趙若琳,周坤福,張　旭,陳美娟

(南京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，江蘇省中醫(yī)藥防治腫瘤協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京　210023)

桔梗皂苷-D抑制非小細(xì)胞肺癌H460和A549細(xì)胞黏附、侵襲和遷移的作用機(jī)制研究

趙若琳,周坤福,張旭,陳美娟

(南京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，江蘇省中醫(yī)藥防治腫瘤協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京210023)

中國(guó)圖書(shū)分類號(hào)：R-332；R284.1；R329.2；R734.202.2；R977.3

摘要：目的探究桔梗皂苷-D(platycodin-D，PD)抑制非小細(xì)胞肺癌(NSCLC) H460和A549細(xì)胞黏附、侵襲和遷移的作用及其作用機(jī)制。方法細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè)細(xì)胞黏附、遷移和侵襲能力。RT-PCR檢測(cè)H460和A549細(xì)胞中MMP-2和MMP-9 mRNA的表達(dá)。同時(shí)，Western blot法檢測(cè)MMP-2和MMP-9蛋白、其上游ERK信號(hào)通路相關(guān)蛋白和p-Akt的表達(dá)水平。結(jié)果PD有效抑制H460和A549細(xì)胞黏附、侵襲和遷移能力，并呈濃度依賴性(P<0.05)。PD降低H460和A549細(xì)胞中MMP-2和MMP-9 mRNA的表達(dá)(P<0.01);同時(shí)，PD下調(diào)H460和A549細(xì)胞中MMP-2和MMP-9蛋白的表達(dá)，并抑制其上游Ras、p-c-Raf、p-ERK 1/2和p-Akt的表達(dá),并呈濃度和時(shí)間依賴性。結(jié)論P(yáng)D抑制NSCLC細(xì)胞黏附、侵襲和遷移，并且此作用與下調(diào)MMP-2和MMP-9 mRNA和蛋白的表達(dá)，抑制其上游ERK信號(hào)通路和p-Akt表達(dá)有關(guān)。

關(guān)鍵詞：桔梗皂苷-D；非小細(xì)胞肺癌；黏附；侵襲；遷移；基質(zhì)金屬蛋白酶-2; 基質(zhì)金屬蛋白酶-9

肺癌是世界上發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一，全球每年有138萬(wàn)肺癌新增病例和超過(guò)100多萬(wàn)人死于肺癌，其中，非小細(xì)胞肺癌 (non-small cell lung cancer，NSCLC)占肺癌的80%~85%，其5年生存率不到15%[1]。NSCLC患者中，約30%的患者在診斷時(shí)就已發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，50%~60%的患者在治療過(guò)程中發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，并且最終80%~90%的患者都死于肺癌的轉(zhuǎn)移[2]。因此，抑制和預(yù)防肺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移是治療NSCLC和提高患者生存率的關(guān)鍵。腫瘤轉(zhuǎn)移受多因素、多步驟調(diào)控，主要包括腫瘤細(xì)胞間黏附力降低，而與細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)黏附力增強(qiáng)、降解ECM和基底膜、腫瘤細(xì)胞遷移、侵襲能力的增強(qiáng)，從而進(jìn)入血流或淋巴系統(tǒng)，最終到達(dá)靶器官形成新的腫瘤生長(zhǎng)[3]。因此，抑制NSCLC細(xì)胞黏附、侵襲和遷移是抑制其轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)。中藥桔梗在臨床上常用于治療肺部和呼吸系統(tǒng)疾病，桔梗皂苷-D(platycodin-D，PD)是從其中分離提取的一種三萜類單體，它是桔梗抗癌的主要有效成分。近年國(guó)內(nèi)外的研究發(fā)現(xiàn)，PD對(duì)肺癌、胃癌、乳腺癌和人白血病等多種腫瘤細(xì)胞具有抑制增殖和誘導(dǎo)凋亡作用[4-5]。此外,在PD抑制腫瘤轉(zhuǎn)移方面，研究?jī)H發(fā)現(xiàn)PD單獨(dú)或聯(lián)合蛇床子對(duì)乳腺癌侵襲和遷移具有抑制作用[5-6]，然而，其對(duì)NSCLC侵襲和遷移的研究尚未開(kāi)展。本實(shí)驗(yàn)旨在探究PD對(duì)兩種NSCLC細(xì)胞肺大細(xì)胞肺癌H460和肺腺癌細(xì)胞A549黏附、侵襲和遷移能力的影響及其作用機(jī)制，為PD抑制NSCLC轉(zhuǎn)移提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1藥品與試劑桔梗皂苷-D，分子量1224.58，上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)：20110402。該化合物最初溶于二甲亞砜(DMSO)，為使用前的原液(DMSO的最終濃度小于0.01%)。RPMI 1640和DMEM/F12培養(yǎng)液：HyClone, USA；胎牛血清：Gibco, USA；磷酸緩沖鹽(PBS)：Solarbio；胰酶、Ⅰ型膠原蛋白(CollagenⅠ)、牛血清蛋白(BSA)、凝膠試劑盒：碧云天；聚偏二氟乙烯膜(PVDF)：Millipore，Germany；Transwell小室：Corning，USA；抗體均為美國(guó)Cell Signaling公司；TRIzol: Invitrogen，America；cDNA第一鏈合成試劑盒：Fermentas，Lithuania；Realtime PCR Master Mix(SYBR Green) ：Toyobo，Japan。

