姜蘇南，郭 璇，徐 寅，王小娟*，郭建生*，黃琳桂，譚華梁，肖 麟，陽松威

（1.湖南中醫(yī)藥大學，湖南 長沙 410208；2.湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410007）

舒胃湯對功能性消化不良大鼠胃腸平滑肌Bcl-2、Caspase-12表達的影響

姜蘇南1，郭 璇1，徐 寅2，王小娟2*，郭建生1*，黃琳桂1，譚華梁2，肖 麟2，陽松威1

（1.湖南中醫(yī)藥大學，湖南 長沙 410208；2.湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410007）

目的通過觀察舒胃湯對功能性消化不良（functional dyspepsia，F(xiàn)D）肝郁脾虛證模型大鼠胃竇和幽門區(qū)Bcl-2、Caspase-12蛋白及mRNA表達的影響，探討舒胃湯治療FD的作用和機制。方法將Wistar大鼠60只隨機分成空白組，模型組，莫沙必利組，舒胃湯低、中、高劑量組。按改良復合病因造模法造成FD肝郁脾虛證模型，連續(xù)21 d。分組干預，連續(xù)14d。處死大鼠后，取胃竇平滑肌和十二指腸上段組織。Western-blot法檢測Bcl-2、Caspase-12蛋白表達；RT-PCR法檢測Bcl-2、Caspase-12的mRNA表達。結果Western-blot檢測發(fā)現(xiàn)，與空白組比，模型組Caspase-12表達升高而Bcl-2表達降低（P＜0.05）；與模型組比，舒胃湯中、高組Caspase-12 mRNA表達顯著降低（P＜0.01）。RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，與空白組比，模型組Caspase-12表達顯著升高而Bcl-2表達顯著降低（P＜0.01）；與模型組相比，舒胃湯低、中、高劑量組Caspase-12表達顯著降低（P＜0.01），中、高劑量組Bcl-2表達顯著升高（P＜0.01）。結論舒胃湯可能通過調控胃竇和幽門區(qū)凋亡因子Bcl-2、Caspase-12的表達抑制平滑肌細胞的凋亡，從而有效地治療功能性消化不良。

舒胃湯；功能性消化不良；Bcl-2；Caspase-12；細胞凋亡；柴胡；香附

功能性消化不良 （functional dyspepsia,FD）為臨床常見疾病[1]，但就目前而言西方醫(yī)學理論對于FD的發(fā)病機制和病因還未完全確定，且有關FD的治療仍滯留在對癥處理階段[2]，雖也有一定的療效，但長期服用西藥出現(xiàn)的副作用較多[3]。通過運用中醫(yī)藥理論來進一步明確FD的發(fā)病機制并探尋安全有效的防治方法已成為臨床消化治療領域研究探索的熱點內容。舒胃湯由王小娟教授根據其多年治療功能性消化不良的臨床經驗將逍遙散化裁而來，臨床治療取得了較好的療效[4-5]。本實驗從胃腸平滑肌細胞中Bcl-2、Caspase-12蛋白和mRNA表達的變化，初步探討舒胃湯治療FD的作用與機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

Wistar大鼠60只，SPF級，雌雄各半，體質量180～200 g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司購入，許可證號：SYXK（湘）2013-0005。飼養(yǎng)于室溫20～25℃，濕度40%～45%的環(huán)境，自然光照時間12 h。按體質量和分層隨機法分組設計，將其分為6組：空白組，模型組，莫沙必利組，舒胃湯低、中、高劑量組，每組10只。

1.2 藥物與試劑

舒胃湯由柴胡10 g，枳實 9 g，香附 8 g，白術15 g，白芍 10 g，延胡索 8 g，旋覆花 8 g，川楝子6 g，焦神曲10 g組成，飲片由湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院藥劑科提供；枸櫞酸莫沙必利片，魯南貝特制藥有限公司提供，批號：25140608；Tween-20、APS、 甘氨酸 （均由美國 Sigma提供），Protein phosphatase抑制劑（瑞士羅氏公司），逆轉錄試劑盒（立陶宛Fermentas公司），引物 （南京金斯瑞公司），HRP goat anti-mouse、anti-rabbit IgG （美國 Proteintech）等。

1.3 儀器

TS-92型搖床、QL-901型旋渦混合器 （江蘇海門其林貝爾公司）；164-5050型電泳儀 （美國Biorad公司）；DYCZ-24EN型電泳槽、DYCZ-40A型轉膜儀 （北京六一生物科技有限公司）；PIKO REAL 96型熒光定量RCP儀（美國Thermo公司）等。

