丘衛(wèi)恩，陳允，周道祥，鄺錦波，林丹，李波

（廣州市越秀區(qū)中醫(yī)醫(yī)院，廣東 廣州 510030）

外周血CD4+CD25+Treg細(xì)胞在慢性乙型病毒性肝炎患者的表達(dá)水平及其與自身抗體的相關(guān)關(guān)系探討

丘衛(wèi)恩，陳允，周道祥，鄺錦波，林丹，李波

（廣州市越秀區(qū)中醫(yī)醫(yī)院，廣東 廣州 510030）

目的 探討外周血CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg細(xì)胞）在慢性乙型病毒性肝炎（CHB）患者中的表達(dá)水平及其與自身抗體的關(guān)系。方法選取2013年1月至2015年12月于我院首次就診且未做任何治療的CHB患者156例，分為A組（自身抗體陽(yáng)性組，70例）和B組（自身抗體陰性組，86例）。同時(shí)，選取同期來(lái)院行健康查體的正常人50例作為C組。結(jié)果 A組的CD4+CD25+T細(xì)胞數(shù)顯著低于B組和C組（P＜0．05）。A組的HBV-DNA和ALT水平均顯著高于B組（P＜0．05）。隨著外周血CD4+CD25+Treg細(xì)胞百分?jǐn)?shù)的增加，自身抗體數(shù)逐漸降低，二者呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系（r＝-0．519，P＜0．05）。結(jié)論 CD4+CD25+Treg細(xì)胞可能具有抑制CHB患者產(chǎn)生自身抗體的作用，可避免機(jī)體免疫耐受的產(chǎn)生和發(fā)展，從而達(dá)到減輕肝炎病情的目的。

CD4+CD25+Treg細(xì)胞；乙型病毒性肝炎；自身抗體

研究［1］表明，慢性乙型肝炎（CHB）的發(fā)生發(fā)展與肝臟自身的免疫病理?yè)p傷及肝外自身免疫系統(tǒng)的異常密切相關(guān)。自身免疫性肝病相關(guān)的自身抗體在CHB患者體內(nèi)存在較高的檢出率，且上述抗體陽(yáng)性的患者往往病情遷延難愈，復(fù)發(fā)率較高，成為治療的難題。但其在肝臟免疫炎性損傷中的免疫調(diào)節(jié)作用及在治療預(yù)后中的評(píng)估價(jià)值尚不清楚。近年研究［2］顯示，CD4＋CD25＋調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg細(xì)胞）作為具有免疫抑制功能的細(xì)胞亞群，可負(fù)反饋地抑制T細(xì)胞的功能，在自身免疫疾病發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要作用。當(dāng)機(jī)體感染HBV病毒時(shí)，免疫平衡被打破，最終導(dǎo)致機(jī)體多種自身抗體的產(chǎn)生，誘發(fā)肝細(xì)胞的免疫損傷和炎性反應(yīng)過(guò)程。本研究檢測(cè)70例自身抗體陽(yáng)性CHB患者外周血CD4＋CD25＋Treg細(xì)胞的表達(dá)水平，旨在探討CD4＋CD25＋調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在CHB患者免疫調(diào)節(jié)機(jī)制中的作用。

1 資料與方法

1．1 一般資料選取2013年1月至2015年12月于我院首次就診且未做任何治療的CHB患者共156例，其中，男91例，女65例，年齡17～76歲，平均年齡（39．7±27．9）歲。所有患者的診斷均參照2000年病毒性肝炎防治方案的診斷標(biāo)準(zhǔn)確診為CHB，并排除甲、丙、丁及戊型等其他肝炎病毒感染，自身免疫性肝炎，重型肝炎及肝硬化失代償患者。根據(jù)患者自身抗體表達(dá)情況，若存在1項(xiàng)抗體表達(dá)為陽(yáng)性者則視為自身抗體表達(dá)陽(yáng)性，將156例患者分為A組（自身抗體陽(yáng)性組，70例）和B組（自身抗體陰性組，86例）。同時(shí)，選取同期來(lái)院進(jìn)行健康體檢的正常人50例作為C組，其中，男性28例，女性22例，年齡19～76歲，平均年齡（38．1±24．3）歲。三組在年齡、性別等方面無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0．05），具有可比性。