1.1.2儀器CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱 (日本SANYO公司)；超凈工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備有限公司)；自動(dòng)酶標(biāo)儀、凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad公司)；倒置熒光相差顯微鏡、熒光顯微鏡、圖像獲取系統(tǒng)(日本Olympus公司)；熒光定量PCR循環(huán)儀(中國(guó)中山達(dá)安)；核酸電泳儀(中國(guó)北京六一)；PCR循環(huán)儀、高速低溫離心機(jī)(美國(guó)Labnet公司)；流式細(xì)胞儀(美國(guó)Becton Dickinson公司)。

1.1.3細(xì)胞株肺腺癌A549細(xì)胞和肺大細(xì)胞肺癌H460細(xì)胞，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)將A549細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清DMEM/F12培養(yǎng)液中；將H460細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中。置37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為 5%的 CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)時(shí)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞。

1.2.2細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)96孔培養(yǎng)板包被：每孔加入CollagenⅠ溶液50 μL，置37 ℃、5% CO2孵箱孵育1 h；PBS洗2次，加入3% BSA 0.2 mL，孵育2 h，PBS再洗2次，備用。分別取不同濃度PD(0、5、10、20、30 μmol·L-1)作用24 h后的H460和A549細(xì)胞，經(jīng)洗滌、消化后用含10%胎牛血清DMEM液稀釋，調(diào)整細(xì)胞濃度為8×108·L-1，分別加入到包被過(guò)的96孔板，每孔100 μL，每組設(shè)5個(gè)平行復(fù)孔，37 ℃、5% CO2條件下溫育2 h。溫育結(jié)束后棄去各孔培養(yǎng)液，PBS沖洗，除去未黏附細(xì)胞，每孔加50 μL MTT使用液(PBS溶解，1×103mg·L-1)，細(xì)胞培養(yǎng)箱溫育3 h。吸棄MTT使用液，每孔加DMSO 150 μL，溶解結(jié)晶后，酶標(biāo)儀測(cè)波長(zhǎng)570 nm下各孔OD值。以PD(0 μmol·L-1)組為空白對(duì)照組，黏附抑制率=(1-實(shí)驗(yàn)組OD值 / 對(duì)照組OD值)×100%。

1.2.3劃痕實(shí)驗(yàn)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H460和A549細(xì)胞，按每孔 1×106個(gè)接種于6孔板中，待細(xì)胞貼壁長(zhǎng)到 90%時(shí)，用20 μL移液器槍頭在每孔的中間垂直劃線。然后用PBS洗滌3次，去除掉落的細(xì)胞，加入PD (0、30 μmol·L-1)處理后，置37 ℃、5%的 CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。于鏡下觀察PD作用0、6、12、24、48 h后劃痕寬度變化并拍照(×100),每組實(shí)驗(yàn)重復(fù) 3 次。分別計(jì)算3條平行劃痕的平均寬度(每條劃痕各取3個(gè)固定位置計(jì)算寬度)。劃痕愈合率/%=(初始劃痕寬度-指定時(shí)間的劃痕寬度)/ 初始劃痕寬度×100%。

