顏佳博，鄧奕輝，廖俞強，李鈺佳，李定祥*

（湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙 410208）

基于RAGE/NF-κB/mTOR信號通路探討滋陰活血解毒方對AGEs誘導(dǎo)VEC損傷的干預(yù)作用

顏佳博，鄧奕輝，廖俞強，李鈺佳，李定祥*

（湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙 410208）

目的觀察滋陰活血解毒方對糖基化終末產(chǎn)物（advanced glycosylation end products，AGEs）誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細胞（human umbilical vein endothelial cell，HUVEC）損傷的影響及RAGE/NF-κB/mTOR信號通路的變化，探討該方對AGEs誘導(dǎo)靜脈內(nèi)皮細胞（vein endothelial cell，VEC）損傷的保護作用。方法培養(yǎng)的HUVEC細胞以100 mg/ml的AGEs誘導(dǎo)損傷，隨機分為7個組，除空白組外，其中3組分別加入RAGE抑制劑FPS-ZM1、NF-κB抑制劑PDTC和mTOR抑制劑雷帕霉素（RAP），余下3組加入各種抑制劑后加入50 mg/mL滋陰活血解毒方濃縮藥液。以western-blot法檢測RAGE和mTOR的表達，以免疫組化方法檢測NF-κB核轉(zhuǎn)移狀況。結(jié)果細胞添加AGEs后細胞內(nèi)出現(xiàn)異常增殖，細胞數(shù)量明顯增多，多數(shù)細胞變形皺縮，胞膜輪廓模糊，細胞內(nèi)出現(xiàn)粗糙樣顆粒變化；抑制劑組及抑制劑加中藥組都表現(xiàn)出不同程度的逆轉(zhuǎn)這種損傷的作用，特別是抑制劑加中藥組，見梭形正常細胞較多，圓縮形細胞減少。中藥加抑制劑組RAGE表達量比單純抑制劑組顯著降低（P＜0.01）;中藥加抑制劑組mTOR表達量比單純抑制劑組顯著降低(P＜0.01);中藥加抑制劑NF-κB的核轉(zhuǎn)移陽性檢測率比單純抑制劑組顯著降低（P＜0.01）。結(jié)論滋陰活血解毒方能降低AGEs對VEC的損傷，降低RAGE、NF-κ、mTOR的表達。

滋陰活血解毒方；AGEs；內(nèi)皮細胞損傷；RAGE；mTOR；NF-κB

近年來，糖尿病的發(fā)病率呈上升趨勢[1]，預(yù)防相關(guān)并發(fā)癥、延長患者壽命和提高患者生活質(zhì)量是糖尿病治療的主要目的[2]。長期糖尿病可導(dǎo)致晚期糖基化終末產(chǎn)物 (advanced glycation end products，AGEs）生成增加，AGEs與糖基化終末產(chǎn)物受體(receptor for advanced glycation end-products,RAGE)結(jié)合,并激活下游信號傳導(dǎo)途徑,促進糖尿病并發(fā)癥如動脈粥樣硬化、腎臟病變的發(fā)生與發(fā)展。RAGE/NF-κB/mTOR三條信號通路在糖尿病并發(fā)腦血管疾病中起到了關(guān)鍵性的作用[3-5]。滋陰活血解毒方在臨床上有廣泛應(yīng)用，并已得到證實，對糖尿病并發(fā)腦血管疾病有顯著療效[6-7]。本實驗以RAGE和mTOR的表達，和NF-κB核轉(zhuǎn)移狀況為觀察目標，研究滋陰活血解毒方對AGEs誘導(dǎo)靜脈內(nèi)皮細胞（vein endothelial cell，VEC）損傷的影響，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 主要儀器

SW-CJ-1FD型超凈工作臺 （蘇凈安泰公司）、752-P型紫外分光光度計（上?，F(xiàn)科儀器有限公司）、WD-9405A型脫色搖床（北京六一儀器廠）、DYY-6C型電泳儀 （北京六一儀器廠）、JY3002型電子天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司）等。

1.2 藥物與試劑

滋陰活血解毒方（由熟地黃20 g，黃芪30 g，枸杞子 12 g，山萸肉 12 g，黃連 10 g，地龍 12 g，丹參20 g，川芎 12 g，水蛭 8 g，石菖蒲 8 g 組成）藥材由湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥房提供。中藥用水浸泡30 min后，煎煮2次，每次30 min，將2次藥液混勻，濃縮成每毫升含生藥量1 g，PBS、透析袋、胰蛋白酶（solarbio）、D-無水葡萄糖、氨芐青霉素、硫酸慶大霉素（Amresco）、DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清（Hyclone）、吩嗪硫酸甲酯、人血清白蛋白、NF-κB抑制劑 PDTC （sigma）RAGE 抑制劑 FPS-ZM1、和mTOR抑制劑雷帕霉素RAP（selleck）。

