盧傳禮 董麗華.中國科學(xué)院西雙版納熱帶植物園園林園藝部，云南 勐臘 666303；.中國科學(xué)院大學(xué)研究生部，北京 00049

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傣藥九翅豆蔻不同溶劑提取物的化學(xué)成分分析及其抗氧化、抗炎和降血糖活性研究

盧傳禮1董麗華2
1.中國科學(xué)院西雙版納熱帶植物園園林園藝部，云南 勐臘 666303；2.中國科學(xué)院大學(xué)研究生部，北京 100049

目的：研究九翅豆蔻根莖不同溶劑提取物的化學(xué)成分。方法：采用索氏提取法制備了其石油醚(PE)、三氯甲烷(CH)、甲醇(ME)和水(AQ)等四種不同極性溶劑提取物，利用顯色法分析了各提取物中總黃酮、總多酚和總萜類的含量。并通過1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)和2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺基)二銨鹽(ABTS)自由基清除法，α-葡萄糖苷酶活性抑制法和脂多糖(LPS)誘導(dǎo)RAW264.7巨噬細胞模型評價了各提取物的體外抗氧化、降血糖和抗炎活性。結(jié)果：四種提取物均對DPPH和ABTS顯示出不同程度的清除活力，其中ME清除自由基的能力最強；PE和ME能夠顯著抑制α-葡萄糖苷酶的活性(IC50 值分別為12.87和16.70μg/mL)，且作用強度與陽性對照阿卡波糖相當(P>0.05)；PE和CH在12.5～25μg/mL以及ME在100μg/mL濃度水平，均能明顯地降低脂多糖誘導(dǎo)的RAW 264.7細胞釋放一氧化氮的水平，且對細胞的正常增殖無明顯影響；而AQ在本研究所測試模型中均不表現(xiàn)出明顯的活性。此外，CH中總黃酮的含量最高，PE中萜類成分的含量最高，ME中多酚的含量最高，AQ中三類成分的含量都是最低的。結(jié)論：九翅豆蔻的藥效物質(zhì)應(yīng)該屬于脂溶性成分而不是水溶性成分，對其臨床療效的有效成分和作用機制等方面科學(xué)內(nèi)涵還有待進一步的研究。

九翅豆蔻；抗炎；清除自由基；α-葡萄糖苷酶；成分分析

九翅豆蔻(AmomummaximumRoxb.)屬于姜科豆蔻屬，廣泛分布于我國云南南部和東南亞熱帶地區(qū)[1]。在傣醫(yī)藥中，九翅豆蔻的果實或根莖入藥(傣語稱作賀姑、郭姑等)，入土、風(fēng)塔，主治“短趕短接”(腹部脹痛)，“沙呃、短昏(呃逆、消化不良)”，“攏梅蘭申(肢體關(guān)節(jié)酸痛、屈伸不利)”[2]。在印度、越南等東南亞熱帶地區(qū)和國家，九翅豆蔻的花、果實和嫩桿被用作蔬菜食用，果實和根莖也被民間作為傳統(tǒng)藥物用來治療胃腸道疾患[3-5]。

然而目前對九翅豆蔻的生理活性、有效成分、作用機制及植物資源狀況等尚缺乏深入的研究與調(diào)查。有研究報道表明，九翅豆蔻根莖中含有半日花烷型二萜類成分[3,6]，莖葉中揮發(fā)油的主要成分為和α-和β-pinene[5,7]。九翅豆蔻粗提取物能夠降低絳蟲(Raillietinaechinobothrida)的運動能力和存活率，降低蠕蟲體表磷酸酶、和腺苷三磷酸酶等關(guān)鍵酶的活性，具有潛在的驅(qū)蟲藥物開發(fā)價值[4]。另外，從九翅豆蔻根莖中得到的二萜類成分，Amomax C能夠明顯抑制MG-63細胞的增殖(IC50=3.3±0.8μg/mL)，而Amomaxin B 能夠有效抑制LPS誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細胞釋放一氧化氮的水平(IC50=31.33 μM)[3,6]。

