趙健宇，劉靖

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)，湖南長沙410128）

高產(chǎn)纖維素酶菌株的篩選及其發(fā)酵條件的優(yōu)化

趙健宇，劉靖*

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)，湖南長沙410128）

從陳年谷酒酒醪中提取一株高產(chǎn)纖維素酶的菌株，利用形態(tài)和16SrDNA基因序列進行分析，確定該菌株為甲醇芽胞桿菌（Bacillus methylotrophicus）。利用產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)產(chǎn)生纖維素酶，研究碳源、氮源、培養(yǎng)基初始pH、起始溫度、培養(yǎng)時間和接種量對菌株產(chǎn)酶的影響。結(jié)果表明，菌株最合適的發(fā)酵條件為：最佳碳源為CMC-Na，最適氮源為（NH4）2SO4，最適pH為5.0，最適發(fā)酵時間為5d，最適溫度為30℃。從而篩選出高產(chǎn)纖維素霉菌株，優(yōu)化了發(fā)酵條件。

纖維素酶；發(fā)酵因素；甄選；正交試驗

纖維素是當(dāng)前世界上最普遍應(yīng)用的可重復(fù)再生的資源，隨著社會的發(fā)展，不可再生資源（如石油、天然氣等）的含量逐漸減少，利用纖維素轉(zhuǎn)化成其他物質(zhì)（如酒精、糖等）逐漸受到重視，同時也成為了當(dāng)下研究的新領(lǐng)域。纖維素可通過酶類的作用生成葡萄糖，乙醇的生成可以利用纖維素霉的作用生產(chǎn)，具有廣泛的發(fā)展遠(yuǎn)景，不僅可以用作汽車等機器的推進劑，而且降低了二氧化碳的生成，降低對不可再生資源（如石油、天然氣等）的依賴性[1]。

纖維素轉(zhuǎn)化為乙醇的2個過程的完成需要酶系催化。從未報道過有可直接催化纖維素的生物，同時該生物是具有較強能力的菌株，按分步糖化或同步糖化生產(chǎn)乙醇依舊是最佳方法[2]。所以，具有較強水平的纖維素霉菌株的選擇，可以很好的提升纖維素轉(zhuǎn)化乙醇的能力。此研究項目是土壤、酒醪、牲畜糞便中的高產(chǎn)纖維素霉菌株，使其發(fā)酵條件的提升。提升產(chǎn)酶效率，為利用纖維素酶在乙醇生產(chǎn)的應(yīng)用上準(zhǔn)備條件。

1 材料與方法

1.1 培養(yǎng)基配方

1.1.1 富集培養(yǎng)基

（NH4）2SO41.0g，Na2HPO4·7H2O 1.2g，KH2PO40.9g，MgSO4·7H2O 0.5g，KCl 0.5g，酵母膏0.5g，纖維素粉5.0g，加水至1 000mL，121℃，除菌25min[3]。

1.1.2 鑒別培養(yǎng)基

KH2PO41.0g，NaCl 2.5g，（NH4）2SO42.0g，MgSO40.5g，CMC-Na 2.0g，瓊脂10.0g，加水至1 000mL，121℃，滅菌25min[4]。

1.2 菌株的篩選

從牛糞便、陳年谷酒酒醪和湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)附近土樣中取樣，經(jīng)過不斷的集中培養(yǎng)擴增纖維素分解細(xì)菌的含量。將集中培養(yǎng)的菌液在纖維素-剛果紅培養(yǎng)基上培養(yǎng)至菌落長出，甄選透明圈/菌落直徑比值大于5的菌落，在發(fā)酵培養(yǎng)基上接種，放在30℃厭氧培養(yǎng)器材下培養(yǎng)48h，再接種到濾紙培養(yǎng)基中，將所需菌株提取出。

1.3 酶活力的測定方法

1.3.1 內(nèi)切纖維素酶（EG）的測定

取0.2mL粗酶液于試管中，加入0.1mol/L檸檬酸緩沖液（pH 4.8）1.5mL，再加入2mL 2%的CMC-Na溶液，50℃水浴30min，按DNS法測定還原糖量，依葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計算酶活。

1.3.2 外切纖維素酶（CBH）的檢測

取0.000 02L的霉液放入玻璃容器中，后添入0.1mol/L pH為4.8的檸檬酸緩沖液1.5mL，再加入50mg脫脂棉，50℃水浴1h，按DNS法測定還原糖量，對照葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計算酶活。