1.3 細胞株

人臍靜脈內(nèi)皮細胞株HUVEC購于吉滿生物科技（上海）有限公司（貨號GM-070036H），復(fù)蘇后傳3～4代。

1.4 糖基化終末產(chǎn)物

體外制備AGEs-HSA，按糖孵育法進行孵育[8]。以1.75 g/L的人血清白蛋白 （Human Serum Albumin,HSA）在含100 mmol/L的D-葡萄糖、200 mg/L的青霉素、70 μg/L慶大霉素和1.5 mmol/L吩嗪硫酸甲酯（PMS）的磷酸緩沖液（100 mmol/L）中，于37℃孵育8周。以相同條件但不含葡萄糖的緩沖液孵育的HSA作為對照。孵育結(jié)束后以無菌的磷酸鹽緩沖液 （pH7.4）透析除去未結(jié)合的葡萄糖，用0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 細胞培養(yǎng)與分組

HUVE細胞復(fù)蘇后，將瓶中廢液吸出PBS沖洗兩遍，加入1 mL胰酶輕晃使胰酶覆蓋瓶底，至細胞回縮呈圓形，加入2 mL完全培養(yǎng)基（含10%胎牛血清）終止消化，輕輕吹打至全部脫落，加入15 mL離心管中，1 000 r/min、5 min離心。去上層清液后，加入2 mL完全培養(yǎng)基，吹打制成細胞懸液，加入2個培養(yǎng)瓶中，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。48 h換液1次，72 h傳代1次，連續(xù)傳四代后，選擇80%融合、生長良好的細胞進行試驗。根據(jù)前期研究，100 mg/mL的AGEs濃度能最大程度損傷細胞，加入100 mg/mL的AGEs于37°C、5%二氧化碳無菌培養(yǎng)箱中孵育，同時用顯微鏡觀察細胞形態(tài)，當(dāng)細胞出現(xiàn)收縮變圓，胞體變小，進行處理。將細胞隨機分為7組，一組為空白組，另外三組為抑制劑組：分別加入RAGE抑制劑FPS-ZM1、NF-κB抑制劑PDTC和mTOR抑制劑雷帕霉素（rapamycin，RAP），余下三組為中藥加相應(yīng)的抑制劑組：根據(jù)本實驗相關(guān)文獻資料[9]，加入上述抑制劑的同時加入50 mg/mL滋陰活血解毒方濃縮藥液。干預(yù)12 h后觀察指標。

1.6 各組HUVEC細胞的形態(tài)學(xué)觀察

在光學(xué)顯微鏡下，觀察各組細胞形態(tài)變化。

1.7 檢測 RAGE、mTOR、NF-κB

提取各組樣品后，嚴格按照試劑盒說明操作步驟，經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、孵育、顯色曝光后，以western-blot法檢測各組RAGE和mTOR的蛋白表達，用quantity one專業(yè)灰度分析軟件進行分析；將各組爬片經(jīng)沖洗、固定、再次沖洗、滅活內(nèi)源性酶、孵育、顯色、復(fù)染、脫水處理后，用中性樹膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察各組核轉(zhuǎn)移情況。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)使用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。所有數(shù)據(jù)以“±s”表示。多組間均數(shù)比較使用單因素方差分析；組間兩兩比較方差齊者LSO檢驗，方差不齊者用Dunnet T3檢驗。以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義，與空白組相比，P＜0.01表示差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)的觀察

光學(xué)顯微鏡下觀察，細胞添加AGEs前表現(xiàn)為梭形單層生長，鑲嵌排列，彼此不重疊，胞膜明顯，細胞明亮，融合后的細胞鏡下為單層鵝卵石狀排列；細胞添加AGEs后12 h細胞內(nèi)出現(xiàn)異常增殖，細胞數(shù)量明顯增多，多數(shù)細胞變形皺縮，胞膜輪廓模糊，細胞內(nèi)出現(xiàn)粗糙樣顆粒變化；抑制劑組及抑制劑加中藥組都表現(xiàn)出不同程度的逆轉(zhuǎn)這種損傷的作用，特別是抑制劑加中藥組，見梭形正常細胞較多，圓縮形細胞減少。結(jié)果見圖1。

