卯明霞 陸應(yīng)彩 姜明輝 彭 霞西雙版納州食品藥品檢驗所，云南 景洪 666100

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藥物研究

RP-HPLC法測定傣藥地不容中延胡索乙素的含量

卯明霞 陸應(yīng)彩 姜明輝 彭 霞*
西雙版納州食品藥品檢驗所，云南 景洪 666100

目的：測定傣藥地不容中延胡索乙素的含量。方法：采用RP-HPLC法，色譜柱為：Agilent C18(150mm×4.6mm，5.0μm)；流動相：乙腈-磷酸鹽緩沖液(39∶ 61)為流動相；流速：1.0mL/min；檢測波長：280nm；柱溫：30℃。結(jié)果：延胡索乙素濃度在10.0299 ～1002.99μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系，r=0.9999；平均加樣回收率(n=6)為 100.12 %，RSD=1.75%；樣品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定，日內(nèi)精密度良好，RSD=1.42%。結(jié)論：所建立的方法經(jīng)方法學(xué)驗證，可有效控制地不容的質(zhì)量。

高效液相色譜法；傣藥地不容；延胡索乙素；含量測定

傣藥地不容為防己科植物地不容 (山烏龜)StephaniaepigaeaH. S. L.的干燥塊根，傣語波波罕。其性涼、苦，入水、風、土塔；具有祛風除濕，清熱解毒，止痛之功，用于胃痛，風濕痹痛，咽喉不利，癰腫瘡毒[1]。地不容是傣藥雙姜胃痛丸、健胃止痛膠囊(滇ZJGF/2005-649)、鎮(zhèn)靜安神膠囊(滇ZJGF/2005-650)處方藥材之一，其起鎮(zhèn)痛作用的主要活性成分即延胡索乙素。目前，傣藥材地不容的標準收載于2005年版《云南省中藥材標準》第一冊中，但應(yīng)用HPLC法對其中的延胡索乙素的含量并未見報道。因此，現(xiàn)建立延胡索乙素含量測定方法，為地不容質(zhì)量控制和質(zhì)量標準的提升提供參考方法和依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Agilent高效液相色譜儀(G4214B-1260DAD；G1316A-1230TCC；G1329-1260ALS；G1311C-1260QuatpumpVL)。

1.2 材料 延胡索乙素對照品(批號：110726-201516，中國藥品生物制品檢定所)；乙腈、甲醇為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。地不容樣品采自西雙版納州景洪市、勐?？h、勐臘縣，經(jīng)中國科學(xué)院西雙版納熱帶植物園鑒定為防己科植物地不容(山烏龜)StephaniaepigaeaH.S.L。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性考察 色譜柱：Agilent C18(150mm×4.6mm，5.0μm)；流動相：乙腈-磷酸鹽緩沖液(取磷酸氫二鈉2.0g，磷酸二氫鈉8.0g，加水使溶解成1000mL) (38∶62)；流速：1mL/min ；檢測波長：280nm；柱溫：30℃；進樣量：10μL；理論板數(shù)以延胡索乙素峰計不低于3000。取對照品溶液、供試品溶液、對照品溶液和供試品溶液混合溶液各10μL，按上述色譜條件注入液相色譜儀。色譜圖見圖1～3。

2.2 溶液制備

2.2.1 對照品儲備液的制備 精密稱取延胡索乙素對照品適量，置于100mL量瓶中，用甲醇制成每1mL含100μg的溶液，搖勻，即得。

2.2.2 供試品溶液的制備 取本品粉末0.25g，精密稱定，置錐形瓶中，精密加濃氨溶液-甲醇(1～20)混合溶液50mL，稱定重量，浸泡1h，回流1h，放至室溫，再稱定重量，用濃氨溶液-甲醇(1∶20)混合溶液補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液25mL蒸干，殘渣加甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至50mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液即得。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 線性關(guān)系考察 取濃度為1002.99μg /mL的對照品儲備液適量，加甲醇配制得10.03、25.07、50.15、100.30、300.90、1002.99μg/mL的對照品溶液，搖勻。按上述色譜條件分別進樣10μL ，以對照品濃度為橫坐標，峰面積積分值為縱坐標，進行線性回歸。回歸方程為：Y= 8.4172x+ 14.505(r2=0.9999)試驗結(jié)果表明：延胡索乙素在10.0299～ 1002.99μg的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.2 重復(fù)性試驗 取同一批次的地不容藥材(批號：20150712)6份，精密稱定，按“2.2.2”項下方法操作，依次測定，地不容中延胡索乙素的平均含量為3.73%，RSD為1.42%。表明試驗的重復(fù)性良好。

2.3.3 精密度試驗 精密吸取延胡索乙素對照品溶液10μL，重復(fù)進樣7次，測得峰面積值的RSD為計0.20%。表明儀器的精密性良好。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗 取同一批次的供試品溶液(批號：20150712)，在0，2，6，12，18，24 h進樣測定，測得延胡索乙素峰面積的RSD為0.37%。結(jié)果表明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.5 加樣回收率試驗 取具塞錐形瓶6個，分別精密加入延胡索乙素對照品5.0491mg(精密稱取已知含量的樣品(批號：20150712)0.125g，分別加入上述6個具塞錐形瓶中，按“2.2.2”項下方法操作，按上述色譜條件測定，計算回收率。延胡索乙素的平均回收率為100.12%，RSD為1.75%。

