沈 慧，劉 文，姚小磊，楊志波*

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410005；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院，廣西 南寧 530011）

竹黃顆粒介導(dǎo)IL-22/miR-330調(diào)控角質(zhì)形成細(xì)胞增殖的機(jī)制研究

沈 慧1,2，劉 文1，姚小磊2，楊志波1*

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410005；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院，廣西 南寧 530011）

目的研究竹黃顆粒干預(yù)IL-22/miR-330調(diào)控角質(zhì)形成細(xì)胞增殖的分子機(jī)制。方法IL-22處理HaCaT和HKCs細(xì)胞,應(yīng)用QPCR技術(shù)檢測細(xì)胞中miR-330的表達(dá)變化；之后慢病毒感染HaCaT和HKCs細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)miR-330的過表達(dá)和干擾，通過CCK8和BrdU技術(shù)檢測細(xì)胞增殖情況；采用CCK8、Western blot、QPCR、ELISA實(shí)驗(yàn)分別檢測不同濃度竹黃顆粒處理HaCaT、HKCs后細(xì)胞增殖能力，IL-22蛋白表達(dá)水平，miR-330表達(dá)水平及細(xì)胞分泌IL-22含量的變化。結(jié)果IL-22處理后的HaCaT和HKCs細(xì)胞中miR-330的表達(dá)水平顯著下調(diào)（P＜0.01），而細(xì)胞增殖能力顯著提升（P＜0.01）；過表達(dá)miR-330后 HaCaT和HKCs細(xì)胞增殖能力顯著下降（P＜0.05），干擾 miR-330后 HaCaT和HKCs細(xì)胞增殖能力顯著上升（P＜0.05）；竹黃顆粒處理HaCaT、HKCs后，細(xì)胞增殖能力下降（P＜0.01），IL-22蛋白表達(dá)水平顯著下降（P＜0.01），miR-330表達(dá)水平顯著上升（P＜0.01），細(xì)胞分泌IL-22含量顯著下降（P＜0.01）。結(jié)論竹黃顆?？梢酝ㄟ^抑制IL-22的表達(dá)，促進(jìn)miR-330的表達(dá)，從而抑制角質(zhì)形成細(xì)胞增殖。

銀屑病；竹黃顆粒；IL-22；miR-330；角質(zhì)形成細(xì)胞

最早關(guān)于“銀屑病”的記載可見于隋代巢元方所著《諸病源候論》一書[1]，明代儒醫(yī)李梃在《醫(yī)學(xué)入口》中首度提出癬病的發(fā)生，是由于患者素有“血分熱燥”的內(nèi)在病因，以至“風(fēng)毒”之邪容易入侵“客于皮膚”，內(nèi)外相合而致病的特點(diǎn)[2]。明清醫(yī)籍中，對于本病病因病機(jī)的分析，諸位醫(yī)家依然秉持著：內(nèi)外因相互結(jié)合導(dǎo)致銀屑病發(fā)生的觀點(diǎn)，內(nèi)因主要責(zé)之患者血分病變。