圖1各組內(nèi)皮細胞形態(tài)光鏡圖（IHC染色×400）

2.2 各組 HUVEC中 RAGE、mTOR、NF-κB表達量對比

與空白組相比，各中藥加抑制劑RAGE、mTOR、NF-κB表達有顯著性差異（P＜0.01），與單純抑制劑組相比，各中藥加抑制劑組 RAGE、mTOR、NF-κB表達量有顯著性差異（P＜0.01）。結(jié)果見表1，圖2-4。

表1各組HuVEC細胞RAGE、mTOR灰度值及NF-κB 核轉(zhuǎn)移陽性率 （±s，n=5,%）

表1各組HuVEC細胞RAGE、mTOR灰度值及NF-κB 核轉(zhuǎn)移陽性率 （±s，n=5,%）

注：與空白組相比，*P＜0.01，與單純抑制劑組相比，△P＜0.01。

組別空白組FPS-ZM1組PDTC組RAP組中藥+FPS-ZM1組中藥+PDTC組中藥+RAP組F值P值RAGE 0.80±0.028 0.29±0.02*0.47±0.02*0.56±0.01*0.23±0.01*△0.36±0.01*△0.33±0.02*△1 186 0.00 mTOR 0.76±0.02 0.28±0.02*0.30±0.03*0.14±0.01*0.14±0.01*△0.20±0.01*△0.05±0.01*△1 952 0.00 NF-κB 30.19±0.021 19.29±0.005*17.96±0.013*24.23±0.010*15.02±0.003*△17.42±0.006*△14.42±0.007*△128 882 0.00

圖2各組HUVEC細胞RAGE表達電泳圖

圖3各組HUVEC細胞mTOR表達電泳圖

圖4各組HUVEC細胞NF-κB核轉(zhuǎn)移情況（IHC染色 ×400）

3 討論

糖尿病是一組由多病因引起的以慢性高血糖為特征的終身性代謝性疾病，是繼心腦血管、癌癥之后的嚴重危害人類健康的第三大疾病。歷代及現(xiàn)代醫(yī)家多數(shù)認為糖尿病的發(fā)病原因與飲食失節(jié)、勞欲過度、五志過極、先天稟賦不足有關(guān),近年來逐漸發(fā)展了脾虛論、腎虛論、肝郁論等。滋陰活血解毒方由熟地黃、黃芪、枸杞子、山茱萸、黃連、地龍、丹參、川芎、水蛭、石菖蒲組成，方中熟地黃、黃芪益氣健脾，滋陰養(yǎng)腎為君，臣以枸杞子，山萸肉滋補腎陰，佐以地龍、丹參、川芎、水蛭活血通絡(luò)，黃連清熱解毒，石菖蒲開竅化痰。諸藥并行，達到滋陰益氣活血解毒的功效，扶正祛邪并行，祛邪不傷正，扶正不留邪。本課題組前期大量研究發(fā)現(xiàn)，此方能能顯著改善糖尿病并發(fā)腦血管疾病患者的臨床癥狀，改善神經(jīng)功能缺損程度，提高生活質(zhì)量。

晚期AGEs可引起體內(nèi)組織一系列病理生理改變,是導(dǎo)致糖尿病慢性并發(fā)癥的重要致病因素。AGE受體（RAGE）存在于很多細胞表面，其與 AGE的結(jié)合可導(dǎo)致細胞內(nèi)氧化應(yīng)激和 NF-κB通路的激活。NF-κB及其下游細胞因子的激活在糖尿病大血管及微血管并發(fā)癥的發(fā)展中起重要作用。研究證實哺乳類雷帕霉素靶mTOR蛋白活化,引起下游信號分子的磷酸化及促細胞周期運轉(zhuǎn)因子的過度表達,誘發(fā)平滑肌細胞增殖。同時NF-κB與mTOR存在著復(fù)雜的交互作用。據(jù)此推斷AGE－RAGE/NF-κB/mTOR通路可能在糖尿病大血管并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展中具有重要意義。在糖尿病患者體內(nèi)，AGEs的含量與糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生及其嚴重程度呈正相關(guān)。AGEs可通過對細胞外基質(zhì)和血管壁產(chǎn)生直接作用，使血管壁增厚和血管通透性增加；也可通過與其受體RAGE結(jié)合，引起氧化應(yīng)激并激活多條細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[10]。本實驗從AGEs入手，通過對RAGE/NF-κB/mTOR信號通路及細胞形態(tài)學(xué)的研究，發(fā)現(xiàn)，加入100 mg/mL的AGEs后，細胞數(shù)量明顯增多，變形收縮，細胞內(nèi)出現(xiàn)粗糙樣顆粒變化，細胞異常增殖。細胞增生導(dǎo)致血管壁增厚，血管彈性降低，導(dǎo)致血管損傷。加入50 mg/mL的滋陰活血解毒方藥液后，VEC異常增殖有明顯改善。加入滋陰活血解毒方和僅加入抑制劑組對比，RAGE及mTOR蛋白表達有明顯降低（P＜0.01），NF-κB 核轉(zhuǎn)移陽性檢出率明顯降低（P＜0.01）。關(guān)于滋陰活血解毒方對于黏附分子及凝血相關(guān)因子相關(guān)研究，由本實驗同期實驗完成[11]。