1．2 方法①斑點(diǎn)免疫層析法檢測(cè)自身抗體的表達(dá)：采用斑點(diǎn)免疫層析法檢測(cè)三組患者的自身抗體表達(dá)情況，包括抗單鏈DNA抗體（SS－DNA）、抗雙鏈DNA抗體（ds－DNA）、抗核抗體（ANA）、抗肝／腎微粒體抗體（LKM）及抗線粒體IgM抗體（AMA）。抗體試劑盒由美國(guó)BD公司生產(chǎn)，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行檢測(cè)。②流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD4＋CD25＋T細(xì)胞的表達(dá)：抽取各組研究對(duì)象的清晨空腹肘靜脈血4 mL裝于肝素鈉抗凝管中混勻后，以1∶1的比例采用PBS溶液進(jìn)行稀釋，通過(guò)淋巴分離液對(duì)稀釋液進(jìn)行分離，得到單個(gè)核細(xì)胞（PBMC），并調(diào)整細(xì)胞數(shù)，制成濃度為1×107／mL的細(xì)胞懸液，分別吸取抗人CD4－FITC及CD25－PE單克隆抗體及相應(yīng)對(duì)照IgG2b－FITC／IgG1－PE各10 μL，與取100 μL的PBMC混勻，在室溫下避光孵育20 min，采用預(yù)冷的PBS溶液進(jìn)行洗滌后，離心5 min，留取沉淀物，分別加入1 mL固定／破膜液，在4℃的溫度下避光孵育30 min，以2 mL固定／破膜緩沖液洗滌2次，分別加入20 μL的相應(yīng)抗體，在4℃下避光孵育30 min，再次用固定／破膜緩沖液洗滌2次，留取沉淀，采用0．5 mL PBS稀釋并混勻后，采用美國(guó)BD公司生產(chǎn)的FACS－Calibur型流式細(xì)胞儀檢測(cè)并運(yùn)用CellQuest軟件進(jìn)行分析，檢測(cè)CD4＋CD25＋Treg細(xì)胞的表達(dá)水平。③實(shí)時(shí)熒光PCR方法檢測(cè)HBV－DNA水平：采用實(shí)時(shí)定量熒光PCR方法檢測(cè)HBV－DNA水平，以5×105copies／L作為HBV－DNA的檢測(cè)下限。同時(shí)檢測(cè)各組的ALT表達(dá)水平。

1．3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析運(yùn)用SPSS 17．0軟件，計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用單因素方差分析，相關(guān)分析采用Spearman相關(guān)分析，率的比較采用χ2檢驗(yàn)，P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 各組的血清學(xué)指標(biāo)表達(dá)水平比較A組的CD4＋CD25＋Treg細(xì)胞數(shù)顯著低于B組和C組（P＜0．05）。A組的HBV－DNA和ALT水平均顯著高于B組（P＜0．05）。見(jiàn)表1。

表1 各組的血清學(xué)指標(biāo)表達(dá)水平比較（±s）

表1 各組的血清學(xué)指標(biāo)表達(dá)水平比較（±s）

注：與C組比較，*P＜0．05；與B組比較，#P＜0．05。

nCD4+CD25+TregHBV-DNAALT組別細(xì)胞（%）（×106copies/L）（U/L）A組705．63±2．74*#10．89±1．26*#216．87±103．46*#B組869．05±4．22*6．97±0．95*165．55±87．23*C組506．75±3．17023．4±8．9

2．2 自身抗體陽(yáng)性表達(dá)情況70例自身抗體表達(dá)陽(yáng)性患者中，至少有1項(xiàng)自身抗體表達(dá)為陽(yáng)性，最多者5項(xiàng)自身抗體均表達(dá)為陽(yáng)性。其中，共42例1項(xiàng)抗體表達(dá)陽(yáng)性，18例2項(xiàng)抗體表達(dá)為陽(yáng)性，6例3項(xiàng)抗體表達(dá)陽(yáng)性，2例3項(xiàng)抗體表達(dá)為陽(yáng)性，1例4項(xiàng)抗體表達(dá)為陽(yáng)性，1例5項(xiàng)表達(dá)全部為陽(yáng)性。