2 方法

2.1 藥物制備

參照文獻[6]大鼠與人臨床用藥劑量體型系數(shù)公式換算得出，用于灌胃的舒胃湯高、中、低劑量為30.68、15.34、7.67g/kg，分別相當于人臨床用量 4 倍、2倍、1倍。舒胃湯飲片水煎至3.068 g/mL，密封保存。莫沙必利的劑量為1.37 mg/kg，相當于人臨床用量的1倍。實驗時用蒸餾水稀釋為0.137 mg/mL溶液。

2.2 動物造模

除空白組大鼠外，其余5組按改良復合病因造模法[7]（慢性束縛應激+飲食失節(jié)+過度疲勞+夾尾激怒）造成FD肝郁脾虛證模型。先將大鼠束縛3 h，再于（22±1）℃的水中游泳10 min，隔日給食，并于禁食日進行夾尾激怒0.5 h，連續(xù)21 d。

2.3 干預及樣本處理

第22天起每天進行舒胃湯低、中、高劑量和莫沙必利組的相應藥液灌胃，空白組和模型組則用蒸餾水灌胃（10 mL/kg），每天 1次，連續(xù) 14 d。末次給藥2 h后，麻醉處死大鼠，開腹，結扎胃賁門和胃幽門，迅速取出距幽門0.5 cm胃竇壁全層以及距幽門2 cm的十二指腸上段組織，-80℃冰箱存放備用。

2.4 指標檢測

2.4.1 Western-blot法檢測FD肝郁脾虛證大鼠胃竇和十二指腸bcl-2、Caspase-12蛋白表達 將所取胃腸組織磨碎吹勻，冰上裂解，冷凍離心取上清液；SDS-PAGE 電泳；Bcl-2 轉膜 30 min，Caspase-12、actin轉膜60 min；配好1×TBST中室溫密封1 h；一抗（Bcl-2 1:100、Caspase-12 1∶500、actin 1∶4 000）恒溫孵育過夜；二抗（1∶3 000）恒溫孵育 1 h；Triton 溶液漂洗，ECL發(fā)光液顯色，以X膠片顯影曝光處理。

2.4.2 RT-PCR法檢測FD肝郁脾虛證大鼠胃竇和十二指腸bcl-2、Caspase-12 mRNA表達 取一定量的細胞樣品，加入Trizol溶液提取總RNA。將所取胃腸組織總mRNA逆轉錄成cDNA，按說明書具體的步驟進行操作。30 μL反應體系配制：5×RT Buffer 6 μL，Primer Mix 3 μL，RNase-Free Wate 4.5 μL，dNTP Mix,2.5mM Each6 μL，RNA Template 6 μL，HiFiScript,200 U/μL 1.5 μL，DTT,0.1 M 3 μL。 擴 增 條 件 ：42 ℃，60 min；85 ℃，10 min；所得cDNA置于-80℃冰箱保存。取微量的RNA進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，通過凝膠圖像成像分析系統(tǒng)觀察處理。

引物序列設計為：Bcl-2-F：5'-ATTGTGGCCTTCTTTGAGTTCG-3'；Bcl-2-R：5'-CCTACCCAGC CTCCGTTATCC-3'（152 bp）；Caspase-12-F：5'-TCCTGGTCTTTATGTCCC-3'；Caspase-12-R：5'-CAGTATGTCTGCCTCTGC-3' （180 bp）；β-actin-F：5'-CATC CTGCGTCTGGACCTGG-3'；β-actin-R：5'-TAATGTCACGCACGATTTCC-3'（107 bp）。

2.5 統(tǒng)計學處理

所有實驗數(shù)據以Excel錄入處理，運用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行分析，組間計量資料對比先作正態(tài)性和方差齊性的檢驗，滿足方差齊性，采用One-way ANOVA法進行方差分析；若不滿足方差齊性，則采用非參數(shù)法進行檢驗。 數(shù)據用“±s”表示，P＜0.05 即差異有統(tǒng)計學意義，P＜0.01為差異有顯著統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 Western-blot檢測各組大鼠胃竇和幽門區(qū)Caspase-12、Bcl-2蛋白表達水平比較

與空白組相比，模型組大鼠胃竇和幽門區(qū)平滑肌中Caspase-12表達量有較明顯升高而Bcl-2表達量降低（P＜0.05）。與模型組相比，舒胃湯中、高劑量組大鼠Caspase-12表達量顯著降低（P＜0.01）。結果見表1和圖1。