本研究對九翅豆蔻根莖不同極性溶劑提取物進行了體外的抗氧化、抗炎和降血糖活性評價，并對各提取物中的總黃酮、多酚和萜類成分含量進行了分析，以期評價其臨床運用的科學(xué)性，為進一步的研究提供基礎(chǔ)。

1 材料

脂多糖(LPS)、α-葡萄糖苷酶(來源于Bacillus stearothermophilus)、地塞米松、1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH)、2,2′-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonic acid (ABTS)、(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide (MTT)和4-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside (PNPG)等均購買自Sigma公司。 DMEM細胞培養(yǎng)基、胎牛血清 (FBS)、磷酸鹽緩沖液 (PBS)、Gluta-Max (100x)和青-鏈霉素雙抗 (100×) 購買自Thermo Scientific公司。胰酶購買自Millipore (MA, USA)，Griess 試劑盒 (G2930)購買自Promega (Madison, WI, USA)。維生素C和蘆丁購買自成都曼斯特生物科技有限公司。

九翅豆蔻根莖采集自云南省勐臘縣勐侖鎮(zhèn)植物園野生姜園，樣品經(jīng)黃建平(中國科學(xué)院西雙版納熱帶植物園)鑒定。

2 方法

2.1 九翅豆蔻不同溶劑提取物的制備 取九翅豆蔻根莖洗凈切片，置陰涼處晾干，粉碎后過100目篩。取藥材粉末50 g，濾紙包裹好后放置于索氏提取器中，依次用石油醚、三氯甲烷和甲醇提取，減壓回收溶劑后分別得到石油醚提取物(PE, 0.91g)、三氯甲烷提取物(CH, 0.82g)和甲醇提取物(ME, 1.55g)。藥渣取出后在通風(fēng)處，充分揮去有機溶劑后，轉(zhuǎn)移至圓底燒瓶中，加入500mL去離子水，加熱回流提取1.5h。趁熱過濾，濾液經(jīng)冷凍干燥得到水提取物(AQ, 0.31g)。

2.2 總黃酮、總多酚、總萜類成分的含量測定 樣品中總黃酮的含量測定參考文獻報道方法[8]，并作適當調(diào)整。即100μL樣品溶液與10μL 5%的NaNO3溶液混合后室溫下放置6min后，加入10μL10%的Al(NO3)3溶液，充分混合后室溫下放置6min。最后加入80μL4%的NaOH溶液并在室溫下放置15min。使用酶標儀(VarioSkan Flash, Thermo Scientifi)讀取反應(yīng)體系在510nm處的吸光度值(OD)，每個樣品設(shè)置三次平行試驗。用蘆丁標準品按照上述步驟建立反應(yīng)體系吸光度值與蘆丁濃度間的標準曲線，并由此標準曲線計算出個樣品中總黃酮的相對含量(單位為mg蘆丁當量/g藥材))。

樣品中總多酚含量測定采用Folin-Ciocalteu法[9]，并作適當調(diào)整。即100μL 樣品溶液與 40μL Folin-Ciocalteu 試劑 (0.2M)混合后室溫下放置5min，然后加入60μL Na2CO3溶液(15%)，并在30℃水浴上反應(yīng)60min。用酶標儀記錄各反應(yīng)體系在755nm處的吸光度值。使用沒食子酸標準品按照上述步驟建立反應(yīng)體系吸光度值與沒食子酸濃度之間的標準曲線，并由此標準曲線計算出各樣品中總多酚的相對含量(單位為mg沒食子酸當量/g藥材)。所有實驗設(shè)置三組平行。

