趙銀麗王金榮蘇蘭利

(河南工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院,河南鄭州450001)

核酸適配體比色法在抗生素殘留快速檢測中的應(yīng)用

趙銀麗王金榮蘇蘭利

(河南工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院,河南鄭州450001)

傳統(tǒng)的抗生素殘留快速檢測方法主要是以抗體為核心試劑的免疫學(xué)方法,免疫學(xué)檢測方法靈敏度好、操作簡單快速。但是,抗體的獲得需要多次免疫動物或(和)細(xì)胞培養(yǎng),制備周期一般比較長,實(shí)驗(yàn)成本相對也較高。另外,抗體長期儲存可能會影響效價(jià)。核酸適配體是從隨機(jī)序列中篩選出來的一段單鏈寡聚核酸,適配體與靶分子之間的分子識別與抗體極為相似,但適配體比抗體具有更高的特異性,在常溫下較穩(wěn)定,不像抗體那樣隨著溫度的變化容易降解。本文對基于核酸適配體的膠體金比色法在抗生素殘留快速檢測中的應(yīng)用做一介紹。

核酸適配體;比色法;快速檢測;抗生素

食品質(zhì)量安全狀況可以反映一個(gè)國家的經(jīng)濟(jì)發(fā)展水平和人民生活的質(zhì)量。而動物源性食品中抗生素的殘留，可以通過食物鏈影響人類的健康。比如細(xì)菌的耐藥性問題，尤其是人畜共用的抗生素給人類健康帶來的威脅。世界各國對動物源性食品中的重要抗生素的殘留量都有嚴(yán)格的限量標(biāo)準(zhǔn)。所以，加強(qiáng)對動物源性食品中的抗生素殘留的檢測是非常必要的。

1 傳統(tǒng)的免疫學(xué)快速檢測方法在抗生素殘留檢測中的應(yīng)用

傳統(tǒng)的抗生素殘留快速檢測方法主要是基于抗體的免疫學(xué)方法。免疫學(xué)方法靈敏度高，耗時(shí)也較短，樣品的前處理相對簡單，可以滿足快速篩查的需求。氧氟沙星和恩諾沙星均屬于氟喹諾酮類抗生素，Tochi，BN等分別利用抗氧氟沙星的單克隆抗體和抗恩諾沙星的單克隆抗體，建立了分別檢測牛奶和肉制品中氧氟沙星和恩諾沙星的酶聯(lián)免疫吸附分析（ELISA）方法，檢測的靈敏度較高，半數(shù)抑制濃度分別為1.17ng/ml和0.15ng/ml，可以滿足國家對氧氟沙星和恩諾沙星的檢測要求。甲砜霉素和氟苯尼考同屬氯霉素類抗生素，氟苯尼考又稱氟甲砜霉素。An，LL等利用單克隆抗體，建立了同時(shí)檢測甲砜霉素和氟苯尼考的ELISA 方法，檢測的靈敏度高，可以實(shí)現(xiàn)動物源性食品中甲砜霉素和氟苯尼考的快速檢測。泰樂菌素和替米考星同屬大環(huán)內(nèi)酯類抗菌素，Song，YH利用單克隆抗體建立了同時(shí)檢測泰樂菌素和替米考星的免疫試紙法，檢測試紙對泰樂菌素和替米考星的檢測限分別為10 ng/ml和20ng/ml。四環(huán)素、土霉素、金霉素 同屬于四環(huán)素類抗生素，Chen，YN利用單克隆抗體建立了同時(shí)檢測四環(huán)素、土霉素、金霉素的免疫層析試紙法，方法的靈敏性可以滿足檢測的要求?？敲顾睾蛻c大霉素都屬于氨基糖苷類抗生素。He，JX分別利用抗卡那霉素、抗慶大霉素的雞卵黃抗體（IgY）建立了分別檢測卡那霉素和慶大霉素的ELISA方法?？敲顾谽LISA 的半數(shù)抑制濃度為4.48ng/ml，慶大霉素ELISA的半數(shù)抑制濃度為2.69ng/ml。方法的靈敏性均可以滿足檢測的需要。