表1各組大鼠胃竇和幽門區(qū)Caspase-12、Bcl-2蛋白表達水平比較 （±s，n=10）

表1各組大鼠胃竇和幽門區(qū)Caspase-12、Bcl-2蛋白表達水平比較 （±s，n=10）

注：與空白組相比，*P＜0.05；與模型組相比，＃＃P＜0.01。

組別空白組模型組莫沙必利組舒胃湯低劑量組舒胃湯中劑量組舒胃湯高劑量組劑量/（g/kg）--0.00137 7.67 15.34 30.68 F P--Caspase-12/GAPDH 0.441±0.096 0.549±0.053*0.493±0.080 0.460±0.100 0.411±0.113＃＃0.383±0.084＃＃4.828 0.001 Bcl-2/GAPDH 0.559±0.138 0.386±0.166*0.416±0.132 0.411±0.127 0.431±0.141 0.500±0.146 2.221 0.065

圖1各組大鼠胃竇和幽門區(qū)Caspase-12、Bcl-2蛋白表達電泳圖

3.2 RT-PCR檢測各組大鼠胃竇和幽門區(qū)Caspase-12、Bcl-2 mRNA表達水平比較

與空白組相比，模型組大鼠胃竇和幽門區(qū)平滑肌中Caspase-12表達量顯著升高而Bcl-2表達量顯著降低（P＜0.01）。與模型組相比，舒胃湯低、中、高劑量組大鼠Caspase-12表達量顯著降低（P＜0.01），中、高劑量組Bcl-2表達量顯著升高（P＜0.01）。結果見表2。

表2各組大鼠胃竇和幽門區(qū)Caspase-12、Bcl-2 mRNA相對表達量比較 （±s，n=10）

表2各組大鼠胃竇和幽門區(qū)Caspase-12、Bcl-2 mRNA相對表達量比較 （±s，n=10）

注：與空白組相比，**P＜0.01；與模型組相比，＃＃P＜0.01。

組別空白組模型組莫沙必利組舒胃湯低劑量組舒胃湯中劑量組舒胃湯高劑量組劑量/（g/kg）--0.00137 7.67 15.34 30.68 F P--Caspase-12 mRNA 0.844±0.345 4.719±1.319**2.270±0.551＃＃3.675±0.567＃＃1.653±0.168＃＃1.139±0.425＃＃48.04 0.000 Bcl-2 mRNA 8.319±0.814 1.140±0.410**5.413±1.103＃＃1.697±0.611 5.133±1.293＃＃6.173±1.777＃＃58.49 0.000

4 討論

目前中醫(yī)學理論對FD的辨證分型雖還尚未統(tǒng)一，但究其病機病因，古今醫(yī)家均各有論述，形成了脾胃氣機升降失調是FD基本病機且為病理關鍵的共識。因此疏肝健脾法為治療FD的根本，舒胃湯方中，柴胡辛行苦泄，香附疏肝理氣，二者疏肝解郁、條達肝氣共為君藥，以疏木郁之不達補土虛之不運。延胡索理氣解郁，行氣止痛；白術甘溫健脾，益氣補虛；白芍養(yǎng)血柔肝，令肝氣條達無犯土虛；枳實苦降辛散，破氣消痞；諸藥合用共為臣藥。旋覆花行氣降氣，有較好的降逆止嘔作用，善治噫氣、嘔吐諸癥；川楝子舒肝，行氣止痛；焦神曲消積化滯共為佐使藥。全方運用扶土抑木之法，使肝郁得解，脾弱得健，則FD肝郁脾虛諸癥可愈。

細胞的凋亡是真核細胞在凋亡刺激信號的作用下，啟動細胞死亡機制，經過信號的轉導，從而致使細胞程序性變異和死亡的過程。又被稱為Ⅰ型程序性細胞死亡，受多種相關基因的調控，如Caspase-12、Bcl-2等。Caspase-12是內質網應激（過度）介導細胞凋亡的途徑之一。目前僅在大鼠、小鼠體內取得，人體內因基因突變而失去了調控凋亡的活性，但其異構體Caspase4被認為與之有相類似的作用而受到了廣泛的關注。Caspase-12被激活后進入細胞液，通過激活其他Caspase家族的因子來完成凋亡，提示可將Caspase-12作為靶點來為Caspase-4的研究提供實驗基礎。Bcl-2是在細胞凋亡的研究中最受重視的癌基因之一，是一種抗凋亡因子，其確切的作用機制尚未闡明，一般認為其通過線粒體、細胞內Ca2+等多種途徑的共同調節(jié)，可起到抑制細胞凋亡的作用。

