林檢生，楊 奔，陳 安，吳 丹，胡兆勇，喻 嶸*，譚 勁*

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙 410208；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，湖南 長沙 410007）

聚酰胺-胺對大鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響

林檢生1，楊 奔1，陳 安1，吳 丹2，胡兆勇1，喻 嶸1*，譚 勁2*

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙 410208；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，湖南 長沙 410007）

目的研究聚酰胺-胺（poly-amidoamine,PAMAM）對大鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響。方法采用CCK-8試劑盒檢測PAMAM對巨噬細(xì)胞的細(xì)胞毒性。通過巨噬細(xì)胞吞噬印度墨汁實驗和吞噬雞紅細(xì)胞實驗，觀察PAMAM對巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響。采用掃描電子顯微鏡（SEM）觀察巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞的形貌。結(jié)果0.1-10 mg/mL的G5 PAMAM-NH2和 10 mg/mL的 G4.5 PAMAM-COOH 對巨噬細(xì)胞有毒性（P＜0.05）。0.01 mg/mL的 G5 PAMAM-NH2、G4.5 PAMAM-COOH、G5 PAMAM-OH對巨噬細(xì)胞均無毒性（P＞0.05）。0.01 mg/mL的 PAMAM對巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞形貌、吞噬率和吞噬指數(shù)均無影響（P＞0.05）。結(jié)論P(yáng)AMAM的濃度在0.01 mg/mL范圍內(nèi)，未觀察到其對大鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能有影響。

聚酰胺-胺；巨噬細(xì)胞；吞噬功能

聚酰胺-胺（poly-amidoamine,PAMAM），是一種具有高度支化、對稱、呈輻射狀的經(jīng)典生物醫(yī)用高分子材料[1]。由于它獨(dú)特的結(jié)構(gòu)和功能，被廣泛的應(yīng)用到生物醫(yī)藥研究領(lǐng)域，如在口腔醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，用于牙體硬組織仿生礦化的模板[2]；作為蛋白載體，形成聚合物PAMAM-RGD，研究它對牙髓細(xì)胞的礦化能力和成牙潛能[3]。

然而，PAMAM作為一種醫(yī)用材料，進(jìn)入機(jī)體后，不可避免的會與宿主接觸，產(chǎn)生各種反應(yīng)。因此，PAMAM的生物相容性值得我們了解。有研究報道PAMAM對血液中紅細(xì)胞形貌、血小板的凝血功能以及纖維蛋白結(jié)構(gòu)和構(gòu)象的影響[4]。此外，PAMAM表面所帶的官能團(tuán)不同，它的細(xì)胞毒性也不一樣[5]。有研究報道，口腔黏膜下纖維化與虛瘀痰毒有關(guān)[6]。

但是，關(guān)于PAMAM對免疫細(xì)胞的研究極少，這可能與免疫系統(tǒng)的復(fù)雜性有關(guān)。PAMAM應(yīng)用于中醫(yī)基礎(chǔ)研究和臨床的研究甚少。在本研究中，選用了大鼠腹腔巨噬細(xì)胞作為研究對象，末端分別帶有氨基（-NH2）、羧基（-COOH）、和羥基（-OH）的第 5代PAMAM作為研究材料。探索PAMAM在安全濃度范圍內(nèi)，對大鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響。為PAMAM安全應(yīng)用于口腔醫(yī)學(xué)領(lǐng)域提供重要數(shù)據(jù)。為牙科仿生材料的優(yōu)化設(shè)計打下基礎(chǔ)。為PAMAM在中醫(yī)基礎(chǔ)研究和臨床研究提供新思路。

1 材料

1.1 動物

健康雄性SD大鼠20只，體質(zhì)量200～250 g，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心提供，動物許可證號：SYXK（湘）2013-0005。健康雞購自長沙市菜市場。

1.2 藥物

PAMAM （WeihaiCY DendrimerTechnology Co.,Ltd 中國）用無血清的RPMll640培養(yǎng)基溶解。G5 PAMAM-NH2 （編號：CYD-150A）、G4.5 PAMAM-COOH （編號：CYD-145C）、G5 PAMAM-OH（編號：CYD-150H）。

1.3 試劑

RPMll640培養(yǎng)液（HyClone美國），胎牛血清（Hy-Clone美國），胰酶（HyClone美國）。CCK-8檢測試劑盒（同仁化學(xué)所日本），墨汁（Sigma-Aldrich美國）。