2．3 自身抗體表達(dá)與外周血CD4+CD25+Treg細(xì)胞表達(dá)水平的相關(guān)性隨著外周血CD4＋CD25＋Treg細(xì)胞百分?jǐn)?shù)的增加，自身抗體數(shù)逐漸降低，經(jīng)相關(guān)關(guān)系分析結(jié)果顯示，二者呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系（r＝－0．519，P＜0．05）。見(jiàn)表2。

表2 不同自身抗體陽(yáng)性患者CD4+CD25+Treg細(xì)胞百分?jǐn)?shù)表達(dá)情況

3 討論

慢性乙型肝炎是臨床最為常見(jiàn)的病毒性肝炎，當(dāng)機(jī)體感染乙肝病毒時(shí)，病毒可直接損害肝細(xì)胞，同時(shí)可誘發(fā)機(jī)體免疫功能紊亂，間接損害肝細(xì)胞，導(dǎo)致病情反復(fù)發(fā)作。目前，外周血T淋巴細(xì)胞亞群被認(rèn)為是反映機(jī)體免疫功能正常與否的重要指標(biāo)［3］。CD4＋CD25＋Treg細(xì)胞是20世紀(jì)70年代由免疫學(xué)家發(fā)現(xiàn)并提出的一種抑制性T細(xì)胞，可能在外周免疫耐受維持方面發(fā)揮重要作用。近年研究［4］發(fā)現(xiàn)，CD4＋CD25＋Treg細(xì)胞具有免疫抑制和免疫無(wú)能的雙重特性，故又被稱為調(diào)節(jié)性T細(xì)胞。有研究［5］表明，CD4＋CD25＋Treg細(xì)胞可通過(guò)TCR刺激并被活化，發(fā)揮抑制CD4＋和CD8＋T細(xì)胞活性的作用。CD4＋CD25＋Treg一旦被活化，在體外可通過(guò)CTLA－4、TGF－β及GITR等因子與相應(yīng)細(xì)胞受體結(jié)合后，抑制靶細(xì)胞上IL－2Rα鏈的增殖與活化，從而抑制T細(xì)胞增殖；同時(shí)，在體內(nèi)還可通過(guò)IL－10、IL－4及TGF－β等抑制性細(xì)胞因子發(fā)揮抑制作用。另外，當(dāng)直接接觸細(xì)胞時(shí)，可通過(guò)表達(dá)顆粒酶A，利用穿孔素依賴的細(xì)胞毒途徑殺傷并抑制多種靶細(xì)胞的活化。近年來(lái)，有研究［6］提出CD4＋CD25＋Treg細(xì)胞可能在CHB發(fā)病過(guò)程中發(fā)揮重要作用。多數(shù)學(xué)者認(rèn)為CHB患者外周血CD4＋CD25＋調(diào)節(jié)性T細(xì)胞數(shù)量較正常人顯著增多，一方面抑制了HBV特異性的CD8＋T細(xì)胞的增殖與活化，導(dǎo)致病毒無(wú)法得到徹底清除而發(fā)生持續(xù)感染，另一方面由于無(wú)法抑制機(jī)體過(guò)度的免疫反應(yīng)，可導(dǎo)致肝細(xì)胞的免疫病理?yè)p傷持續(xù)存在。上述觀點(diǎn)是基于CD4＋CD25＋調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在自身免疫性肝炎中的作用提出的，但CHB患者與自身免疫性肝炎的發(fā)病機(jī)制存在差異，CHB患者存在自身抗體陽(yáng)性和陰性兩種類型，其免疫機(jī)制在發(fā)病中的作用可能也不同。