通過前期的相關基礎與臨床研究[8-11]發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)D發(fā)病機制復雜多變，而又尚未十分明確，但其主要病理生理基礎是胃腸動力學障礙[12]，胃腸動力障礙的形成牽涉到不同器官間功能的失調，多種細胞的信號傳導受阻礙，胃腸平滑肌收縮功能失調以及相關基因、蛋白表達的不足等，而這些也可能會誘發(fā)細胞的凋亡。本實驗通過檢測對比發(fā)現(xiàn)，舒胃湯對于造成FD肝郁脾虛證模型大鼠的胃竇和十二指腸肌條細胞中的Caspase-12、Bcl-2的蛋白和mRNA表達有明顯影響，尤其對于其mRNA表達進行對比分析可發(fā)現(xiàn)，通過舒胃湯對模型大鼠的干預，能顯著降低Caspase-12和升高Bcl-2表達（P＜0.01）。 即提示功能性消化不良可能與抑制胃竇和十二指腸組織平滑肌細胞凋亡有關，會受到相關凋亡因子表達的影響。因此，可認為舒胃湯可能通過抑制胃腸道起搏細胞的凋亡，促進胃腸動力的恢復，而有效治療FD，但其具體的改善和調節(jié)機制還需進一步的研究與討論。

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（本文編輯 楊 瑛）

Effects of Shuwei Decoction on the Expression of Bcl-2,Caspase-12 in Gastrointestinal Smooth Muscle Rats with Functional Dyspepsia

JIANG Sunan1,GUO Xuan1,XU Yin2,WANG Xiaojuan2*,GUO Jiansheng1*,HUANG Lingui1,TAN Hualiang2,XIAO Lin2,YANG Songwei1
(1.Hunan University of Chinese Medicine，Changsha,Hunan 410208,China;2.The First Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410007,China)

ObjectiveTo observe the effect of Shuwei decoction on the expression of Bcl-2,Caspase-12 protein and mRNA in gastric antrum and pylorus of FD (functional dyspepsia)model rats with liver-stagnation and spleen-deficiency syndrome,and to explore the effect and mechanism of Shuwei decoction on FD.MethodsThe 60 Wistar rats were randomly divided into blank group,model group,mosapride group,Shuwei decoction low,medium and high dose groups.FD syndrome of liver stagnation and spleen deficiency was established by the method of improved complex etiology,21 continuous days.Each group of rats were fed with the corresponding liquid 10 mL/kg,14 continuous days.After the rats were sacrificed,the gastric antrum smooth muscle and the duodenum were selected.Western-blot method was used to detect the expression of Bcl-2 and Caspase-12 protein.The Bcl-2 and Caspase-12 mRNA expression were detected by RT-PCR assay.ResultsWestern-blot detection showed that compared with the blank group,the expression of Caspase-12 in model group increased and the expression of Bcl-2 decreased (P＜0.05).Compared with the model group,the expression of Caspase-12 mRNA significantly decreased in the middle and high levels of the decoction (P＜0.01).RT-PCR shows that compared with model group,Caspase-12 expression increased and Bcl-2 expression decreased significantly in the model group(P＜0.01).Compared with the model group,the expression of Caspase-12 in Shuwei decoction low,medium and high dose groups significantly decreased(P＜0.01),the expression of Bcl-2 in middle and high dose groups significantly increased(P＜0.01).ConclusionShuwei decoction could inhibit the apoptosis of smooth muscle cells by regulating the expression of Bcl-2 and Caspase-12 in gastric antrum and pylorus,so as to effectively treat functional dyspepsia.

Shuwei decoction;functional dyspepsia;Bcl-2;Caspase-12;cell apoptosis;radix bupleuri;rhizoma cyperi

R285.5；R57

A

10.3969/j.issn.1674-070X.2017.07.003

本文引用：姜蘇南，郭 璇，徐 寅，王小娟，郭建生，黃琳桂，譚華梁，肖 麟，陽松威.舒胃湯對功能性消化不良大鼠胃腸平滑肌Bcl-2、Caspase-12表達的影響[J].湖南中醫(yī)藥大學學報，2017，37（7）：704-707.

2017-04-28

國家自然科學基金項目（81373577）；國家自然科學基金青年項目（81403384）；湖南省教育廳優(yōu)秀項目（15B151）。

姜蘇南，女，在讀碩士研究生，研究方向：中藥新藥研究與開發(fā)。

*王小娟，女，主任醫(yī)師，碩士研究生導師，E-mail:1047610399@qq.com；*郭建生，博士研究生導師，碩士學位，E-mail:gjs7878@126.com。