免疫學(xué)快速檢測法的建立需要制備抗體，抗體的制備需要免疫動物和細(xì)胞培養(yǎng)。免疫動物需要多次免疫才能保證較高的效價(jià)水平，所以制備周期一般比較長，實(shí)驗(yàn)成本相對也較高。另外，抗體長期儲存可能會影響效價(jià)。核酸適配體與靶分子之間分子識別功能與抗體極為相似，但適配體作用的靶分子范圍極廣；比抗體具有更高的特異性；親和力更高，變性復(fù)性快速可逆、易功能化修飾與標(biāo)記等諸多優(yōu)點(diǎn)。另外，核酸適配體在常溫下較穩(wěn)定，不像抗體那樣隨著溫度的變化容易降解。核酸適配體穩(wěn)定性好、容易體外合成、成本相對較低等優(yōu)勢為其在檢測中的應(yīng)用提供了可能。

2 核酸適配體比色法的原理

核酸適配體是從隨機(jī)序列中篩選出來的一段單鏈寡聚核酸，能特異性地結(jié)合蛋白質(zhì)、有機(jī)物小分子、金屬離子等各種配體。適配體是通過指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化（SELEX）技術(shù)，從大容量的隨機(jī)寡核苷酸序列庫（1013～1015）中篩選獲得。大容量的分子文庫幾乎涵蓋了所有可能的立體構(gòu)象，理論上可以針對任何靶分子篩選得到其特異性識別的適配體序列。

適配體比色法檢測原理是基于納米金溶液在高濃度 NaCl 的作用下產(chǎn)生凝聚而造成的顏色變化，見圖1。金納米粒子由于其獨(dú)特的屬性在生物傳感器中被廣泛應(yīng)用，如良好的生物相容性，容易結(jié)合生物分子，表面積大等?；诮鸺{米粒子聚集為基礎(chǔ)的適配體比色法，結(jié)果肉眼可見。納米金一般經(jīng)由檸檬酸三鈉還原氯金酸制備而成，納米金表面覆蓋一層檸檬酸，顆粒之間通過靜電排斥作用保持膠體金溶液的穩(wěn)定性，如果在溶液中加入高濃度的鹽，即可破壞膠體溶液的穩(wěn)定性，納米金發(fā)生凝聚，溶液顏色由紅變藍(lán)。而單鏈 DNA在自由狀態(tài)下通過堿基和納米金表面的負(fù)電荷發(fā)生靜電作用而直接吸附到金表面，吸附有單鏈適配體 DNA的納米金在高鹽濃度下仍可以保持穩(wěn)定。當(dāng)溶液中存在靶分子時(shí)，適配體與靶標(biāo)分子特異性結(jié)合從而與膠體金解吸附，表面沒有吸附 DNA 的納米金在加入高濃度鹽后發(fā)生凝聚，溶液由紅變藍(lán)。適配體比色法通過靈敏的顏色變化檢測有無靶標(biāo)分子的存在，該方法靈敏特異、肉眼清晰可見，非常適合快速檢測。另外，溶液顏色的變化與靶標(biāo)分子的濃度之間存在一定的相關(guān)性，見圖2，所以可以利用分光光度計(jì)對溶液的吸光值進(jìn)行測定，也可以半定量靶標(biāo)分子的濃度?；诤怂徇m配體的膠體金比色法作為快速檢測的手段應(yīng)用于抗生素殘留的檢測中，具有非常重要的實(shí)用價(jià)值。