2.3.6 樣品測定 按照上述色譜條件，分別測定5個不同產(chǎn)地8批樣品，計算含量，結(jié)果見下表。

表1 不同產(chǎn)地、不同批次的地不容中延胡索乙素的含量 (n=2)

3 討論

3.1 檢測波長的選擇 根據(jù)二極管陣列檢測器及紫外可見光分光光度計檢測得到的光譜圖輔助成分定性和選擇被測組分檢測波長，延胡索乙素確定在282.20、212.70nm處有吸收峰?！吨袊幍洹芬徊恐兴幉难雍?元胡)含量測定項下采用280nm作為檢測波長，根據(jù)延胡索乙素紫外吸收圖譜，212.7nm為溶劑末端吸收，因此確定該方法的測定波長為280nm。

3.2 流動相的選擇 以乙腈-磷酸鹽緩沖液(取磷酸氫二鈉2.0g，磷酸二氫鈉8.0g，加水使溶解成1000mL) (39∶61)為流動相、乙腈-0.1%磷酸溶液(三乙胺調(diào)節(jié)pH 值至6.0)(40∶60)、乙腈-0.6%冰醋酸溶液(用三乙胺調(diào)節(jié)pH 值至6.0)(39∶61)等為流動相系統(tǒng)。結(jié)果，選擇乙腈-磷酸鹽緩沖液(取磷酸氫二鈉2.0g，磷酸二氫鈉8.0g，加水使溶解成1000ml) (39∶61)為流動相，各組分分離好，基線較穩(wěn)定。

3.3 提取條件的考察 實驗考察了氨水-乙醇(1∶20)、氨水-無水乙醇(1∶20)、氨水-甲醇(1∶20)為溶劑，采用回流提取(提取時間為60min、120min、180min)、超聲處理(超聲時間為30min、45min、60min)。試驗結(jié)果表明，以氨水-甲醇(1∶20)為溶媒，回流提取60min地不容中延胡索乙素的含量較高，雜質(zhì)干擾少。

3.4 耐用性試驗 按2015年版中國藥典新增加了“藥品質(zhì)量標準分析方法驗證指導(dǎo)原則”(通則9101)，規(guī)范中藥質(zhì)量標準分析方法，為了進一步驗證地不容HPLC含量測定方法的可靠性，我們參照該指導(dǎo)原則以地不容的含量測定方法進行了驗證。為給本方法用于常規(guī)檢驗提供依據(jù)，對其耐用性試驗作為進一步探討，考察了隨機變動因素對精密度的影響。考察了不同柱溫(25℃、30℃、35℃)、不同色譜柱：依利特 Hypersil ODS2(150×4.6mm, 5.0μm；Agela Technologies Venusil XBP C18(150×4.6mm, 5.0μm)；Agilent C18(150mm×4.6mm，5.0μm))、不同檢測波長(277nm、280、283nm)、不同流速(0.8mL/min、1mL/min 、1.2 mL/min)。結(jié)果基本一致，進一步確保了試驗方法的科學(xué)性及數(shù)據(jù)的準確性，為地不容質(zhì)量標準的提高提供了科學(xué)依據(jù)。

[1]云南省食品藥品監(jiān)督管理局.云南省中藥材標準(第一冊)[M].昆明：云南科技出版社，2005： 19.

[2]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社2015.

HPLC determination of Tetrahydropaimatine in Stephania epigaea

MAO Mingxia LU Yingcai JIANG Minghui PENG Xia*

Xishuangbanna Institute For Food and Drug Control，Jinhong 666100，China

Objective To establish determine the content of Dai medicine to be tetrahydropalmatine． Methods Methods of the RP-HPLC， Chromatographic column: Agilent C18(150mm×4.6mm，5.0μm), The mobile phase： acetonitrile phosphate buffer (disodium hydrogen phosphate 2.0g, sodium dihydrogen phosphate 8.0g, add water dissolved into 1000mL) (39∶61) as mobile phase.The flow rate was 1 mL/min，and the detection wavelength was set at 280nm, column temperature for 30 degrees． Result The linear range was 10.0299 ～ 1002.99μg (r=0.9999)． the average recovery rate (n=6) was 100.12%,RSD=1.75%．The sample solution is stable within 24 hours, the intra day precision was good,RSD=1.42%．Conclusion This method has strong specificity, good precision and accurate．

HPLC；Stephaniaepigaea；Tetrahydropaimatine；Content Determination

卯明霞(1979-)，女，漢族，學(xué)士，主管藥師，研究方向為中傣藥成分分析及標準研究。E-mail：584578500@qq.com

彭霞(1966-)，女，彝族，學(xué)士，主任藥師，研究方向為中傣藥成分分析及標準研究。E-mail：lisa313@126.com

R284.2

A

1007-8517(2017)12-0009-03

2017-04-20 編輯：梁志慶)