白細(xì)胞介素22（IL-22）與銀屑病存在重要的關(guān)系，可以誘導(dǎo)角質(zhì)形成細(xì)胞釋放出一系列的細(xì)胞因子，如 IL-8、IL-23、IL-6、IL-21 等，炎癥因子的釋放可加劇炎癥反應(yīng)，進(jìn)一步促進(jìn)表皮層增殖以及棘層增厚[3]。多項(xiàng)研究結(jié)果表明銀屑病患者的外周血血清中IL-22的表達(dá)水平與銀屑病皮損區(qū)面積和病情嚴(yán)重程度指數(shù)呈現(xiàn)正相關(guān)[4-8]。Ma等[9]借助自體免疫性銀屑病模型進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)抗IL-22的抗體可以抑制角化細(xì)胞和上皮細(xì)胞分泌炎癥介質(zhì)。由此可見在銀屑病的發(fā)生發(fā)展過程中，存在炎癥因子的不斷釋放及炎癥反應(yīng)的持續(xù)發(fā)生，而在這一過程中IL-22起著關(guān)鍵的促進(jìn)作用，且其作用的靶點(diǎn)細(xì)胞是角質(zhì)形成細(xì)胞。miRNA是近年來科學(xué)家發(fā)現(xiàn)的具有生物學(xué)調(diào)控功能的一種非編碼小分子RNA。與銀屑病相關(guān)的miRNAs分子中，有一些是重要的生長發(fā)育調(diào)控因子，受到廣泛的關(guān)注和研究，如miR-203、miR-21、miR-146a和miR-125b等[10]。楊志波等[11]應(yīng)用miRNA及基因芯片技術(shù)并結(jié)合生物信息學(xué)預(yù)測技術(shù)，成功構(gòu)建了銀屑病相關(guān)miRNA與靶基因及基因功能調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，證明特異性表達(dá)的miRNA可以通過靶向結(jié)合而調(diào)節(jié)其靶基因的表達(dá)變化，并通過靶基因的功能進(jìn)一步調(diào)控銀屑病的發(fā)生及發(fā)展過程。之后進(jìn)一步補(bǔ)充和完善了前期構(gòu)建的銀屑病差異表達(dá)miRNA與靶基因及基因功能調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，預(yù)測了一批前期未研究過的miRNAs分子，miR-330就是預(yù)測的結(jié)果之一推測miR-330可能在銀屑病發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要功能。竹黃顆粒在臨床治療銀屑病中表現(xiàn)出較好的療效，且提取物可以抑制角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖。竹黃顆粒劑可以通過調(diào)節(jié)人體外周血中IL-6、TNF-a的表達(dá)水平來治療銀屑病[12]；還可以顯著降低血漿和銀屑病皮損組織中β-內(nèi)啡肽的含量，進(jìn)而抑制炎癥因子的產(chǎn)生[13]。已證實(shí)竹黃顆粒對銀屑病患者皮損組織中多個(gè)miRNAs分子具有顯著調(diào)節(jié)作用，如miR-192、miR-3175、miR-194、miR-18a、miR-21、miR-629、miR-25、miR-199a-5p、miR-100、miR-99a、miR-125b、miR-409-3p、miR-99b 等[14]。

本研究將進(jìn)一步驗(yàn)證竹黃顆粒與IL-22、miR-330之間的調(diào)控關(guān)系，以期為銀屑病的治療提供新的靶點(diǎn)及科學(xué)思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞

人角質(zhì)形成細(xì)胞HaCaT（HaCaT immortalized human epidermal cells）和 HKCs （human keratinocytes）細(xì)胞株均購自長沙贏潤生物技術(shù)有限公司。

1.2 主要試劑

二甲基亞砜購自Sigma公司；胎牛血清購自杭州四季青生物科技公司；RPMI 1640培養(yǎng)液購自Hyclon公司；LV-miR-330慢病毒、LV-miR-NC慢病毒、LV-anti-miR-330慢病毒、LV-anti-NC慢病毒購自YRBIO公司，GAPDH一抗、IL-22一抗購自Abcam公司；CCK8試劑盒購自Sigma公司。

竹黃顆粒劑由湖南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院制劑室生產(chǎn)，批號：20020921，規(guī)格：10 g/包，每包相當(dāng)于生藥含量6.25 g。主要成分為：淡竹葉、生石膏、黃芩、黃連、黃柏、梔子、漏蘆、水牛角、生地黃、柴胡、白芍、當(dāng)歸、黨參、麥冬、三七等。

1.3 細(xì)胞處理方法

1.3.1 細(xì)胞傳代培養(yǎng) 人角質(zhì)形成細(xì)胞HaCaT和HKCs分別在T25培養(yǎng)瓶中傳代培養(yǎng)，細(xì)胞培養(yǎng)箱參數(shù)設(shè)定為37℃、5%CO2、飽和濕度。用顯微鏡觀察細(xì)胞的生長狀態(tài)，貼壁細(xì)胞生長達(dá)80%融合度時(shí)，按細(xì)胞數(shù)目1∶3的比例進(jìn)行后續(xù)傳代培養(yǎng)。

