朱惠霞，陶興林，胡立敏，劉明霞

（甘肅省農(nóng)業(yè)科學院蔬菜研究所，甘肅 蘭州 730070）

甘藍類蔬菜是十字花科蕓薹屬甘藍種中1年或2年生蔬菜的統(tǒng)稱，染色體組CC（2n=18），包括芥藍和甘藍的一系列變種，甘藍變種主要有結球甘藍、皺葉甘藍、紫甘藍、抱子甘藍、羽衣甘藍、球莖甘藍（苤藍）、花椰菜、青花菜等。甘藍類蔬菜常規(guī)育種方法是利用不育系和自交不親和系進行雜交育種，通常需要6～7年的自交才能獲得遺傳穩(wěn)定、高度純合的親本自交系，育種周期長，選擇效率低，而利用游離小孢子培養(yǎng)技術可以短期內獲得大量的單倍體，經(jīng)過加倍后的雙單倍體（Double Haploid，簡稱DH）植株變異豐富，遺傳穩(wěn)定，2年內即可獲得純合的自交系，篩選鑒定后可直接應用于育種程序，能大大加快新品種的選育速度[1-3]。小孢子技術與傳統(tǒng)育種技術的結合為甘藍類蔬菜優(yōu)良種質資源的獲得和新品種的培育創(chuàng)建了一條新途徑，小孢子技術的研究和利用也成為近年來育種專家們研究的新方向。小孢子技術在甘藍類蔬菜育種中具有重要的應用價值，是創(chuàng)造變異和創(chuàng)新育種材料的主要方法之一。本文主要綜述了甘藍類蔬菜小孢子技術發(fā)展概況和應用情況，并對未來的研究發(fā)展方向進行了展望，以期為進行相關研究的人員提供一定的參考。

1 甘藍類蔬菜小孢子育種技術發(fā)展概況

甘藍類蔬菜游離小孢子培養(yǎng)由Lichter[4]和Takahata等[5]在羽衣甘藍、結球甘藍中首次取得了成功，隨后又在花椰菜、青花菜、芥藍上得到了再生植株[6]，Duyijis等[7]在球莖甘藍、皺葉甘藍、孢子甘藍上獲得成功。張德雙等[8]首次對青花菜進行了游離小孢子培養(yǎng)，并獲得了再生植株；嚴準等[9]在甘藍、青花菜、苤藍上進行小孢子培養(yǎng)，首次在苤藍中培養(yǎng)成功。近20年來，國內陸續(xù)對甘藍、芥藍、花椰菜、羽衣甘藍等開展了小孢子培養(yǎng)技術研究[10-13]，對影響小孢子出胚的主要因素，如材料的基因型、花蕾取樣時期、培養(yǎng)基成分、預處理方式等方面進行了大量研究[14-23]，經(jīng)過多年的研究和改進，游離小孢子培養(yǎng)技術日趨成熟，到目前為止，幾乎所有的甘藍類蔬菜都進行了小孢子技術研究，成功建立了小孢子培養(yǎng)技術體系[24-29]，并逐步應用于育種實踐。

1.1 篩選出一批具備小孢子培養(yǎng)特性的基因型材料

相比于其他十字花科蔬菜作物，在小孢子培養(yǎng)中，甘藍類C基因組蔬菜是最難出胚的一類，試驗材料的基因型是影響胚產(chǎn)量的主要因素。不同材料的出胚能力差異很大，一些基因型材料出胚率很高，例如甘藍品種中甘11[20]、萬福[21]、寒玉37[30]，球莖甘藍東川苤藍[31]，羽衣甘藍桃舞[22]，花椰菜品種耐熱50、大圣160[15]，青花菜品種綠洲808[14]，松花菜品種廈雪40、白虎早生種[27]，芥菜翠寶[32]等，而大部分的基因型材料出胚率較低，甚至不出胚。對甘藍品種表型與出胚難易關系研究發(fā)現(xiàn)，擁有早熟、球形、春甘藍3種特性的甘藍易出胚，而扁球、中熟、晚熟、越冬甘藍不易出胚[33]，而花椰菜小孢子出胚多少與花球松緊度并無明顯關聯(lián)[34]。由于在小孢子培養(yǎng)技術研究前期，必須通過大量的材料篩選找到一些易出胚的基因型材料作為小孢子培養(yǎng)的骨干材料，進行體系優(yōu)化和完善，因此，通過研究相關文獻列出了一些出胚較高的基因型材料，供初期的研究者參考（表1）。

1.2 利用小孢子技術培育出一批甘藍類蔬菜新品種

目前，小孢子技術已成為甘藍類蔬菜育種的主要方法之一，通過小孢子培養(yǎng)獲得DH株系，并從中選出性狀優(yōu)良的株系進行雜交組合配制，即可在4～5年內選育出優(yōu)良新品種。2002年，張曉偉等[37]用小孢子技術育成第1個甘藍品種，到目前為止，全國已育成甘藍類蔬菜品種14個，其中松花菜4個、甘藍8個、青花菜2個（表2）。但研究文獻發(fā)現(xiàn)，近年來，中國甘藍類蔬菜品種大多還是利用傳統(tǒng)育種技術育成，如自交不親和系，細胞質雄性不育系和核不育系，利用小孢子技術的品種相對較少，究其原因，小孢子技術從建立培養(yǎng)體系到進入育種應用程序需要一個長期的過程，必須突破基因型材料的限制，突破出胚難、出胚率低的瓶頸，而得到的DH植株也必須經(jīng)過篩選鑒定才能進入育種程序，期間需要投入大量的試驗成本，這嚴重制約了小孢子技術在育種實踐中的應用速度?，F(xiàn)階段成功培育出新品種的單位大多經(jīng)過10多年的研究積累，已經(jīng)擁有成熟的技術和完整的育種評價體系，而對于大多數(shù)研究者來說，小孢子技術還未達到程序化、規(guī)?；瘧玫碾A段。