何小勇悉心照料著青瓷，給她洗衣服，給她做飯，他把所有能想到的能討好她的方法都用盡了。然后有一天就傳來(lái)王金貴被打的消息，躺在醫(yī)院里兩天才把小命搶救過(guò)來(lái)。

1.2.4Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)Transwell小室含有基質(zhì)，膠纖維膜孔徑為8 μm，下室中加入600 μL含10%胎牛血清的培養(yǎng)液，上室加入100 μL不含胎牛血清的培養(yǎng)液，然后按照1×108·L-1在上室加入PD(0、10、 20、30 μmol·L-1)處理后的細(xì)胞懸液30 μL，置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，取出濾膜，甲醇固定，姬姆薩染色，顯微鏡下每張濾膜隨機(jī)取5個(gè)視野(×200)，計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)，取平均數(shù)表示每種腫瘤細(xì)胞的侵襲能力。

1.2.5RT-PCR采用TRIzol細(xì)胞裂解法提取組織RNA，測(cè)定樣品RNA在波長(zhǎng)260和280 nm處的吸光度比值，檢測(cè)其純度和濃度。設(shè)計(jì)并合成擴(kuò)增引物序列及PCR產(chǎn)物大?。篐uman-GAPDH primer (132 bp),Sense primer: 5′-ATCGTGGAAGGACTCA-3′，Antisense primer: 5′-CCAGTAGAGGCAGGGATGAT-3′；Human-MMP2 primer (146 bp)，Sense primer:5′-CTACTGAGTGGCCGTGTTTG-3′，Antisense primer: 5′-GGAAGCTCTGACCTTTCCAG-3′；Human-MMP9 primer (136 bp)，Sense primer: 5′-TCTTCCAAGGCCAATCCTAC-3′，Antisense primer: 5′-ATCACCGTCGAGTCAGCTC-3′。cDNA合成條件：取2 μg提取RNA,加入20 μL的反應(yīng)體系中，PCR擴(kuò)增條件：逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物用無(wú)核酸酶的水稀釋10倍，取20 μL用于擴(kuò)增，95 ℃ 5 min， 94 ℃ 15 s， 60 ℃ 20 s， 72 ℃ 40 s，共40個(gè)循環(huán)；每秒升高0.1 ℃直至升高到95 ℃停止。取10 μL PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖電泳鑒定，緩沖液冷卻循環(huán)器凝膠圖像分析系統(tǒng)攝片，并分析其光密度，結(jié)果以目的基因與內(nèi)參基因(Human-GAPDH)吸光度的比值2-ΔΔCT表示。

1.2.6Western blot 檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)相關(guān)蛋白變化取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞消化接種到6孔板中，細(xì)胞密度為5×108·L-1，藥物處理一定時(shí)間后，收集細(xì)胞PBS洗滌2次，每孔加入細(xì)胞裂解液200 μL，1200 r·min-1離心20 min。蛋白定量：取蛋白，加入4×上樣緩沖液，100℃下變性5 min。15%的聚丙烯酰胺SDS凝膠電泳后，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂牛奶封閉后依次加入第一、二抗體，在室溫下孵育2 h，TBST緩沖液洗滌3次，每次10 min，滴加ECL發(fā)光試劑，于凝膠成像系統(tǒng)曝光。

2結(jié)果

2.1PD對(duì)H460和A549細(xì)胞黏附能力的影響不同濃度的 PD(0、5、10、 20、30 μmol·L-1)分別作用 H460和A549細(xì)胞 24 h 后[PD(0 μmol·L-1)組為空白對(duì)照組]，采用細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞黏附能力。結(jié)果表明，PD 作用后，H460和A549細(xì)胞黏附能力都逐漸減弱，即細(xì)胞黏附抑制率皆逐漸升高，并呈濃度依賴性(Tab 1)，與PD(5 μmol·L-1)組的細(xì)胞黏附抑制率相比，各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