總萜類成分含量的測定參照文獻報道的方法進行[10]，并作適當調(diào)整。即1.0mL樣品溶液，1.0mL冰醋酸 (含5%香蘭素)和1.0mL硫酸依次加入5 mL容量瓶中，充分混合后置于65℃水浴中反應(yīng)20min。反應(yīng)結(jié)束后用流水冷卻至室溫，并用冰醋酸補足至5mL。使用分光光度計測反應(yīng)體系在545nm處的吸光度值。用千金子二萜醇(lathyrol)按照上述方法建立反應(yīng)體系吸光度值與千金子二萜醇濃度之間的標準曲線，并由此標準曲線計算個樣品中總萜類成分的含量(單位為mg千金子二萜醇當量/g藥材)。所有實驗設(shè)置三組平行。

2.3 自由基清除試驗 樣品的抗氧化活性通過其清除DPPH和ABTS自由基的能力進行評價。DPPH自由基清除能力測試參照文獻描述的方法進行[11]。即100μL不同濃度的樣品溶液與等體積的DPPH溶液(0.10mg/mL溶解于甲醇)混合后室溫下暗處放置30min。用酶標儀記錄反應(yīng)體系在517nm處的吸光度值。等體積的甲醇代替樣品溶液作為空白組，維生素C作為陽性對照，每組實驗設(shè)置三組平行。DPPH 自由基的清除率按照下式計算。

(1)

As為樣品組吸光度值，Ac為空白組吸光度值。

ABTS自由基清除能力測試按照文獻報道的方法進行[12]。7.4mM 的ABTS溶液與2.6mM 的過硫酸鉀溶液充分混合后置于暗處放置12h以上，制成ABTS自由基儲備液。臨用前，儲備液用乙醇稀釋至在734nm處的吸光度值為0.7± 0.02成為工作液用于實驗。100μL不同濃度的樣品溶液與等體積的ABTS工作液混合后室溫下暗處放置10min。用酶標儀記錄反應(yīng)體系在734nm處的吸光度值。等體積的乙醇代替樣品溶液作為空白組，維生素C作為陽性對照，每組實驗設(shè)置三組平行。ABTS自由基的清除率按照下式計算。

(2)

As為樣品組吸光度值，Ac為空白組吸光度值。

2.4 體外抑制α-葡萄糖苷酶活性評價 九翅豆蔻根莖四種不同溶劑提取物的降血糖活性通過其抑制α-葡萄糖苷酶的作用效果進行評價，試驗參考文獻報道的方法進行[13]，并作適當?shù)恼{(diào)整。30 μL a-葡萄糖苷酶溶液(0.5U/mL，溶解于10mM pH 6.8磷酸鹽緩沖液) 和 10μL不同濃度的樣品溶液(6.25-100μg/mL)混合后，室溫下孵育20 min。加入30μL PNPG溶液(5.0mM, 溶解于10mM pH 6.8磷酸鹽緩沖液中)，37℃水浴中反應(yīng)40min，加入100μL Na2CO3溶液(1M)終止反應(yīng)。酶標儀記錄各反應(yīng)體系在405nm處的吸光度值。等體積的蒸餾水代替樣品溶液作為空白組，等體積的磷酸鹽緩沖液代替酶溶液作為樣品背景組，阿卡波糖作為陽性對照，所有實驗設(shè)置三次平行。樣品對α-葡萄糖苷酶活性的抑制率按照下式進行計算。

(3)

A1為樣品組吸光度值，A2為樣品背景組吸光度值，A3為空白組吸光度值。

2.5 抗炎活性測試 按照文獻報道的方法進行[14]。RAW 246.7 細胞培養(yǎng)于含10% 胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素雙抗的DMEM 培養(yǎng)液中，孵育在37℃含5% CO2的生化培養(yǎng)箱中。取對數(shù)生長期的細胞，調(diào)整細胞濃度為5×106 /mL，接種于96孔培養(yǎng)板中(100μL /孔)，37 ℃孵育過夜。細胞用LPS進行刺激24h，同時加入不同濃度的樣品進行干預(yù)。使用Griess反應(yīng)測定實驗細胞培養(yǎng)液中的亞硝酸根濃度以此反映NO的釋放水平，即50 μl 細胞培養(yǎng)液與等體積Griess 試劑 A (1% sulfanilamide in 5% 磷酸)混合后室溫下置于暗處反應(yīng)10 min，再加入50μL的Griess試劑 B[0.1%N-(1-Naphthyl) ethylenediamine dihydrochloride in water] 室溫下繼續(xù)反應(yīng)10min，酶標儀記錄反應(yīng)體系在535nm處的吸光度值。由亞硝酸鈉按照上述步驟建立標準曲線，并由此標準曲線計算出各細胞培養(yǎng)液中的亞硝酸根濃度。同時利用MTT法測各種的細胞存活率。