1.4 儀器設(shè)備

酶標(biāo)儀 （Thermo Fisher 芬蘭），CO2培養(yǎng)箱（Heraeus 德國），掃描電子顯微鏡（Philips XL-30，Holand）。

2 方法

2.1 大鼠腹腔巨噬細(xì)胞的分離、培養(yǎng)

取健康雄性SD大鼠20只，脫頸處死，75%酒精浸泡5 min后，在大鼠腹部注入無血清RPMll640培養(yǎng)液10 mL，輕揉腹部5 min后，無菌條件下吸取腹腔液于離心管中，以1 000 r/min離心5 min，棄上清，重懸、洗滌3次。用含10%胎牛血清RPMll640完全培養(yǎng)液重懸巨噬細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶中，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中。培養(yǎng)3 h后換液，去掉未貼壁的細(xì)胞，胰酶消化貼壁的細(xì)胞，收集細(xì)胞，用RPMll640完全培養(yǎng)液重懸細(xì)胞。根據(jù)需要調(diào)整細(xì)胞密度（1×104／cm2），分別接種于 96 孔板(0.2 mL/孔)和24孔板(1 mL/孔)細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)24 h。

2.2 PAMAM對大鼠腹腔巨噬細(xì)胞的毒性檢測及分組

采用CCK-8檢測試劑盒（同仁化學(xué)所 日本）檢測PAMAM對巨噬細(xì)胞的細(xì)胞毒性。實驗中PAMAM用無血清的RPMll640培養(yǎng)基溶解。實驗組為G5 PAMAM-NH2、G4.5 PAMAM-COOH、G5 PAMAM-OH處理組，往96孔板中加入PAMAM溶液 （100 μL/孔），濃度依次為 0.01 mg/mL、0.1 mg/mL、1.0 mg/mL、10 mg/mL?？瞻讓φ战M加入無血清RPMll640培養(yǎng)基（無細(xì)胞），對照組加入無血清RPMll640培養(yǎng)基（有細(xì)胞）。每組平行重復(fù)8個孔。在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育24 h后，按照CCK-8檢測試劑盒中步驟操作，用酶標(biāo)儀）檢測450 nm處的OD值，統(tǒng)計分析細(xì)胞毒性。所得數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成細(xì)胞存活率，其計算公式如下：細(xì)胞存活率=（OD處理-OD空白）/(OD對照-OD空白)×100%。

2.3 巨噬細(xì)胞吞噬功能觀察

2.3.1 巨噬細(xì)胞吞噬墨汁 取接種到24孔板上的巨噬細(xì)胞，實驗組分別加入濃度均為0.01 mg/mL（此濃度對巨噬細(xì)胞未見毒性）的PAMAM溶液。對照組加入無血清RPMll640培養(yǎng)基，每組平行重復(fù)8個孔。在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育24 h后，將墨汁用RPMll640按1∶500稀釋后加入各孔中，每孔加2 μL，37℃孵育1 h。用PBS洗去未被吞噬的墨汁，在顯微鏡下觀察、記錄。

2.3.2 巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞 取健康雞紅細(xì)胞，制成0.2%的雞紅細(xì)胞懸液。實驗組分別加入濃度均為 0.01 mg/mL的 PAMAM溶液。放入 5%CO2、37℃的恒溫培養(yǎng)箱孵育24 h后。去除PAMAM溶液，向每孔中加入0.2%的雞紅細(xì)胞懸液2 mL，孵育1 h。用PBS洗3次去除未結(jié)合的雞紅細(xì)胞，于倒置顯微鏡下觀察計數(shù)巨噬細(xì)胞吞噬指數(shù)。計數(shù)后，用5 mmol/L的磷酸緩沖液處理細(xì)胞1 min，裂解與巨噬細(xì)胞結(jié)合的雞紅細(xì)胞，加入甲醇固定巨噬細(xì)胞，觀察、計數(shù)吞噬率。每個樣本計數(shù)200個巨噬細(xì)胞，計算公式[7]：吞噬指數(shù)=被吞噬的雞紅細(xì)胞/200個巨噬細(xì)胞；吞噬率=吞噬雞紅細(xì)胞的巨噬細(xì)胞數(shù)/200個巨噬細(xì)胞×100%。

