方子妍，郭彩鳳，吳逢春，秦家明，寧玉萍*，周列民*

（1廣州醫(yī)科大學附屬腦科醫(yī)院／廣州市惠愛醫(yī)院神經(jīng)科，廣東 廣州 510370；

2中山大學附屬第一醫(yī)院神經(jīng)科，廣東 廣州 510080）

Tariquidar提高苯妥英鈉在顳葉內(nèi)側(cè)癲癇模型鼠腦中的分布

方子妍1，郭彩鳳1，吳逢春1，秦家明2，寧玉萍1*，周列民2*

（1廣州醫(yī)科大學附屬腦科醫(yī)院／廣州市惠愛醫(yī)院神經(jīng)科，廣東 廣州 510370；

2中山大學附屬第一醫(yī)院神經(jīng)科，廣東 廣州 510080）

目的 觀察tariquidar（TQD）能否避開顳葉內(nèi)側(cè)癲癇（MTLE）模型鼠P糖蛋白（Pgp）過表達的外排作用將抗癲癇藥物輸送至腦。方法鋰-匹羅卡品誘導構(gòu)建MTLE大鼠模型，并將模型鼠分成兩組，分別予苯妥英鈉（PHT）及PHT+TQD治療，觀察兩組大鼠腦中PHT分布。活體微透析采集腦微透析液，高效液相色譜法檢測PHT濃度。免疫組化檢測Pgp表達。運用t檢驗或Wilcoxon秩和檢驗進行統(tǒng)計學分析。結(jié)果 模型鼠海馬區(qū)Pgp表達上調(diào)（P＜0．05）。兩組模型鼠的腦／血漿的時間藥物濃度曲線的曲線下面積比值有顯著性差異［PHT+TQD組（0．31±0．06）＞PHT組（0．19±0．06），P＜0．05］。結(jié)論 TQD可顯著提高PHT在Pgp過表達MTLE模型鼠腦中的分布。

顳葉內(nèi)側(cè)癲癇；匹羅卡品；P糖蛋白；TQD；耐藥性癲癇

癲癇是中樞神經(jīng)系統(tǒng)常見病。盡管近年來在治療方法上已取得了進展，但合理、規(guī)則地服用抗癲癇藥物（antiepileptic drugs，AEDs）仍是目前治療癲癇的主要手段。然而約30%的患者雖經(jīng)規(guī)范合理的AEDs治療，發(fā)作仍無法控制，即耐藥性癲癇［1－3］。臨床上耐藥性癲癇以顳葉內(nèi)側(cè)癲癇（mesial temporal lobe epilepsy，MTLE）尤為多見。

雖然藥物耐受的病理生理機制存在多種假說，但耐藥性癲癇的一個重要特性是對多種AEDs耐藥，即使這些AEDs具有不同的作用機制［4］。這一現(xiàn)象是其他假說所無法解釋的，而更多地指向多藥轉(zhuǎn)運體過度表達假說。研究發(fā)現(xiàn)耐藥性癲癇患者手術(shù)切除的腦組織上Pgp過表達。而幾乎所有的AEDs都是Pgp的底物。除此之外，動物實驗也證實血腦屏障上Pgp過表達導致了藥物耐受［5］。因此如何抑制或逆轉(zhuǎn)Pgp過度表達，增加AEDs靶向進入癲癇灶是治療耐藥性癲癇的一個可行方法，是目前耐藥性癲癇研究的焦點。

近來，Pgp拮抗劑的研發(fā)多局限于腫瘤領(lǐng)域，最初的Pgp第一代拮抗劑缺乏特異性，帶來很多嚴重的副作用。因此，針對Pgp拮抗劑特異性開發(fā)了一些新的藥物，其中以Pgp第三代拮抗劑TQD為代表。Ⅲ期臨床試驗證明TQD能提高伴Pgp過表達的腫瘤對一些化療藥物的敏感性［6］。而在癲癇領(lǐng)域，僅見Brandt等［7］的研究結(jié)果證實苯巴比妥聯(lián)合應用TQD能明顯減少伴Pgp過表達的苯巴比妥耐藥癲癇大鼠的發(fā)作次數(shù)。