本研究比較自身抗體陽(yáng)性和陰性CHB患者外周血CD4＋CD25＋Treg細(xì)胞的表達(dá)，結(jié)果顯示，自身抗體陽(yáng)性患者的CD4＋CD25＋Treg細(xì)胞數(shù)顯著低于自身抗體陰性患者，且較正常人亦顯著降低，提示自身抗體陽(yáng)性乙肝患者的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞數(shù)量及功能均偏低；同時(shí)，自身抗體陽(yáng)性患者的HBV－DNA水平和ALT水平均顯著高于B組，提示自身抗體陽(yáng)性CHB患者的病毒復(fù)制更為活躍，肝細(xì)胞損害更重，病情更為嚴(yán)重。相關(guān)性分析結(jié)果顯示，隨著外周血CD4＋CD25＋Treg細(xì)胞百分?jǐn)?shù)的增加，自身抗體數(shù)逐漸減少，二者呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系。提示CD4＋CD25＋Treg細(xì)胞可能具有抑制CHB患者產(chǎn)生自身抗體的作用，可避免機(jī)體免疫耐受的產(chǎn)生和發(fā)展，從而達(dá)到減輕肝炎病情的目的。

[1]曾達(dá)武,董菁,陳麗紅,等．免疫清除期慢性乙型肝炎患者血清HB-sAg水平與肝組織炎癥分級(jí)及纖維化分期的關(guān)系[J]．中華肝臟病雜志,2012,20(10)：746-750．

[2]王凌云,陳映波,馮煉強(qiáng),等．胃癌患者外周血CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的檢測(cè)及臨床意義[J]．中國(guó)免疫學(xué)雜志,2005,21(12)：59-61．

[3]嚴(yán)健,原永明,張舒,等．CD3+、CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞亞群在腫瘤患者外周血中檢測(cè)的臨床意義[J]．檢驗(yàn)醫(yī)學(xué),2013,28(10)：901-903．

[4]王玲玲,趙明靜,毛世濤,等．不同分期老年COPD患者外周血中CD4+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞變化及其與肺功能改變的相關(guān)性[J]．中國(guó)老年學(xué)雜志,2012,32(2)：223-225．

[5]卞成蓉,劉佳,陳霖,等．CD4+CD25+Treg細(xì)胞對(duì)慢性丙型病毒性肝炎患者干擾素治療療效預(yù)判作用研究[J]．軍事醫(yī)學(xué),2015 (9)：725-728．

[6]劉夢(mèng),李明慧,陳曉雪,等．Treg細(xì)胞在慢性HBV感染免疫耐受機(jī)制中的作用[J]．中華實(shí)驗(yàn)和臨床病毒學(xué)雜志,2015,29(3)：196-198．

（責(zé)任編輯：鐘婷婷）

Expression of Peripheral Blood CD4+CD25+Treg Cells in Patients with Chronic Hepatitis B and Its Relationship with Autoan-tibodies

QIU Weien,CHEN Yun,ZHOU Daoxiang,KUANG Jinbo,LIN Dan,LI Bo (Yuexiu District Hospital of TCM,Guangzhou 510030,China)

ObjectiveTo investigate the expression of CD4+CD25+Treg cells in patients with chronic viral hepatitis B(CHB)and its relationship with autoantibodies.Methods156 CHB patients treated for the first time in our hospital from January 2013 to December 2015 were divided into group A(autoantibody-positive group,70 cases)and group B(antibody-negative group,86 cases).50 cases at the same period to our hospital for normal physical examination were selected as group C.ResultsThe number of CD4+CD25+Treg cells in group A was significantly lower than that in group B and C(P＜0.05).The levels of HBV-DNA and ALT in group A were significantly higher than those in group B(P＜0.05).With the increase of CD4+CD25+Treg cells in peripheral blood,the number of autoantibodies decreased gradually, with a negative correlation between them(r=-0.519,P＜0.05).ConclusionsCD4+CD25+Treg cells mayinhibit the production ofautoantibodies in CHB patientsand preventthe developmentofimmune tolerance,so asto achieve the purpose ofreducingthe severityofhepatitis.

CD4+CD25+Treg cells;Hepatitis B;Autoantibody

R512．6+2

A

10．3969/j．issn．1674-4659．2017．06．0801

2017－02－07

丘衛(wèi)恩（1976－），男，本科學(xué)歷，主管技師，從事醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)。