圖1 基于適配體和納米金的比色法檢測原理

圖2 靶標(biāo)濃度與顏色的相關(guān)性

3 核酸適配體比色法在抗生素檢測中的應(yīng)用

磺胺二甲氧嘧啶做為抗菌劑，在動物疾病的預(yù)防和治療中被加以應(yīng)用，但是，藥物的不合理使用往往對帶來負(fù)面的效應(yīng)。Ailiang Chen 等利用核酸適配體和膠體金，建立了檢測磺胺二甲氧嘧啶的適配體比色法。檢測靈敏度可以通過優(yōu)化幾個(gè)關(guān)鍵參數(shù)來實(shí)現(xiàn)。比如改變適配體、鹽和金納米粒子的濃度；改變納米金溶液的pH值。得到較好的檢測效果，檢測限為50ng/ml，低于殘留限量（MRL）（100ng/ml）。適配體比色法是一種非常簡單、快速、高靈敏度的分析方法，尤其適用于現(xiàn)場檢測。Yeon Seok Kim等利用適配體和膠體金建立了一種檢測土霉素的的比色傳感器，并且此比色傳感器對土霉素有高度的靈敏性和特異性，可以區(qū)分強(qiáng)力霉素和四環(huán)素。由于靶標(biāo)與適配體的特異性結(jié)合，從而使吸附在膠體金上的核酸適配體被解吸附，進(jìn)而失去核酸適配體保護(hù)的膠體金在高鹽濃度下不再穩(wěn)定，發(fā)生凝聚引起顏色的變化。通過對膠體金、核酸適配體、NaCl等參數(shù)的優(yōu)化，得到靈敏性的檢測效果?？敲顾?，屬于氨基糖苷類抗生素，可以殺死或抑制病原微生物，在飼養(yǎng)動物的感染性疾病種被廣泛應(yīng)用?？股氐膽?yīng)用應(yīng)該嚴(yán)格遵守一定的規(guī)則，比如劑量、休藥期等。如果不合理的濫用，將會產(chǎn)生嚴(yán)重的負(fù)面效應(yīng)，比如引起細(xì)菌的耐藥性，促進(jìn)超級細(xì)菌的出現(xiàn)?？敲顾卦趧游镌葱允称分械臍埩敉ㄟ^食物鏈，可以對人類的健康造成威脅，比如聽覺的損傷和對腎臟的毒性。因此，合理使用抗生素、檢驗(yàn)食品中是否含有抗生素的殘留，是非常重要和有意義的食品安全問題。Kyung-Mi Song等篩選到了結(jié)合卡那霉素的核酸適配體，采用還原法制備了膠體金。利用膠體金和核酸適配體建立了檢測卡那霉素的比色法。方法的靈敏性高，最低檢測限為25 nM，低于國家的最低檢測限。膠體金適配體比色法簡單易行，肉眼可見，操作簡單容易，非常適合快速檢測，是較為理想的大規(guī)模樣本檢測和現(xiàn)場檢測方法。

4 小結(jié)

適配體比色法檢測的原理是基于納米金溶液在高濃度 NaCl的作用下能夠凝聚，從而造成溶液的顏色變化。而核酸適配體在合適的高鹽濃度下可以穩(wěn)定金納米粒子，納米金溶液仍可以保持紅色。當(dāng)向溶液中加入靶標(biāo)分子后，由于靶標(biāo)與適配體的結(jié)合又引發(fā)金納米粒子的聚集，產(chǎn)生紅色到藍(lán)色的顏色變化。這種顏色變化肉眼可見，并且在多種生物分子的檢測中，都表現(xiàn)了高的靈敏度。高靈敏性、實(shí)驗(yàn)操作的簡單易行性和實(shí)驗(yàn)結(jié)果的快速可見性，適配體比色法的諸多優(yōu)點(diǎn)，決定其是一種非常適合基層單位對有害物的檢測。作為常規(guī)分析方法也是一個(gè)很好的選擇。

[1] Tochi BN，Peng J，Song SS，et al. Production and application of a monoclonal antibody（mAb）against ofloxacin in milk，chicken and pork[J].Food and Agricultural Immunology，2016，27（5）：643-656.

[2] Tochi BN， Khaemba G，Isanga J，et al. Monoclonal antibody for the development of specific immunoassays to detect Enrofloxacin in foods of animal origin[J].Food and Agricultural Immunology，2016，27（4）：435-448.

[3] An LL，Wang YL，Pan YH，et al. Development and Validation of a Sensitive Indirect Competitive Enzyme-Linked Immunosorbent Assay for the Screening of Florfenicol and Thiamphenicol in Edible Animal Tissue and Feed[J].Food Analytical Methods，2016，9（9）：2434-2443.

[4] Song YH，Song SS，Liu LQ， et al. Simultaneous detection of tylosin and tilmicosin in honey using a novel immunoassay and immunochromatographic strip based on an innovative hapten[J].Food and Agricultural Immunology，2016，27（3）：314-328.

[5] Chen YN， Kong DZ， Liu LQ， et al. Development of an ELISA and Immunochromatographic Assay for Tetracycline，Oxytetracycline，and Chlortetracycline Residues in Milk and Honey Based on the Class-Specific Monoclonal Antibody[J].Food Analytical Methods，2016，9（4）：905-914.

趙銀麗（1973—），女，副教授，博士，主要從事獸藥殘留檢測方法的研究。

名稱及編號：河南省科技攻關(guān)項(xiàng)目（152102210263）