1.3.2 IL-22處理細(xì)胞 將IL-22分別溶解于無菌水中，制備成 10 mg/mL的儲(chǔ)液，用 0.2 μm的細(xì)菌濾器在無菌環(huán)境下過濾除菌，于-20℃凍存。實(shí)驗(yàn)中根據(jù)每組細(xì)胞中具體的體積添加IL-22儲(chǔ)液使培養(yǎng)基終濃度為100 ng/mL，對照組加相同體積的無菌水。

1.3.3 慢病毒感染細(xì)胞 將HaCaT和HKCs細(xì)胞分別傳接種T25細(xì)胞瓶或96孔板中,于37℃ CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜,按 LV-miR-330、LV-miRNC、LV-anti-miR-330、LV-anti-NC 分組分別在各組細(xì)胞中以1×107TU滴度添加慢病毒 （按體積比1∶100 添加）。

1.3.4 竹黃顆粒處理細(xì)胞 竹黃顆粒溶解在RPMI1640培養(yǎng)液中，調(diào)節(jié) pH值至 7.0，用 0.2 μm細(xì)菌濾器過濾，制備成1 g/mL的儲(chǔ)液，于4℃保存。實(shí)驗(yàn)中根據(jù)每組細(xì)胞中具體的體積添加終濃度為10、20、40 mg/mL的竹黃顆粒溶液，對照組細(xì)胞中加相同體積的RPMI 1640培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)；根據(jù)后續(xù)實(shí)驗(yàn)的需求，在不同時(shí)間點(diǎn)收集各組細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)檢測。

1.4 檢測實(shí)驗(yàn)

1.4.1 QPCR（real-time quantitative PCR）實(shí)驗(yàn) 經(jīng)藥物或其它因子處理后48 h用胰酶消化收集細(xì)胞，PBS漂洗2遍；分別提取各組細(xì)胞中的總RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄獲得相應(yīng)的cDNA，最后制備QPCR反應(yīng)體系上機(jī)檢測。反應(yīng)程序設(shè)定為：95.0℃ 2 min；95.0 ℃ 15 s；61.0 ℃ 30 s；72.0 ℃ 20 s；然后讀取數(shù)值；運(yùn)行40個(gè)循環(huán)；95.0℃ 10 s；熔融曲線60.0℃至95.0℃；擴(kuò)增0.5℃ 5 s；最后讀取數(shù)值。根據(jù)Ct值，計(jì)算各基因相對表達(dá)量。

1.4.2 CCK8（cell couting kit-8）實(shí)驗(yàn) CCK8實(shí)驗(yàn)主要用于檢測細(xì)胞的增殖活力。將待測細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，24 h后向細(xì)胞培養(yǎng)版中添加藥物或因子，繼續(xù)培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)分組平行設(shè)置24 h、48 h和72 h三個(gè)時(shí)間點(diǎn)，到相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)向每孔細(xì)胞中加入10 μL CCK溶液，混勻后在37℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育4 h后，用多功能酶標(biāo)儀檢測各組樣品在490 nm處的吸光值。

1.4.3 BrdU（5-brano-2-deoxyuridine）實(shí)驗(yàn) BrdU實(shí)驗(yàn)主要用于檢測細(xì)胞的增殖。將待測細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，24 h后向細(xì)胞培養(yǎng)板中添加藥物或因子，繼續(xù)培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)分組平行設(shè)置24 h、48 h和72 h三個(gè)時(shí)間點(diǎn)，到相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)向每孔細(xì)胞中加入20 μL BrdU標(biāo)記液，繼續(xù)培養(yǎng)6 h，再分別加入Fix Denat使DNA變性，然后加100 μL HRP標(biāo)記的抗BrdU抗體，洗滌3次后加入100 μL TMB底物液顯色，靜置20 min后加H2SO4終止反應(yīng)并振蕩1 min，最后用多功能酶標(biāo)儀檢測各組樣品在450 nm處的吸光值。