2.6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS17.0進行統(tǒng)計分析，結(jié)果以(x行統(tǒng)表示，各組間的數(shù)據(jù)滿足正態(tài)性和方差齊性檢驗的條件下進行方差分析，兩兩組間比較采用Dunnet t檢驗。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果與討論

3.1 九翅豆蔻根莖四種提取物中總黃酮、總多酚和總萜類成分的含量 在四種不同溶劑提取物中，CH的總黃酮含量最高，PE和ME中分別是萜類和總多酚的含量最高。但是AQ中三種成分的含量都是最低。詳見表1。

表1 九翅豆蔻根莖四種不同溶劑提取物中總黃酮、多酚和萜類的含量

注：：表示同列數(shù)據(jù)相比較a,b,cP<0.05[1]。

3.2 九翅豆蔻根莖四種不同提取物的抗氧化活性 九翅豆蔻根莖四種不同溶劑提取物對DPPH和ABTS兩種自由基都顯示出不同程度清除效果，且對自由基的清除效果具有濃度依賴性(圖1)。其中，ME清除自由基的能力最強，而PE的能力最弱。但是所有樣品對自由基的清除效果都低于陽性對照維生素C。

此外，樣品中總多酚的濃度與其清除DPPH自由基的能力具有顯著的相關(guān)性(R2=0.98，P<0.05)，與ABTS自由基的清除能力也存在一定的相關(guān)性(R2=0.91，P=0.09)。而樣品中總黃酮或萜類的含量與清除兩種自由基的效果都沒有明顯的相關(guān)性。實驗結(jié)果與文獻中報道現(xiàn)象一致，即抗氧化活性與多酚的含量存在明顯的關(guān)聯(lián)，而與黃酮含量之間的關(guān)聯(lián)較弱[15]。

3.3 降血糖活性 α-葡萄糖苷酶淀粉和多糖重要的消化酶之一，抑制該酶的活性能夠有效延緩多糖消化的效率，進而降低小腸對葡萄糖的吸收速率，這樣可以抑制餐后血糖水平大幅波動，對于控制糖尿病具有重要意義[16-17]。

研究結(jié)果表明，PE和ME能夠顯著地抑制α-葡萄糖苷酶的活性，抑制強度與陽性對照阿卡波糖的相當(P>0.05)；CH顯示出中等程度的α-葡萄糖苷酶抑制作用，而AQ無明顯的抑制活性(IC50值>100mg/mL)(表2)。此實驗結(jié)果與對同屬植物草果(Amomum tsao-ko Crevost et Lemaire)的研究結(jié)果相似[18-19]，即有機溶劑提取物具有明顯的α-葡萄糖苷酶抑制效果，而水溶性成分無α-葡萄糖苷酶抑制活性。

表2 九翅豆蔻根莖四種不同提取物對α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用 (IC50, μg/mL)

注：與陽性對照組比較，**P<0.01。

3.4 抗炎活性 利用LPS-誘導(dǎo)的RAW264.7細胞模型評價了九翅豆蔻四種不同溶劑提取物的抗炎活性。結(jié)果表明PE (25～100μg/mL)和CH (12.5～100μg/mL)均能夠明顯地抑制NO的過度釋放，且抑制效果具有濃度依賴性。ME在最高測試濃度時也能夠降低NO的釋放水平，但是AQ對NO的釋放水平無明顯的效果。詳見表3。同時檢測四種提取物對RAW264.7細胞增殖的影響，ME和AQ對細胞正常增殖沒有明顯的影響，但是PE和 CH在 50和100μg/mL濃度時會顯著抑制細胞的生長。綜合考慮，PE，CH和ME具有潛在的抗炎活性，但是AQ無明顯的抗炎活性。