盡管得出上述結(jié)論，但仍缺乏直接評估聯(lián)合TQD后對AEDs藥代動力學影響的證據(jù)。因此，本研究擬觀察TQD能否提高MTLE模型鼠腦中PHT濃度，為TQD逆轉(zhuǎn)癲癇耐藥提供直接藥代動力學證據(jù)。

1 材料和方法

1．1 實驗材料

1．1．1 動物來源雌性6～8 w SD大鼠，體重160～180 g，由廣東省實驗動物研究所提供。

1．1．2 主要試劑氯化鋰（Sigma）；匹羅卡品（Sigma）；東莨菪堿（Sigma）；苯妥英鈉（Sigma）；單克隆小鼠抗大鼠Mdr C－19（sc－1517，Santa Cruz Biotechnology，USA）；tariquidar（Medkoo Biosciences，Inc．）。

1．1．3 主要儀器設(shè)備微量進樣泵（MD－1020，Bioanalytical Systems Inc，USA）；微量收集器（MD－1027，Bioanalytical Systems Inc，USA）；微透析用管路（ID 0．12 mm，OD 0．65 mm，Carnegie Medicine，Sweden）；微透析探針（CMA／12，3 mm，20 kD，Carnegie Medicine，Sweden）。

1．2 MTLE模型鼠構(gòu)建及腦組織Pgp表達檢測

1．2．1 MTLE模型鼠構(gòu)建步驟腹腔注射氯化鋰（127．2 mg／kg，63．6 mg／mL）；18～24 h后腹腔注射東莨菪堿（1 mg／kg，0．5 mg／mL）；之后30 min，腹腔注射匹羅卡品（30 mg／kg，15 mg／mL）；當大鼠出現(xiàn)RacineⅣ／Ⅴ發(fā)作持續(xù)90 min后腹腔注射地西泮注射液（10 mg／kg，5 mg／mL）終止發(fā)作。記錄發(fā)作期及發(fā)作間期的相關(guān)資料。

1．2．2 發(fā)作評估方法觀察并記錄大鼠急性期及慢性期發(fā)作的情況，按Racine標準［8］進行分級。

1．2．3 大鼠腦組織中Pgp表達的檢測具體參見前期工作［9］。

1．3 TQD應用于MTLE模型鼠的藥代動力學改變

1．3．1 活體微透析檢測大鼠腦中PHT濃度

1．3．1．1 微透析探針局部立體定位前囟后5．2 mm，左側(cè)5．0 mm，深度為前囟下7．5 mm（腹側(cè)海馬）［10］。

1．3．1．2 微透析步驟探針穩(wěn)定2 h后給藥，PHT組（n＝6）及PHT＋TQD組（n＝5）分別一次性靜脈給PHT 35 mg／kg、PHT（35 mg／kg）＋TQD（PHT給藥前30分鐘靜脈給予TQD 15 mg／kg）。分別于給藥后30 min、60 min、120 min、180 min、240 min和300 min取血。收集相應時間段的微透析液。微透析實驗后心臟灌注，斷頭取腦，多聚甲醛固定，蔗糖脫水，OCT膠包埋，海馬冠狀切片（10 μm）。

1．3．2 高效液相色譜法檢測PHT濃度具體參見前期工作［10］。

1．4 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2．1 MTLE模型鼠腦中Pgp表達

MTLE模型鼠在海馬CA1、CA3及DG區(qū)上均有Pgp的表達，較正常大鼠腦組織中Pgp的表達明顯上調(diào)（P＜0．05），見圖1。

圖1 MTLE模型鼠及正常大鼠的海馬組織DG、CA1及CA3區(qū)中Pgp的表達情況

圖示為免疫組化圖片顯示模型鼠與正常鼠海馬區(qū)（高倍鏡×400）Pgp的表達情況。棕褐色顆粒染色面積反映各組海馬區(qū)Pgp的表達程度，兩組之間均有顯著性差異（P＜0．05）。圖中A、B、C為MTLE模型鼠，而E、F、G為正常大鼠。