1.4.4 Western blot實(shí)驗(yàn) 將待測細(xì)胞接種于T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，24 h后添加藥物或因子，繼續(xù)培養(yǎng)至 48 h，收集各組細(xì)胞并提取總蛋白進(jìn)行定量分析，制備蛋白電泳樣品進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，依次進(jìn)行轉(zhuǎn)膜-封閉-洗膜-雜交一抗-洗膜-雜交二抗-洗膜-顯影定影。選用GAPDH(甘油醛-3-磷酸脫氫酶)作為內(nèi)參分析目的蛋白的相對表達(dá)水平。

1.4.5 ELISA實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞處理及時(shí)間點(diǎn)與Western blot實(shí)驗(yàn)一致，48 h后收集細(xì)胞上清，2 000 r/min離心5 min除去細(xì)胞碎片，取上清用IL-22 ELISA檢測試劑盒測定IL-22蛋白含量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料用“±s”來表示，然后用Levene法進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)。兩個(gè)獨(dú)立樣本均數(shù)比較呈現(xiàn)正態(tài)分布的采用t檢驗(yàn)數(shù)據(jù)，非正態(tài)分布的則采用非參數(shù)Mann-Whitney檢驗(yàn)數(shù)據(jù)；多個(gè)獨(dú)立樣本均數(shù)的比較呈現(xiàn)正態(tài)分布的采用方差分析，非正態(tài)分布的則采用秩和檢驗(yàn)；P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 IL-22模擬的炎癥微環(huán)境下miR-330表達(dá)水平檢測

應(yīng)用IL-22模擬銀屑病炎癥微環(huán)境后，HaCaT和HKCs細(xì)胞體外培養(yǎng)狀態(tài)良好，細(xì)胞貼壁狀態(tài)正常，分布均勻 （見圖1）。QPCR檢測結(jié)果如圖2所示，在HaCaT細(xì)胞中，添加IL-22組相對于正常組細(xì)胞，miR-330的表達(dá)水平下調(diào)約50%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；在 HKCs細(xì)胞中，添加 IL-22組相對于正常組細(xì)胞，miR-330的表達(dá)水平下調(diào)約70%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。說明在炎癥微環(huán)境下人角質(zhì)形成細(xì)胞中miR-330的表達(dá)水平被顯著抑制。

圖 1 顯微鏡下 HaCaT（A）和 HKCs（B）細(xì)胞培養(yǎng)形態(tài)圖（×200）

圖2 IL-22模擬的炎癥微環(huán)境下miR-330表達(dá)水平檢測結(jié)果

2.2 miR-330過表達(dá)及干擾慢病毒感染鑒定結(jié)果

將 LV-miR-330、LV-miR-NC、LV-anti-miR-330、LV-anti-NC 4 種慢病毒按“1.3.3”中描述的步驟分別感染HaCaT和HKCs細(xì)胞。QPCR結(jié)果如圖 3所示，LV-miR-330組相對于LV-NC組，HaCaT和HKCs細(xì)胞中miR-330的表達(dá)水平分別上調(diào)約22倍和16倍，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；LV-ant-miR-330組相對于LV-ant-NC組，HaCaT和HKCs細(xì)胞中miR-330的表達(dá)水平分別下調(diào)約75%和65%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。4種慢病毒的感染結(jié)果均符合預(yù)期，可以滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。