表1 高出胚能力的基因型材料

表2 利用小孢子技術育成的甘藍類蔬菜新品種

2 小孢子技術在甘藍類蔬菜育種中的應用

2.1 利用遠緣雜交或種間雜交與小孢子技術相結合創(chuàng)制育種新材料

遠緣雜交在甘藍類蔬菜育種中被廣泛應用，若雜種花粉可育，則可結合小孢子技術進行種質資源再創(chuàng)造。目前，已進行小孢子培養(yǎng)的雜種有青花菜×甘藍、甘藍×花椰菜[51]、broccoli×white-headed cabbage hybrids[28]。有研究表明，甘藍類蔬菜的小孢子胚胎發(fā)生能力是可以遺傳的，對種間雜交種進行小孢子培養(yǎng)，產(chǎn)胚能力取決于2個親本的胚胎發(fā)生能力，雜種1代小孢子產(chǎn)胚率與具高胚發(fā)生能力的親本相近，或與中親值接近[51]。因此，可以通過品種雜交的手段，將難出胚材料與高出胚材料雜交，使控制高胚發(fā)生能力的遺傳因子導入到無胚發(fā)生能力的材料中，通過遺傳改良的方法擴大能誘導出小孢子胚胎發(fā)生的基因型范圍[52]。胡永霞[53]以大白菜-結球甘藍3號單體異附加系為材料，進行小孢子游離培養(yǎng)，對獲得的小孢子植株進行細胞學、形態(tài)學及InDel標記鑒定，篩選出攜帶甘藍優(yōu)良性狀基因的易位系新種質，建立了大白菜-結球甘藍異源易位系的高效誘導及鑒定方法。

2.2 利用小孢子技術進行抗病、抗逆種質的篩選

甘藍類蔬菜常見病害有霜霉病、黑根病、黑斑病、灰霉病、黑腐病、細菌性黑斑病、菌核病、根腫病、枯萎病等。目前，最主要的病害是甘藍枯萎病、花椰菜根腫病，其已嚴重影響了產(chǎn)量和品質，且危害逐年加重，而應對病害最有效的方式是使用抗病品種，利用小孢子技術建立DH群體后，結合分子標記和抗性鑒定，可篩選出抗病且性狀優(yōu)良的DH系，其可用于配制雜交組合，使得原本需要7～8年的育種進程縮短至3～4年。呂紅豪[54-55]首次利用小孢子培養(yǎng)的DH群體和F2群體對甘藍抗枯萎病基因進行了精細定位，分析獲得了甘藍抗枯萎病候選基因FOCI，對候選基因進行了驗證，并利用小孢子培養(yǎng)結合分子標記輔助選擇的方法創(chuàng)制了新材料，促進了甘藍抗枯萎病育種技術的快速發(fā)展。

2.3 小孢子技術與誘變技術相結合創(chuàng)制突變體

游離小孢子培養(yǎng)技術的日益成熟為離體誘變提供了新途徑。相比傳統(tǒng)的誘變技術，誘變小孢子比種子更加敏感，有利于提高誘變率，且能產(chǎn)生大量的胚狀體，增加了獲得有益突變性狀的可能性，并可以在DH植株中快速篩選出純合的目標突變性狀。目前常用的物理方法是用60Co-γ射線處理單核靠邊期的花蕾后進行小孢子培養(yǎng)，化學方法則是用不同濃度的甲基磺酸乙酯（EMS）處理分離純化后的小孢子，再進行培養(yǎng)。代雙艷[56]利用EMS誘變大白菜花蕾并結合游離小孢子培養(yǎng)，獲得了葉形、葉色、花冠大小、花色、抽薹性、抗霜霉病上的基因型純合突變體74株。黃勝楠[57]利用60Co-γ射線誘變處理小孢子發(fā)育處于單核靠邊期的花蕾后進行小孢子培養(yǎng)，獲得了花瓣退化、生育遲緩、雄性不育、葉片黃化和不結球等特性的突變體材料5份，用EMS誘變處理分離純化后的小孢子，再進行培養(yǎng)，獲得了雄性不育、早抽薹、生長緩慢、葉片黃化和葉球變長等性狀的突變體材料7份，并利用獲得的突變體材料進行了基因功能組學研究，而在甘藍類蔬菜上還未見相關報道。因此，今后應將小孢子培養(yǎng)技術與誘變相結合，快速創(chuàng)制純合的甘藍類蔬菜突變體。

3 問題及展望

小孢子培養(yǎng)技術在品種改良和新種質創(chuàng)制方面具有十分重要的地位和意義?？蛇M行雙單倍體育種、突變育種、轉基因育種等，目前幾乎所有的蔬菜育種單位都開展了相關研究，尤其在十字花科類蔬菜上技術比較成熟，但基本需要10多年的研究積累。只有建立完整有效的小孢子單倍體育種綜合體系，其才能逐步應用于育種實踐。目前，小孢子技術的優(yōu)勢還未能充分發(fā)揮出來，因此，今后將進一步優(yōu)化技術突破出胚率普遍較低的瓶頸，而如何把小孢子培養(yǎng)育種技術與常規(guī)育種技術相結合，節(jié)省育種成本，加快育種進程，拓寬應用范圍等問題，也值得被進一步研究和探索。

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