綜上所述，滋陰活血解毒方能有效改善AGEs誘導(dǎo)VEC損傷，起到保護VEC的作用，特別是與抑制劑合用，能有顯著的效果。這種保護作用可能跟滋陰活血解毒方對于AGE－RAGE/NF-κB/mTOR信號通路的抑制作用有關(guān)。滋陰活血解毒方與AGERAGE/NF-κB/mTOR信號通路的抑制劑合用，為今后中西醫(yī)結(jié)合防治糖尿病并發(fā)腦血管疾病提供了一個研究方向與應(yīng)用前景。

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（本文編輯 楊 瑛）

Effect of Ziyin Huoxue Jiedu Decoction on VEC Injury Induced by AGEs Based on RAGE/NF-κB/mTOR Signaling Pathway

YAN Jiabo,DENG Yihui,LIAO Yuqiang,LI Yujia,LI Dingxiang*
(Hunan University of Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410208,China)

ObjectiveTo observe the effect of Ziyin Jiedu decoction on the damage of human umbilical vein endothelial cell (HUVEC)induced by AGEs and the change of RAGE/NF-κB/mTOR pathway,and to explore the protective effect of this prescription on AGEs-induced VEC injury.MethodsThe damage of HUVEC cells were induced by 100 mg/mL AGEs and randomly divided into seven groups.Three of these groups excepted blank group were added RAGE inhibitors FPS-ZM1,NF-κB inhibitor PDTC and mTOR inhibitor rapamycin (RAP)respectively,and the remaining three groups were treated with RAGE inhibitor FPS-ZM1,NF-κB inhibitor PDTC and mTOR inhibitor rapamycin (RAP)then added 50mg/mL concentrated Ziyin Huoxue Jiedu decoction to test.The expression of RAGE and mTOR was detected by Western-blot,and NF-κB nuclear translocation was detected by immunohistochemistry.ResultsThe cells added with AGEs show abnormalgrowth,such as metamorphosis and shrink cells,membrane with hazy outline,roughness particles,which increase obviously.with increased cells.Inhibitor group and inhibitor added with Chinese medicine group could reverse this lesion with different degree.Inhibitor added with Chinese medicine group showed manny fusiform normal cells and few round and shrink cells.The expression of RAGE in inhibitor added with Chinese medicine group showed an obvious increase than inhibitor group(P＜0.01).The expression of mTOR in inhibitor added with Chinese medicine group showed a significant increase than inhibitor group(P＜0.01).The positive detection rate of NF-κB drug-containing inhibitor was significantly lower than that of inhibitor group(P＜0.01).ConclusionZiyin Huoxue Jiedu decoction could reduce VEC damage induced by AGEs,and also could decrease the expression of RAGE,NF-κB,mTOR.

Ziyin Huoxue Jiedu decoction;AGEs;endothelial cell injury;RAGE;mTOR;NF-κB

R285.5；R587.1

A

10.3969/j.issn.1674－070X.2017.07.006

本文引用：顏佳博，鄧奕輝，廖俞強，李鈺佳，李定祥.基于RAGE/NF-κB/mTOR信號通路探討滋陰活血解毒方對AGEs誘導(dǎo)VEC損傷的干預(yù)作用[J].湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2017，37（7）：719-722.

2017-02-17

湖南省教育廳項目（16K063）；湖南省中醫(yī)藥科研基金（201606）；中西醫(yī)結(jié)合基礎(chǔ)湖南省重點學(xué)科資助。

顏佳博，女，在讀碩士研究生，研究方向：神經(jīng)內(nèi)科及內(nèi)分泌疾病研究。

* 李定祥，男，博士，副教授，碩士研究生導(dǎo)師，E-mail，ldxlzy@hotmail.com。