圖3 miR-330過表達(dá)及干擾慢病毒感染鑒定結(jié)果

2.3 IL-22模擬的炎癥微環(huán)境下miR-330對角質(zhì)形成細(xì)胞增殖的影響

2.3.1 CCK8實(shí)驗(yàn)檢測IL-22及過表達(dá)/干擾miR-330對細(xì)胞增殖的影響 CCK8實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果如圖4和圖5所示。在不加IL-22的細(xì)胞中，LV-miR-330組相對于LV-NC組，HaCaT和HKCs細(xì)胞的增殖能力均被抑制，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；在添加IL-22的細(xì)胞中，LV-miR-330組相對于LV-NC組，HaCaT和HKCs細(xì)胞的增殖能力同樣被抑制，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。說明過表達(dá)miR-330可以抑制人角質(zhì)形成細(xì)胞HaCaT和HKCs的增殖能力。加IL-22組細(xì)胞相對于不加IL-22組細(xì)胞，增殖能力顯著提高 （P＜0.01）；在不加IL-22的細(xì)胞中，LV-ant-miR-330組相對于LV-ant-NC組，HaCaT和HKCs細(xì)胞的增殖能力均有所提高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；在添加 IL-22 的細(xì)胞中，LV-ant-miR-330組相對于LV-ant-NC組，HaCaT和HKCs細(xì)胞的增殖能力同樣有所提高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。說明干擾miR-330可以促進(jìn)人角質(zhì)形成細(xì)胞HaCaT和HKCs的增殖；IL-22可以促進(jìn)人角質(zhì)形成細(xì)胞HaCaT和HKCs的增殖。

圖4 IL-22及過表達(dá)miR-330對細(xì)胞增殖的影響

圖5 IL-22及干擾miR-330對細(xì)胞增殖的影響

2.3.2 BrdU實(shí)驗(yàn)檢測IL-22及miR-330對細(xì)胞增殖的影響 BrdU實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果如圖6所示，加IL-22組細(xì)胞相對于不加IL-22組細(xì)胞，增殖能力顯著提高（P＜0.01）；LV-ant-miR-330 組相對于 LV-ant-NC組，HaCaT和HKCs細(xì)胞的增殖能力有所提高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.05）；LV-miR-330組相對于LV-NC組，HaCaT和HKCs細(xì)胞的增殖均被抑制，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。說明miR-330是人角質(zhì)形成細(xì)胞HaCaT和HKCs的增殖抑制因子；IL-22是人角質(zhì)形成細(xì)胞HaCaT和HKCs的增殖促進(jìn)因子。

圖6 BrdU實(shí)驗(yàn)檢測IL-22及miR-330對細(xì)胞增殖的影響

2.4 竹黃顆粒對角質(zhì)形成細(xì)胞中IL-22/miR-330的表達(dá)變化的影響

2.4.1 竹黃顆粒對角質(zhì)形成細(xì)胞增殖的影響CCK8檢測結(jié)果如圖7所示，加竹黃顆粒組相對于不加藥組，細(xì)胞的增殖被顯著抑制（P＜0.01），且隨著藥物濃度的遞增，增殖抑制越明顯。說明竹黃顆?？梢砸种迫私琴|(zhì)形成細(xì)胞HaCaT和HKCs的增殖。

圖7竹黃顆粒對角質(zhì)形成細(xì)胞增殖的影響

2.4.2 竹黃顆粒對角質(zhì)形成細(xì)胞IL-22蛋白表達(dá)水平的影響 Western blot實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞中IL-22的蛋白表達(dá)變化，結(jié)果如圖8所示，加竹黃顆粒組相對于不加藥組，細(xì)胞中的IL-22蛋白表達(dá)水平顯著下降（P＜0.01），且隨著藥物濃度的遞增，下降趨勢越明顯。說明竹黃顆?？梢砸种迫私琴|(zhì)形成細(xì)胞HaCaT和HKCs中IL-22蛋白的表達(dá)水平。

2.4.3 竹黃顆粒對角質(zhì)形成細(xì)胞IL-22分泌水平的影響 ELISA實(shí)驗(yàn)檢測上清中炎癥因子IL-22的含量，結(jié)果如圖9所示，加竹黃顆粒組相對于不加藥組，細(xì)胞上清中的IL-22的含量顯著下降（P＜0.01），且隨著藥物濃度的遞增，下降趨勢越明顯。說明竹黃顆?？梢砸种迫私琴|(zhì)形成細(xì)胞HaCaT和HKCs分泌IL-22。