2.3.3 巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化 取出巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞的培養(yǎng)板后，常規(guī)掃描電鏡樣品制作，用4%的多聚甲醛固定4 h，再梯度脫水70%、85%、95%、100%、100%后，噴金，使用 SEM 觀察，照片記錄。

2.4 統(tǒng)計學(xué)分析

所得數(shù)據(jù)用SPSS 20.0統(tǒng)計學(xué)軟件和Origin 8.0軟件進(jìn)行處理。多組計量資料的統(tǒng)計分析采用one-way ANOVA 分析方法，數(shù)據(jù)用“±s”表示，以P＜0.05為差異，有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果與分析

3.1 PAMAM對大鼠腹腔巨噬細(xì)胞的毒性檢測

CCK-8試劑盒檢測顯示 （圖 1A）：0.1～10 mg/mL的 G5 PAMAM-NH2對巨噬細(xì)胞具有細(xì)胞毒性；0.1～1 mg/mL的G4.5 PAMAM-COOH對巨噬細(xì)胞沒有毒性，10 mg/mL時產(chǎn)生細(xì)胞毒性；0.1～10 mg/mL的G5 PAMAM-OH對巨噬細(xì)胞沒有毒性。 0.01 mg/mL 的 G5 PAMAM-NH2、G4.5 PAMAM-COOH、G5 PAMAM-OH，對巨噬細(xì)胞都沒有細(xì)胞毒性（圖1B）。

圖1細(xì)胞毒性分析柱形圖

3.2 PAMAM對巨噬細(xì)胞吞噬功能觀察

3.2.1 吞噬墨汁實驗 吞噬印度墨汁的觀察顯示（圖2）：對照組（圖2A）中，部分巨噬細(xì)胞吞噬墨汁多，部分吞噬的少，有的甚至在顯微鏡下不易觀察；實驗組（圖2B/2C/2D）中，巨噬細(xì)胞的吞噬墨汁情況與對照組中相當(dāng)。

3.2.2 吞噬雞紅細(xì)胞實驗 吞噬雞紅細(xì)胞的結(jié)果顯示（表1）：與對照組相比較，實驗組中的吞噬率和吞噬指數(shù)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

3.2.3 掃描電子顯微鏡（SEM）下觀察 經(jīng)SEM觀察（圖3）顯示：對照組（圖3A）中，雞紅細(xì)胞為橢圓形、周圍厚中間薄，有的雞紅細(xì)胞正在被巨噬細(xì)胞吞噬；與對照組相比，實驗組（圖3B/3C/3D）中，巨噬細(xì)胞周圍也出現(xiàn)正在被吞噬的雞紅細(xì)胞，未見雞紅細(xì)胞聚集在巨噬細(xì)胞周圍而不被吞噬的現(xiàn)象（圖3B），未見雞紅細(xì)胞完全不被吞噬的現(xiàn)象（圖3C/3D）。

4 討論

圖2巨噬細(xì)胞吞噬墨汁電子顯微鏡觀察

PAMAM因末端所帶的官能團(tuán)不同，所表現(xiàn)的化學(xué)性能不同，表現(xiàn)的生物性能可能也有所不同[8]。巨噬細(xì)胞作為一種免疫細(xì)胞，是研究細(xì)胞吞噬、細(xì)胞免疫和分子免疫學(xué)的重要對象。PAMAM作為一種生物醫(yī)用材料，當(dāng)它們應(yīng)用與人體時，將會對免疫系統(tǒng)的各種成分發(fā)生怎樣的影響，這些問題都值得我們研究和探討。

CCK-8試劑盒檢測PAMAM對巨噬細(xì)胞的毒性結(jié)果顯示（圖1）：濃度在0.1-10 mg/mL范圍內(nèi)，對巨噬細(xì)胞的毒性依次為G5 PAMAM-NH2＞G4.5 PAMAM-COOH ＞G5PAMAM-OH。 PAMAM 對RAM264.7細(xì)胞的毒性，與PAMAM表面所帶的電荷有關(guān)，可能與細(xì)胞膜及細(xì)胞內(nèi)外的離子發(fā)生相互作用[9]。研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)濃度均為0.01 mg/mL時，三種PAMAM對巨噬細(xì)胞均無毒性。這為我們研究PAMAM對大鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響提供了重要數(shù)據(jù)。