Tab 1Effects of PD on cell adhesion ability in H460

GroupOD570nmH460A549Inhibitionrateofcelladhesion/%H460A549PD0μmol·L-10.737±0.020.328±0.0100PD5μmol·L-10.646±0.050.277±0.0212.31%15.54%PD10μmol·L-10.505±0.040.234±0.0231.45%**28.60%*PD20μmol·L-10.490±0.030.199±0.0133.56%**39.32%**PD30μmol·L-10.437±0.020.189±0.0140.64%**42.48%**

*P<0.05，**P<0.01vsPD 5 μmol·L-1

2.2PD對(duì)H460和A549細(xì)胞遷移能力的影響采用劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)PD對(duì)H460和A549細(xì)胞遷移能力的影響。如Fig 1所示，PD(30 μmol·L-1)分別作用H460和A549細(xì)胞0、6、12、24、48 h后，劃痕寬度逐漸增大，劃痕兩側(cè)的細(xì)胞密度逐漸減少；相反，H460和A549細(xì)胞的空白對(duì)照組(Control)生長(zhǎng)0、6、12、24、48 h后，劃痕寬度逐漸減小，劃痕兩側(cè)的細(xì)胞密度逐漸增大。同時(shí)，兩種細(xì)胞的Control組劃痕愈合率逐漸增大，PD(30 μmol·L-1)作用組逐漸減小，并且與同一作用時(shí)間的Control組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),見(jiàn)Tab 2。

Fig 1　Effects of PD on cell migration ability of H460 and A549 cells(n=3)

**P<0.01 vs control

GroupWound-healingrateofcontrolgroup/%H460A549Wound-healingrateofPD30μmol·L-1group/%H460A5496h6.6713.63-3.23**-9.37**12h10.0527.27-9.67**-12.51**24h13.3550.11-16.13**-24.38**48h20.0363.62-16.50**-25.15**

**P<0.01vscontrol

2.3PD對(duì)H460和A549細(xì)胞侵襲能力的影響Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)PD對(duì)H460和A549細(xì)胞侵襲能力的改變，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PD(10、20、30 μmol·L-1)作用 24 h 后，H460和A549細(xì)胞的處理組穿過(guò)微孔濾膜的細(xì)胞數(shù)明顯低于對(duì)照組(P<0.01)，并呈濃度依賴性(Fig 2)。

2.4PD對(duì)H460和A549細(xì)胞中MMP-2和MMP-9基因水平的調(diào)控利用RT-PCR進(jìn)一步研究PD對(duì)H460和A549細(xì)胞中與癌細(xì)胞黏附、侵襲和遷移密切相關(guān)的金屬蛋白酶-2(MMP-2)和金屬蛋白酶-9(MMP-9)mRNA水平的調(diào)控。如Tab 3所示，PD有效抑制了H460和A549細(xì)胞中MMP-9 和 MMP-2 mRNA的表達(dá)，并隨PD濃度增加抑制作用增強(qiáng)，與Control組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

Tab 3Effects of PD on mRNA expression levels of

GroupMMP-2(2-ΔΔCT)H460A549MMP-9(2-ΔΔCT)H460A549Control1.000±0.0151.000±0.0111.000±0.0141.000±0.024PD20μmol·L-10.360±0.009**0.376±0.006**0.408±0.008**0.513±0.013**PD30μmol·L-10.174±0.057**0.155±0.005**0.119±0.016**0.164±0.002**

**P<0.01vscontrol

Fig 3　Regulation of expression levels of MMP-2/9, upstream

3討論

NSCLC占肺癌的80%～85%，具有低生存率、高轉(zhuǎn)移率的特點(diǎn)，并且80%～90%的NSCLC患者死亡和復(fù)發(fā)是由轉(zhuǎn)移引起的。桔梗入藥始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，味苦、辛，性平，歸肺經(jīng)，臨床上以桔梗為主藥組成方劑治療急性上呼吸道感染、肺膿瘍、肺膿腫、肺癌和縱隔腫瘤等肺部疾病，均取得較好的療效[7]。PD是從中藥桔梗中分離提取的一種三萜類單體，是桔?？拱┳饔玫挠行С煞?，其對(duì)多種腫瘤細(xì)胞具有殺傷作用。在抑制腫瘤轉(zhuǎn)移方面，現(xiàn)僅有文獻(xiàn)報(bào)道PD具有抑制乳腺癌侵襲和遷移作用，PD對(duì)肺癌轉(zhuǎn)移的影響及其機(jī)制研究尚未開(kāi)展。