2.4.4 竹黃顆粒對miR-330表達(dá)水平的影響 QPCR實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞中miR-330的表達(dá)變化，結(jié)果如圖10所示，加竹黃顆粒組相對于不加藥組，細(xì)胞中的miR-330表達(dá)水平顯著上升（P＜0.01），且隨著藥物濃度的遞增，上升趨勢越明顯。說明竹黃顆?？梢陨险{(diào)人角質(zhì)形成細(xì)胞HaCaT和HKCs的miR-330的表達(dá)水平。

3 討論

3.1 IL-22/miR-330與銀屑病

本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用重組慢病毒技術(shù)在HaCaT和HKCs細(xì)胞中分別過表達(dá)和干擾miR-330的表達(dá)，結(jié)果顯示過表達(dá)miR-330可以抑制人角質(zhì)形成細(xì)胞HaCaT和HKCs的增殖；干擾miR-330可以促進(jìn)人角質(zhì)形成細(xì)胞HaCaT和HKCs的增殖。上述研究結(jié)果均證實(shí)了miR-330可以抑制病變細(xì)胞的異常增殖，在銀屑病的檢測與治療中可以作為重要研發(fā)靶標(biāo)。

圖8竹黃顆粒對角質(zhì)形成細(xì)胞IL-22蛋白表達(dá)水平的影響

圖9竹黃顆粒對IL-22分泌水平的影響

圖10竹黃顆粒對miR-330表達(dá)水平的影響

機(jī)體內(nèi)有促炎系統(tǒng)和抗炎系統(tǒng)，其反應(yīng)程度及持續(xù)時(shí)間決定組織損傷修復(fù)的結(jié)局，兩者保持平衡狀態(tài)，但是如果炎癥反應(yīng)沒有得到有效控制，進(jìn)一步大規(guī)模發(fā)展則很可能加重組織損傷。當(dāng)前認(rèn)為炎癥、表皮細(xì)胞過度增殖和免疫學(xué)異常是銀屑病發(fā)病機(jī)制的三個(gè)中心環(huán)節(jié)。炎癥可能既是其發(fā)病的誘因，又是病情的主要癥狀，相互促進(jìn)、相輔相成，這可能也是其病情難以根治的原因之一。本實(shí)驗(yàn)中，IL-22可以顯著促進(jìn)人角質(zhì)形成細(xì)胞HaCaT和HKCs的增殖。炎癥因子刺激下，人角質(zhì)形成細(xì)胞表現(xiàn)出活躍的增殖能力，若在正常機(jī)體中，很可能有其它相應(yīng)的調(diào)控基因進(jìn)行干預(yù)，阻止角質(zhì)細(xì)胞的異常增殖；而在銀屑病患者體能，這種起關(guān)鍵作用的調(diào)控因子可能嚴(yán)重缺乏或活性喪失，導(dǎo)致角質(zhì)細(xì)胞異常增殖，角質(zhì)細(xì)胞的過量增殖會(huì)加重皮損，而皮損在缺乏控制的情況下會(huì)進(jìn)一步促進(jìn)炎癥反應(yīng)及分泌炎癥因子。通過重組慢病毒技術(shù)進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)干擾miR-330的表達(dá)可以加強(qiáng)IL-22對角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖促進(jìn)作用；過表達(dá)miR-330后可以減弱IL-22對角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖促進(jìn)。這提示IL-22對角質(zhì)形成細(xì)胞的調(diào)控很可能通過miR-330而實(shí)現(xiàn)，至于miR-330是否通過下游靶基因繼續(xù)發(fā)揮調(diào)控作用則需要進(jìn)一步研究。