2．2 TQD應用于MTLE模型鼠的藥代動力學改變

2．2．1 腦微透析液PHT濃度給藥后60 min，兩組在該時間點均為檢測的最高藥物濃度，之后逐漸下降，兩組PHT濃度上升及下降速率一致。兩組在30 min、60 min、120 min和180 min其腦微透析液中藥物濃度差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0．05）；但在給藥后240 min和300 min，PHT＋TQD組略高于PHT組，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0．05）。見表1。

2．2．2 血漿中PHT濃度給藥后30 min，兩組在該時間點均為檢測的最高濃度，之后逐漸下降，但PHT＋TQD組較PHT組藥物濃度下降速度較迅速。兩組在30 min、60 min、120 min和240 min其外周血中藥物濃度差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0．05）；但在180 min及300 min時間段，PHT＋TQD組血漿中藥物濃度比PHT組低，組間差異有統(tǒng)計學意義（P＜0．05）。見表1。

表1 兩組模型鼠不同時間點的腦微透析液和血漿藥物濃度比較（±s）

表1 兩組模型鼠不同時間點的腦微透析液和血漿藥物濃度比較（±s）

注：與PHT+TQD組比較，*P<0.05，差異具有統(tǒng)計學意義。

腦微透析液PHT濃度（μg/mL）血漿PHT濃度（μg/mL）時間PHT+TQD組PHT組PHT+TQDPHT組組30min3.63±0.952.26±0.39*19.33±2.5019.21±2.04 60min4.58±1.043.03±0.67*16.61±2.7615.78±2.42 120min4.13±0.852.75±0.74*11.29±2.4113.27±1.61 180min3.51±0.782.42±0.72*9.08±2.5212.15±1.39*240min3.18±0.862.21±0.658.57±2.0710.81±2.10 300min2.74±0.631.94±0.607.33±2.6910.56±1.85*

2．2．3 腦中PHT分布兩組模型鼠的腦／血漿的時間藥物濃度曲線的AUC比值之間有顯著性差異（P＜0．05），即藥物在腦內(nèi)的分布高低情況為PHT＋TQD組＞PHT組（圖2）。

3 討論

多藥轉(zhuǎn)運體過表達學說在耐藥性癲癇的形成中具有重要意義。本研究在MTLE（常見的耐藥性癲癇類型）模型鼠腦中檢測到多藥轉(zhuǎn)運體蛋白（Pgp）過表達，當給予Pgp抑制劑TQD時能顯著增加AEDs在模型鼠腦中的分布。

圖2 腦／血漿的時間藥物濃度曲線的AUC比值的比較

圖示為兩組模型鼠的腦／血漿的時間藥物濃度曲線的AUC比值，兩組之間具有顯著性差異（P＜0．05），即PHT＋TQD組（0．31±0．06）＞PHT組（0．19±0．06）。

耐藥性癲癇出現(xiàn)藥物耐受是由于中樞神經(jīng)系統(tǒng)中多藥轉(zhuǎn)運體如Pgp過度表達，減少了Pgp底物如AEDs在癲癇灶的濃度，導致耐藥出現(xiàn)。1995年Tishler等［11］首先證實耐藥性癲癇患者腦內(nèi)Pgp表達顯著高于正常人腦組織。之后的研究也發(fā)現(xiàn)，在耐藥性癲癇患者病灶處可見Pgp過表達，并伴有腦內(nèi)AEDs濃度下降［12］。本研究已證實MTLE模型鼠海馬椎體細胞層的神經(jīng)元上Pgp表達增高。除此之外，Volk和Loscher提出杏仁核電點燃模型鼠中，苯巴比妥耐藥模型鼠的腦中Pgp表達水平也高于苯巴比妥反應組［5］。這些研究結(jié)果均證實耐藥與腦中Pgp表達增高有關(guān)［13］。由此推測由于癲癇發(fā)作導致Pgp過表達，增強藥物主動外向轉(zhuǎn)運，使到達致癇灶的藥物濃度不足，導致癲癇發(fā)作不能控制。頻繁的癲癇發(fā)作將導致Pgp的持續(xù)過度表達，從而形成一個惡性循環(huán)，最終導致耐藥性癲癇形成。

