌、沙門氏菌等致病菌；豬圓環(huán)病毒2型、家畜布魯氏菌、焦枯病菌、甘蔗病原菌和豬瘟病毒等。等溫擴增技術對儀器要求簡單，僅以電池為電源的加熱器即可，未來可在邊遠地區(qū)和基層醫(yī)療單位等缺乏資金和先進檢測設備的地區(qū)大力推廣，使其具備快速診斷病原體的能力。檢測時間短也是等溫擴增技術的優(yōu)勢，可在實時現場檢測與監(jiān)測領域推廣，如在突發(fā)公共衛(wèi)生事件的現場診斷中，等溫技術對傳染性疾病的早期發(fā)現和控制具有重要的意義。

由于等溫擴增技術的等溫反應的特點，其很有可能普遍應用于下一代現場快速檢測設備中。然而，歷經了20余年的發(fā)展，在市場上仍然看不到任何已經被廣泛使用的相關設備。但是，導致這種現象的原因并非等溫擴增技術不適用，而是因為這是一個復雜的工程問題，是一個涉及多領域的難題［78］。想研發(fā)出以核酸為靶物質的便攜快速即時檢測設備，我們需要對等溫擴增技術進行更多的優(yōu)化，比如擴增速率，電力需求等等，同時需要解決將等溫擴增與上下游操作結合在一起的技術難關，如結合樣品核酸的提取純化以及后期的擴增產物檢測［79］。隨著微型品制造技術與等溫擴增技術的不斷提升［7］，相信在不久的將來將會出現突破性的進展。

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（責任編輯 李楠）

Research Progress on the Isothermal Nucleic Acid Amplification Techniques in Rapid Detection of Microorganisms

WANG Da-zhou1GUO Tian-xiao2ZHENG Shi1SHANG Ying1，2XU Wen-tao2
（1. Institute of Food Safety，Kunming University of Science and Technology，Yunnan，Kunming 650500；2. College of Food Science and Nutritional Engineering，China Agricultural University，Beijing 100083）

In recent 20 years，isothermal amplification technology has been rapidly developed. Relying on the advantage of the isothermal reaction，it is gradually replacing the traditional in vitro PCR（polymerase chain reaction）amplification，and plays an important role in different fields such as clinical medicine，laboratory medicine，molecular biology，genomics，food safety，and especially in the detection of pathogenic bacteria，viruses and other microorganisms. This article reviews and compares more than 10 kinds of high-profile isothermal amplification technologies，mainly focusing on the reaction principles，advantages，disadvantages as well as the development and application，and finally prospects the trends of isothermal amplification techniques，in order to play a positive role in the development of the related research fields.

isothermal amplification；microorganisms；nucleic acid；rapid detection

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0106

2017-02-20

云南省省級（人培）項目（KKSY201562018）

王大洲，男，碩士研究生，研究方向：食品安全檢測技術；E-mail：1015454171@qq.com

商穎，女，講師，碩士生導師，研究方向：食品病原微生物和食品風險因子高通量檢測，E-mail：shangying1986@163.com；許文濤，男，副教授，博士生導師，研究方向：食品病原微生物的檢測術和致毒機制、轉基因生物檢測和食用安全性評價、食品源風險因子對腸道微生物健康的影響等，E-mail：xuwentao1111@sina.com