腫瘤轉(zhuǎn)移是多基因、多因素、多步驟的生物學(xué)行為。降低癌細(xì)胞與ECM間黏附力是癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的開(kāi)始，本實(shí)驗(yàn)首先由細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)探究PD作用后H460和A549細(xì)胞與ECM蛋白CollagenⅠ黏附能力的改變，結(jié)果表明PD降低兩種細(xì)胞黏附能力，并呈濃度依賴性。癌細(xì)胞與ECM黏附后，侵襲ECM和基底膜，分泌多種蛋白水解酶，降解ECM和基底膜，使細(xì)胞穿越破損的基底膜脫離、遷離原發(fā)灶，進(jìn)而隨血液或淋巴循環(huán)發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)移[8]。因此，降低癌細(xì)胞侵襲和遷移能力是抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，PD有效抑制H460和A549細(xì)胞遷移和侵襲。

ECM和基底膜的改變是腫瘤浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移的重要環(huán)節(jié)。Ⅳ型膠原纖維是ECM和基底膜的重要組分之一，金屬蛋白酶家族(matrix metalloproteinases，MMPs)中的MMP-2和MMP-9能有效地將其降解[9]。研究證實(shí)，MMP-2和MMP-9不僅可以降解ECM和基底膜，參與腫瘤黏附、侵襲和血管的侵入，而且與原發(fā)及轉(zhuǎn)移瘤的生長(zhǎng)、腫瘤的血管生成及腫瘤惡變有關(guān)[10]。此外，在多種具有侵襲性和高轉(zhuǎn)移腫瘤中都發(fā)現(xiàn)有MMP-2和MMP-9的表達(dá)增高。目前，研究表明MMP-2和MMP-9的表達(dá)水平與肺癌的分期、轉(zhuǎn)移和預(yù)后密切相關(guān)[11]。因此，抑制MMP-2和MMP-9的表達(dá)是抑制NSCLC侵襲和遷移的關(guān)鍵。采用RT-PCR 和Western blot研究發(fā)現(xiàn)，PD作用H460和A549細(xì)胞后，不僅在基因水平降低細(xì)胞中MMP-9 和 MMP-2 mRNA的表達(dá)，而且在蛋白質(zhì)的水平下調(diào)H460和A549細(xì)胞中MMP-2和MMP-9蛋白的表達(dá)，并呈時(shí)間和濃度依賴性。因此，PD抑制NSCLC細(xì)胞黏附、侵襲和遷移與抑制MMP-2和MMP-9的表達(dá)有關(guān)。

大量研究證明，MMP-9和MMP-2的表達(dá)主要受上游絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族(MAPKs)信號(hào)通路的調(diào)控。激活MAPKs通路可上調(diào)MMP-2和MMP-9的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移，反之，則抑制腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移[12]。MAPKs信號(hào)通路主要包括細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶 (extracellular signal-regulated kinase, ERK)通路、p38 MAPK通路和c-Jun-N端激酶(JNK)通路。并且，ERK信號(hào)通路即Ras/Raf/ERK信號(hào)通路在許多腫瘤的增殖、分化、侵襲、遷移和凋亡過(guò)程中起主要作用[13]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)Ras/Raf/ERK信號(hào)通路進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，PD可下調(diào)H460和A549細(xì)胞中Ras、p-c-Raf和p-ERK 1/2的表達(dá)，并呈濃度和時(shí)間依賴性。因此，PD抑制MMP-9和MMP-2表達(dá)可能與抑制其上游ERK信號(hào)通路有關(guān)。