1.4 菌株的鑒定

1.4.1 菌株的形態(tài)鑒定

使用接種環(huán)選取少量菌體放在儀器上（載玻片），使用移液槍將PDA培養(yǎng)基滴到（1滴）接種的菌株上，確認(rèn)添滴的培養(yǎng)基在菌株上分布均勻。將接種好的載玻片置于28℃的恒溫箱培養(yǎng)48h，顯微鏡下觀察并拍照。

1.4.2 分子鑒定

取1mL培養(yǎng)了12h的菌體，利用高速離心機取出細(xì)胞，添加0.5mLCTAB抽提液，在60℃下，30min后填入等量大小的氯仿/異戊醇（24/1）混合液，完全混勻，使用離心機，將上清液加入到新的離心管中，添加1mL異丙醇，通過離心機，將上清液去除，將去除上清液的離心管清洗2次（用70%乙醇），待自然風(fēng)干后，添加30μL TE緩沖液，之后添加RNase，在37℃條件下保持30min。根據(jù)已發(fā)表的16S rDNA序列設(shè)計保守的擴增引物（F：AGAGTTTGATCMTGGCTCAG：TACGGYTACCTTGTTACGACTT），擴增產(chǎn)物送上海集美生物公司測序。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株篩選結(jié)果

挑選透明圈/菌落直徑比值較大菌株進行厭氧培養(yǎng)，各菌株生長情況見表1。

表1 菌株在厭氧環(huán)境下的生長情況

從上表可知，編號45、46、51、56、57、58、60、64、66、67的菌株為厭氧菌或兼性厭氧菌。將上述10株菌株分別接種到濾紙培養(yǎng)基中，發(fā)現(xiàn)56號菌株能在3d內(nèi)將濾紙完全崩解，其余菌株要一個星期才能崩解，且崩解程度比不上56號菌株。因此選定56號菌株做進一步研究。

2.2 鑒定結(jié)果

顯微鏡下觀察到菌絲如圖1所示。

圖1 菌絲顯微鏡觀察圖

從圖1可見，顯微鏡下觀察到菌絲有大量分枝，且多有橫隔，孢子梗的分支呈現(xiàn)不規(guī)律排列，常伴有彎曲。分生孢子呈橢圓形，表面粗糙，直接著生在孢子梗上。

16S rDNA基因序列分析表明：56號菌株的16S rDNA基因序列與甲醇芽胞桿菌（Bacillus methylotrophicus）的同源性達到了98%。初步可以確定56號菌株為甲醇芽胞桿菌（Bacillus methylotrophicus）。

2.3.菌株產(chǎn)酶受碳源的影響

將不同碳源（麩皮、稻草粉、葡萄糖、淀粉和CMC-Na）以1%的量添加到50mL無碳基礎(chǔ)培養(yǎng)基/250mL三角瓶中，溫度保持在28℃，不調(diào)控pH值，取發(fā)酵液分別測定EG和CBH酶活，結(jié)果如圖2所示。

圖2 不同碳源對誘變菌株產(chǎn)酶的影響

圖2結(jié)果表明，在以CMC-Na為唯一碳源的培養(yǎng)基中，EG和CBH酶活均最高；其次是以麩皮為碳源的培養(yǎng)基；對稻草粉的利用率最差。

2.4 菌株產(chǎn)酶受氮源的影響

將不同氮源（蛋白胨、黃豆粉、尿素、硫酸銨和硝酸銨）以1%的量添加到50mL無氮基礎(chǔ)培養(yǎng)基/250mL三角瓶中，溫度保持在28℃，不調(diào)控pH值，取發(fā)酵液分別測定EG和CBH酶活，結(jié)果如圖3所示。

圖3 不同氮源對誘變菌株產(chǎn)酶的影響

圖3結(jié)果顯示，較多氮源都可被該菌株利用，當(dāng)（NH4）2SO4是氮源時，EG和CBH的酶活最高；而對NH4NO3的利用最差。

2.5 初始pH對菌株產(chǎn)酶的影響

在50mL產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基中，以1%的接種量將菌株接種到培養(yǎng)基里，分別調(diào)節(jié)pH為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0和10.0，28℃下進行為期150r/min的培養(yǎng)，取發(fā)酵液分別測定CBH酶活和EG。圖4表明，pH范圍為4.0～6.0時，酶活力能維持在較高水平。其中，達到高峰水平的pH為4.0，pH值超過6.0時水平明顯下降；pH值為10.0時基本上測不到酶活力。