而本研究結(jié)果證實TQD可提高耐藥模型鼠腦中PHT濃度，該結(jié)果進一步反面支持多藥轉(zhuǎn)運體與癲癇耐藥的密切關(guān)系。TQD是目前所知的最有效的、高選擇性的Pgp第三代拮抗劑。多項研究發(fā)現(xiàn)TQD可提高多種耐藥細胞系對藥物的敏感性，支持TQD具有逆轉(zhuǎn)Pgp過表達導致的耐藥作用［14－15］。有研究記錄大鼠維拉帕米（VPM是Pgp的底物）給藥前和給藥后合并使用TQD 15 mg／kg的PET圖像，結(jié)果TQD增加約12倍的VPM體積分布［16］。此外，研究者van Vliet等［17］報道合并使用12或24 mg／kg的TQD能顯著提高PHT的抗癲癇效果。因此，15 mg／kg的TQD劑量作為本研究的實驗劑量是由早期對耐藥性動物模型鼠的研究證實的，而更高劑量的TQD劑量未能對抗癲癇藥物的治療產(chǎn)生更好的效用，反而會增加其副作用［7］。盡管本研究采用活體微透析技術(shù)證實了TQD提高AEDs在腦中的分布，甚至在給藥120 min后，當PHT＋TQD組血中PHT濃度低于PHT組時，PHT＋TQD組腦中PHT濃度仍明顯高于PHT組，但TQD是否影響其他臟器AEDs濃度水平并不清楚，因此可以進一步在本研究基礎(chǔ)上觀察TQD在增加腦中PHT濃度的同時在其他臟器的藥物濃度來觀察其毒副作用，提供TQD治療耐藥性癲癇更為詳細、全面的理論基礎(chǔ)。

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（責任編輯：常海慶）

Effects of Tariquidar for Targeting Phenytoin into the Brain of MTLE Rat Model

FANG Ziyan1,GUO Caifeng1,WU Fengchun1,QIN Jiaming2,NING Yuping1*,ZHOU Liemin2*
(1Department of Neurology,the Affiliated Brain Hospital of Guangzhou Medical University/Guangzhou Huiai Hospital,Guangzhou 510370,China;2Department of Neurology,the First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University,Guangzhou 510080,China;*

s:NING Yuping,E-mail:ningjeny@126.com;ZHOU Liemin,E-mail:lmzhou56@163.com)

ObjectiveIn order to evaluate that whether TQD has the ability of targeting of antiepileptic drug phenytoin into the brain with overexpression of Pgp in a model of mesial temporal lobe epilepsy(MTLE)rat.MethodsThe rats model of mesial temporal lobe epilepsy(MTLE)were induced bylithium-pilocarpine,which were divided into two groups with PHT and PHT+TQD treatment,respectively. Dialysate samples were collected by microdialysis technology,and the analysis of samples was performed by high performance liquid chromatography(HPLC).Immunohistochemistry assay was performed for Pgp expression at the hippocampus.The comparisons were carried out by t-test or Wilcoxon test.ResultsThe Pgp immunopositive area was significantly higher in the hippocampus of MTLE rats when compared to the normal rats(P＜0.05).The significantly increased area under the curve(AUC)ratio of brain/plasma in PHT+TQD drug group was 0.31±0.06,when compared with PHT drug group(0.19±0.06),P＜0.05.ConclusionsTQD can significantly distribute PHT into brain with overexpressed Pgp in MTLE rat model.

MTLE;Pilocarpine;P-glycoprotein;Tariquidar;Drug-resistant epilepsy

R-332；R742．1

A

10．3969/j．issn．1674-4659．2017．06．0762

2016－12－23

2017－03－24

國家自然科學基金面上項目（81071050；81571333）；廣州市醫(yī)藥衛(wèi)生科技項目（20171A011268；20161A011036）；廣州市科技計劃科技型中小企業(yè)創(chuàng)新－初創(chuàng)項目（2017010160496）；廣州市腦科醫(yī)院廣州市醫(yī)學重點學科建設(shè)項目子項目（GBH2014－QN03）

方子妍（1985－），女，江西南昌人，博士學位，主治醫(yī)師，主要從事癲癇等神經(jīng)系統(tǒng)疾病的研究。

*通訊作者：寧玉萍，E－mail：ningjeny＠126．com；周列民，E－mail：lmzhou56＠163．com。