3.2 竹黃顆粒對IL-22/miR-330的調(diào)控

銀屑病中醫(yī)辨證以血熱型最為多見，一般認(rèn)為本病多因素七情內(nèi)傷或因體血熱，郁久化火，火熱亢盛，氣郁不舒。熱毒入里，伏于營血，導(dǎo)致血熱毒盛；病程日久，則生風(fēng)化燥，風(fēng)燥日久，則耗傷氣陰。本院歐陽恒教授主張“血熱毒滯”是誘發(fā)尋常型銀屑病的基本病機(jī)，并提出了“血熱陰耗證”，在治療方案中把益氣養(yǎng)陰和清熱解毒的理念融為一體，創(chuàng)立了竹黃顆粒。竹黃顆粒由淡竹葉、黃芩、黃柏、生石膏、梔子、黃連、水牛角、漏蘆、柴胡、生地黃、白芍、黨參、麥冬、當(dāng)歸、三七等藥物組成，具有涼血活血、清熱解毒、益氣養(yǎng)陰之功效。本方切中尋常型銀屑病的基本病機(jī)，以清熱涼血解毒藥物為主，輔以益氣養(yǎng)陰，以防一味祛邪，耗傷正氣，臨床療效甚佳。

綜上，IL-22可以抑制miR-330的表達(dá)，促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞增殖；竹黃顆?？梢砸种艻L-22的表達(dá)，促進(jìn)miR-330的表達(dá)，抑制角質(zhì)形成細(xì)胞增殖。

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（本文編輯 蘇 維）

Mechanism of Zhuhuang Granule Intervenes IL-22/miR-330 in Regulating Keratinocyte Proliferation

SHEN Hui1,2， LIU Wen1， YAO Xiaolei2， YANG Zhibo1*
（1.The Second Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410005,China;2.Ruikang Hospital Affiliated to Guangxi University of Chinese Medicine,Nanning,Guangxi 530011,China）

ObjectiveTo study the molecular mechanism of IL-22/miR-330 intervened by Zhuhuang granule in regulating the proliferation of keratinocytes.MethodsThe expression of miR-330 in HaCaT and HKCs cells after IL-22 intervention was detected by QPCR technique.Overexpression and interference of miR-330 in HaCaT and HKCs cells were achieved by lentivirus infection,their cell proliferation was detected by CCK8 and BrdU.The cell proliferation ability,the expression of IL-22 protein,the expression level of miR-330 and the secretion of IL-22 in HaCaT and HKCs were determined by CCK8,West ern blot,QPCR and ELISA,respectively.ResultsThe expression of miR-330 in HaCaT and HKCs cells significantly decreased after treatment with IL-22 (P＜0.01),and the cell proliferation ability of HaCaT and HKCs cells was significantly improved (P＜0.01).The cell proliferation ability of HaCaT and HKCs cells significantly decreased after miR-330 overexpression (P＜0.05).After interference of miR-330 expression,cell proliferation ability of HaCaT and HKCs had a significant increase (P＜0.05).Cell proliferation ability of HaCaT and HKCs treated by different concentrations of Zhuhuang granule decreased (P＜0.01).The expression of IL-22 protein decreased significantly(P＜0.01),the expression level of miR-330 increased significantly(P＜0.01),and the content of IL-22 decreased significantly (P＜0.01).Conclusion Zhuhuang granule could inhibit the expression of IL-22,promote the expression of miR-330 and inhibit the proliferation of keratinocytes.

psoriasis;Zhuhuang granule;IL-22;miR-330;keratinocytes

R285.5

A

10.3969/j.issn.1674－070X.2017.07.004

2017-05-11

國家自然科學(xué)基金面上資助項(xiàng)目（81573985）。

沈 慧，女，博士，主治醫(yī)師，主要從事中西醫(yī)結(jié)合防治銀屑病的研究。

*楊志波，男，教授，主任醫(yī)師，博士研究生導(dǎo)師，E-mail：dr.yang888@126.com。

本文引用：沈 慧，劉 文，姚小磊，楊志波.竹黃顆粒介導(dǎo)IL-22/miR-330調(diào)控角質(zhì)形成細(xì)胞增殖的機(jī)制研究[J].湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2017，37（7）：708-714.