表1巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞的結(jié)果 （±s）

表1巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞的結(jié)果 （±s）

組別 n吞噬率/%±s P吞噬指數(shù)±s P Control 8 60.94±2.81 3.24±0.34 G5 PAMAM-NH2 8 57.60±3.77 0.090 3.04±0.41 0.32 G4.5 PAMAM-COOH 8 58.31±5.06 0.167 2.94±0.45 0.12 G5 PAMAM-OH 8 58.50±3.73 0.198 2.94±0.39 0.15

圖3巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察（掃描電子顯微鏡×2000）

巨噬細(xì)胞吞噬功能檢測，結(jié)果表明：在安全濃度范圍內(nèi)，PAMAM對吞噬墨汁和吞噬雞紅細(xì)胞都沒有影響。SEM觀察結(jié)果表明：PAMAM對巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞的形貌沒有影響。根據(jù)我們以前的報道，PAMAM能夠改變γ-球蛋白的結(jié)構(gòu)和構(gòu)象[10]。因此，我們推測：G5 PAMAM-NH2與巨噬細(xì)胞的細(xì)胞膜之間產(chǎn)生靜電作用、G5 PAMAM-COOH能夠螯合巨噬細(xì)胞外面的陽離子、以及G5 PAMAM-OH與巨噬細(xì)胞間產(chǎn)生疏水作用等。這些相互作用在安全濃度范圍內(nèi)，不足以改變巨噬細(xì)胞上與吞噬相關(guān)蛋白的結(jié)構(gòu)和構(gòu)象，從而不會影響巨噬細(xì)胞的吞噬功能。

本研究結(jié)果顯示，PAMAM表面所帶的官能團(tuán)不同，對大鼠腹腔巨噬細(xì)胞的毒性也不一樣，依次為G5 PAMAM-NH2＞G4.5 PAMAM-COOH＞G5 PAMAM-OH。PAMAM的濃度在0.01 mg/mL范圍內(nèi)，對大鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能沒有影響。本研究不僅為PAMAM的安全應(yīng)用提供重要數(shù)據(jù)，而且為制備出結(jié)構(gòu)和性能理想的牙科仿生材料打下基礎(chǔ)。

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（本文編輯 楊 瑛）

Effect of Poly(amidoamine)on the Phagocytosis of Peritoneal Macrophages in Rats

LIN Jiansheng1,YANG Ben1,CHEN An1,WU Dan2,HU Zhaoyong1,YU Rong1*,TAN Jin2*
（1.Hunan University of Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410208,China;2.The First Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410007,China）

ObjectiveTo investigate the effect of poly(amidoamine),or PAMAM on the phagocytosis of peritoneal macrophage in rats.MethodsThe cytotoxicity of the PAMAM to the macrophage was detected by CCK-8 kit.The effect of PAMAM on the phagocytosis of the peritoneal macrophage was observed by the experiments of macrophages swallowing the India ink and chicken erythrocytes.The scanning electron microscope (SEM)was used to observe the morphology of the macrophage phagocytosis of chicken erythrocytes.ResultsThere was toxicity to the macrophages with the concentrations of 0.1-10 mg/mL G5 PAMAM-NH2 and the concentration of 10 mg/mL G4.5 PAMAM-COOH (P＜0.05).At the concentration of 0.01 mg/mL,all of the three kinds of the PAMAMs had no toxicity to the macrophages and had no effect on the morphology of the macrophage phagocytosis of chicken erythrocytes,the phagocytosis rate and index (P＞0.05).ConclusionIn the 0.01 mg/mL concentrations range,the PAMAMs have no effect on the phagocytosis of peritoneal macrophages in rats.

PAMAM;macrophages;phagocytosis

R446.6；R965.3

A

10.3969/j.issn.1674-070X.2017.07.008

本文引用：林檢生，楊 奔，陳 安，吳 丹，胡兆勇，喻 嶸，譚 勁.聚酰胺-胺對大鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響[J].湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2017，37（7）：726-729.

2016-12-25

國家自然基金項目（81373701）；湖南中醫(yī)藥大學(xué)青年教師科研基金項目（99820001-199）。

林檢生，男，碩士，助教，研究方向：生物材料與組織工程學(xué)。

*譚 勁，男，教授，博士研究生導(dǎo)師，E-mail：tanjinhn@aliyun.com；*喻 嶸，女，教授，博士研究生導(dǎo)師，E-mail：1208466238@qq.com。