圖4 纖維素酶活力受初始pH的影響

2.6 初始溫度對菌株產(chǎn)酶的影響

將菌株以1%的接種量接種到50mL產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基（250mL三角瓶中），分別于25～40℃（以3℃為一個梯度），在150r/min的條件下培養(yǎng)3d，分別監(jiān)測發(fā)酵液的EG和CBH酶活。圖5表明，28～31℃為該菌株的最佳產(chǎn)酶溫度，28℃時EG酶活最高，31℃時CBH酶活最高。低溫環(huán)境下不適用于該菌株的生長，高溫環(huán)境下菌株被抑制生長，到溫度最高時該菌株的菌絲體生長基本停止，酶活很低。

圖5 初始溫度對菌株產(chǎn)酶的影響

2.7 發(fā)酵時間對菌株產(chǎn)酶的影響

將菌株以1%的接種量接種到50mL產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基（250mL三角瓶中），在150r/min的條件下，分別培養(yǎng)1～7d，取發(fā)酵液分別監(jiān)測EG和CBH酶活。圖6表明，在培養(yǎng)前2d，菌株的EG和CBH酶活增幅較小，2～5d酶活增幅加快，EG酶活達到最高值是在第4天，第5天CBH酶活最高。5d后兩種酶的活性快速下降，所以該菌株的最適培養(yǎng)階段為4～5d。

圖6 纖維素酶活力受培養(yǎng)時間的影響

3 結(jié)論

從陳年谷酒酒醪等選擇物質(zhì)中，得到70株左右具有較高水平的纖維素酶菌株，厭氧或兼性厭氧菌有10株。其中，出產(chǎn)纖維素酶能力最強的是56號菌株，通過生理生化分析和分子鑒定，可初步認(rèn)為甲醇芽胞桿菌（Bacillus methylotrophicus）。通過正交試驗和單因素試驗的檢驗，56號菌株具有最合適的發(fā)酵條件：最佳碳源為CMC-Na，最適氮源為（NH4）2SO4，最適pH為5.0，最適發(fā)酵時間為5d，最適溫度為30℃。

[1]李素波.纖維素酶高產(chǎn)菌株的選育及發(fā)酵條件的優(yōu)化[D].蘭州:蘭州大學(xué),2008.

[2]孫多志,許慶利,王復(fù),等.木質(zhì)纖維素制取燃料乙醇水解工藝技術(shù)進展[J].河南化工,2008,25(4):1-4.

[3]文新亞,李燕松,張志鵬,等.酶解木質(zhì)纖維素的預(yù)處理技術(shù)研究進展[J].釀酒科技,2006,23(8):97-100.

[4]于斌,齊魯.木質(zhì)纖維素生產(chǎn)燃料乙醇的研究現(xiàn)狀[J].化工進展,2006,25(3):244-249.

Screening of High Yield Cellulase Strains and Optimization of Its Fermentation Conditions

Zhao Jian-yu,Liu Jing*
(Hunan Agricultural University,Hunan Changsha 410128)

A high yield cellulase strains was extracted from the old Valley wine mash filter,morphological and 16SrDNA gene sequences were used for analysis,the strain was identified as Bacillus methylotrophicus.Cellulase production was carried out by fermentation medium,and the effects of carbon source,nitrogen source,initial pH,initial temperature,incubation time and inoculation amount on the enzyme production were studied.The results showed that the optimal fermentation conditions were as follows: the optimum carbon source was CMC-Na,the optimum nitrogen source was (NH4)2SO4,the optimum pH was 5,the optimum fermentation time was five days,and the optimum temperature was 30 ℃.

Cellulase;Fermentation factors;Selection;Orthogonal test

TQ925

A

2096-0387（2017）03-0043-04

趙健宇（1992-），男，遼寧鞍山人，在讀研究生，研究方向：環(huán)境生態(tài)學(xué)。

劉靖（1986-），男，湖南長沙人，碩士，講師，研究方向：作物學(xué)。