Amomaxins B是YinH等[6]從九翅豆蔻根莖乙醇提取物的二氯甲烷萃取部位分離得的一個二萜類成分，能夠顯著抑制LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細胞釋放NO水平(IC50值為31.33μM)，且在濃度高達100 μM時對細胞的正常增殖仍無明顯的影響，但是同時分離得到的另外兩個該類成分無次活性。

表3 九翅豆蔻根莖四種不同提取物對LPS誘導(dǎo)RAW264.7細胞NO釋放量的抑制作用

注：與對照組比較，###P<0.001；與LPS組比較，***、**和*表示P值分別<0.001、0.01和0.05。

4 結(jié)論

研究表明ME提取物具有顯著的α-葡萄糖苷酶抑制活性、抗氧化活性和較弱的抗炎活性，PE和CH提取物顯示出明顯的α-葡萄糖苷酶抑制活性和抗炎活性。但是AQ提取物在本研究所使用的三種活性測試中均沒有顯示出明顯的作用效果。而且總黃酮、多酚和萜類在有機溶劑中的含量都明顯高于水溶性部位，表明九翅豆蔻的有效成分應(yīng)該屬于脂溶性化合物，而不是水溶性化合物。因此在今后對九翅豆蔻的進一步研究中應(yīng)該把更多注意力集中在有機溶劑部位。

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Studies on Chemical Composition as well as Antioxidant, Anti-inflammatory and Hypoglycemic Activities of Different Solvent Extracts from the Rhizome ofAmomummaximumRoxb., a Dai Traditional Medicine Material

LU Chuanli1DONG Lihua2

1.Horticulture & Gardening Department, Xishuangbanna Tropical Botanical Garden,Chinese Academy of Sciences, Mengla 666303, China；2.University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China

Objective To evaluate the chemical profile and in vitro antioxidant, anti-inflammatory and hypoglycemic activities of different extracts of Amomum maximum rhizome.Methods Four different solvent extracts of A. maximum rhizome were prepared using a Soxthlet extractor, and their total flavonoids, phenolics and diterpenoids contents were analyzed. In additional, radicals scavenging (DPPH and ABTS), α-glucosidase inhibitory, lipypolysaccharide-induced RAW264.7 cells assays were carried out to evaluate their antioxidant, anti-inflammatory, hypoglycemic activities. Results indicated that all four extracts possessed a scavenging capacity for both DPPH and ABTS radicals in different degree, and ME was in the highest degree. PE (IC50=12.87μg/mL) and ME (IC50=16.70μg/mL) showed the an equally α-glucosidase inhibitory activity as that of positive control, acarbose (P>0.05). PE and CH (at concentration 12.5～25μg/mL),as well as ME (at 100μg/mL),displayed a significant inhibitory effect on NO production in LPS-induced RAW(264.7) cells, but no obvious effect on cell proliferation. However, AQ exhibited no significant activity in any assay. In addition, CH, PE, and ME had respectively the highest total flavonoids, diterpenoidsand phenol contents, but AQ had the lowest contents. Conclusion Our findings show that the organic solvent extracts, but not water soluble fraction, should be the active fraction ofA.maximumrhizome. And more researches needed to carry out to further reveal its effective ingredients and underlying mechanism.

AmomummaximumRoxb; Anti-inflammatory;Radical Scavenging; α-glucosidase;Chemical Composition

國家自然科學(xué)基金項目(81602991)、中國科學(xué)院西部之光項目。

盧傳禮(1983-)，男，漢族，博士研究生，副研究員，研究方向為藥用植物有效成分與作用機制。E-mail: luchuanli@xtbg.ac.cn

R29

A

1007-8517(2017)12-0031-06

2017-04-24 編輯：穆麗華)