此外，Akt通過(guò)激活MMP-9和MMP-2促進(jìn)腫瘤的侵襲和遷移[13-14]。因此，抑制Akt的表達(dá)被作為抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的調(diào)控靶點(diǎn)。并且研究發(fā)現(xiàn)，Akt的激活即形成磷酸化的Akt(p-Akt)與NSCLC的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，p-Akt的過(guò)表達(dá)可以提高NSCLC黏附、侵襲和轉(zhuǎn)移能力[15]。本實(shí)驗(yàn)研究表明，PD抑制H460和A549細(xì)胞中p-Akt的表達(dá)，并且呈濃度和時(shí)間依賴性。

綜上，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果首次證明了PD抑制NSCLC細(xì)胞H460和A549細(xì)胞黏附、侵襲和遷移，其作用與下調(diào)MMP-2和MMP-9 mRNA和蛋白的表達(dá)及抑制其上游ERK信號(hào)通路和p-Akt表達(dá)有關(guān)。由此表明，PD具有較好的抗NSCLC轉(zhuǎn)移作用，為PD的進(jìn)一步藥物研發(fā)和臨床應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和依據(jù)。然而，PD抑制MMP-2和MMP-9表達(dá)上游多個(gè)信號(hào)通路調(diào)控，和信號(hào)中的關(guān)鍵靶蛋白及其對(duì)應(yīng)的靶基因，有待通過(guò)靶蛋白抑制劑和siRNA沉默干擾技術(shù)深入研究，并且亟需通過(guò)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證PD抑制NSCLC轉(zhuǎn)移的作用。

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網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2015-1-9 13:37網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/doi/10.3969/j.issn.1001-1978.2015.02.019.html

Research on mechanisms of PD-induced inhibition of adhesion, invasion

and migration in non-small cell lung cancer H460 and A549 cells

ZHAO Ruo-lin, ZHOU Kun-fu, ZHANG Xu, CHEN Mei-juan

(SchoolofBasicMedicalSciences,NanjingUniversityofChineseMedicine，JiangsuCollaborative

InnovationCenterofTCMPreventionandTreatmentofTumor,Nanjing210023,China)

Abstract:AimTo explore the effects of the inhibition of cell adhesion, invasion and migration in non-small cell lung cancer (NSCLC) H460 and A549 cells induced by platycodin-D (PD) and its mechanism. MethodsCell adhesion assay, wound-healing assay and Transwell chamber migration assay were used to detect the ability of cell adhesion, migration and invasion. Regulation of MMP-2 and MMP-9 mRNA was determined by RT-PCR. Meanwhile, Western blot was performed to determine the expression levels of MMP-2/9, its upstream related proteins of ERK signaling pathway and p-Akt. ResultsPD effectively inhibited the ability of cell adhesion, invasion and migration in H460 and A549 cells in a dose-dependent manner (P<0.05). PD reduced the expression of MMP-2 and MMP-9 mRNA in H460 and A549 cells (P<0.01); meanwhile, PD down-regulated the expression levels of MMP-2/9, and inhibited the expression of its upstream proteins Ras, p-c-Raf, p-ERK 1/2 and p-Akt in a time- and dose-dependent manner. ConclusionsPD inhibits cell adhesion, invasion and migration in NSCLC cells, and these effects are related to the down-regulation of the expression of MMP-2 and MMP-9 mRNA and protein, and inhibition of its upstream expression of ERK signaling pathway and p-Akt.

Key words:platycodin-D; non-small cell lung cancer; adhesion; invasion; migration; matrix metalloproteinase-2(MMP-2); matrix metalloproteinase-9(MMP-9)

通訊作者周坤福(1960-)，男，博士，副教授，研究方向：中醫(yī)藥抗腫瘤及其機(jī)制，,Tel:025-85811037,E-mail：zhoukunfu@sina.com

作者簡(jiǎn)介：趙若琳(1987-)，女，碩士生，研究方向：中藥單體抗腫瘤及其機(jī)制，E-mail：bunny871201@163.com;

基金項(xiàng)目：江蘇省高校優(yōu)勢(shì)學(xué)科建設(shè)工程項(xiàng)目(PAPD)；歐盟第七框架項(xiàng)目(No PIRSES-GA-2013-612589)；江蘇自然基金資助項(xiàng)目(No BK20131415)

收稿日期:2014-10-29,修回日期:2014-12-03

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1001-1978(2015)02-0241-07

doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2015.02.019