盧金蓮，胡維民，曹衛(wèi)群，陶怡*，張旭敏

（1.上海藥明康德新藥開發(fā)有限公司生物分析部，上海200131；2.復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，上海200433）

超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法聯(lián)合衍生化測定大鼠腦透析液中多巴胺和5-羥基色胺

盧金蓮1，2，胡維民1，曹衛(wèi)群1，陶怡1*，張旭敏2

（1.上海藥明康德新藥開發(fā)有限公司生物分析部，上海200131；2.復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，上海200433）

本文建立超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）結(jié)合衍生化的方法，并快速測定大鼠腦組織微透液中多巴胺（DA）和5-羥基色胺（5-HT）的濃度。采用苯甲酰氯衍生化的方法進(jìn)行透析液樣品預(yù)處理。在2.3min分析時(shí)間內(nèi)，各組分得到很好的分離。使用10μL透析液樣品，DA和5-HT的定量下限可分別達(dá)到10pg/mL和5pg/mL，DA的線性范圍為10～5 000pg/mL，5-HT的線性范圍為5～2 500pg/mL，決定系數(shù)（R2）大于0.99。通過對(duì)質(zhì)量控制樣品的分析，該方法的靈敏度和精密度得到了驗(yàn)證。此方法可以成功地應(yīng)用于微透析研究這兩種神經(jīng)遞質(zhì)的基礎(chǔ)水平檢測。

多巴胺；5-羥基色胺；微透析；神經(jīng)遞質(zhì)；液質(zhì)聯(lián)用

微透析技術(shù)（Microdialysis）是一種可以從清醒活體獲取細(xì)胞間隙 液的取樣技術(shù)，其可以實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)檢測目標(biāo)組織中生物化學(xué)物質(zhì)含量的變化。同時(shí)，其是一種微創(chuàng)的采樣技術(shù)，幾乎可以被用于連續(xù)測量任何組織的細(xì)胞外液中游離及結(jié)合分析物的濃度[1]。其能監(jiān)測完整細(xì)胞外液物質(zhì)（包括內(nèi)源性和外源性）的動(dòng)態(tài)變化，是目前在生理和病理情況下，研究活體藥物腦內(nèi)分布、藥物透過血腦屏障情況及監(jiān)測腦內(nèi)藥物有效活性物質(zhì)和神經(jīng)遞質(zhì)變化的方法[2，3]。微透析技術(shù)已日益成為藥物腦部研究的重要工具[4-8]。

神經(jīng)遞質(zhì)廣泛分布于哺乳動(dòng)物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)、腦組織和體液中，其痕量測定對(duì)神經(jīng)生理學(xué)、運(yùn)動(dòng)生理學(xué)、病理學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)及疾病診斷等具有重要意義。阿爾茲海默病、帕金森、亨丁頓舞蹈癥皆為神經(jīng)系統(tǒng)疾病且都與單胺類神經(jīng)遞質(zhì)水平異常有關(guān)[9]。因此，在新藥研發(fā)過程中，能夠快速、準(zhǔn)確地監(jiān)測給藥前后，腦透析液中此類神經(jīng)遞質(zhì)的水平變化，對(duì)新藥的篩選、評(píng)價(jià)有非常重要的意義。

腦透析液的樣品一般具有以下幾個(gè)特點(diǎn)：①腦組織細(xì)胞間質(zhì)中大多數(shù)神經(jīng)遞質(zhì)的濃度都非常低；②樣品量非常有限；③使用的灌注液中含有的無機(jī)離子可能會(huì)影響神經(jīng)遞質(zhì)的定量分析[10]。因而，微透析技術(shù)需與分離效果好、定量準(zhǔn)確、靈敏度高的分析方法相結(jié)合，才能在樣品量有限的前提下檢測到腦透析液中痕量的神經(jīng)遞質(zhì)。由此可見，建立一種靈敏度、重現(xiàn)性、分離度好的分析方法，是微透析研究成功的關(guān)鍵因素。分析方法一旦建立，還可以應(yīng)用于血漿、尿液、組織等其他生物樣品中神經(jīng)遞質(zhì)的測定。

由于單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的濃度低于其他類神經(jīng)遞質(zhì)（pmol/L級(jí)），所以其分析難度遠(yuǎn)高于其他類神經(jīng)遞質(zhì)，缺乏快速高效的樣品前處理方法和高靈敏的檢測手段仍是目前深入開展研究的瓶頸[11]。目前檢測單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的方法主要有分光光度法、化學(xué)發(fā)光法、化學(xué)熒光法、液相色譜法、電化學(xué)法和毛細(xì)管電泳法等[12，13]。前兩種方法由于靈敏度的限制，很少應(yīng)用于微透析樣品檢測。高效液相色譜法與熒光法、電化學(xué)檢測法、質(zhì)譜法的聯(lián)用是目前比較常用的分析方法[14-18]。高效液相色譜與熒光光譜法聯(lián)用，靈敏度高，選擇性好，線性范圍較寬，受外界條件的影響較小。但并不是所有的目標(biāo)檢測物在相同的條件下都能發(fā)生熒光，因而其應(yīng)用范圍較窄，在進(jìn)行定量分析時(shí)，同時(shí)需要排除背景熒光和猝滅效應(yīng)等的影響，并且需要確保作為流動(dòng)相的溶劑在選擇的激發(fā)光照射下不會(huì)發(fā)射熒光，否則不能進(jìn)行梯度洗脫。此外，高效液相色譜與熒光法聯(lián)用往往需要較長的分析時(shí)間（10～60min），且需要對(duì)樣品進(jìn)行前處理[15-17]。電化學(xué)檢測法優(yōu)點(diǎn)是靈敏度高、選擇性好，可測定大量非電活性物質(zhì)中極痕量的電活性物質(zhì)、線性范圍寬，但不能同時(shí)檢測多個(gè)神經(jīng)遞質(zhì)，電極有被污染的風(fēng)險(xiǎn)，而且有時(shí)候會(huì)出現(xiàn)干擾峰，干擾目標(biāo)分析物的定量[12，18-19]。與其他技術(shù)相比，液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)是目前普遍適用于與微透析結(jié)合進(jìn)行分離、分析的技術(shù)。超高效液相色譜能顯著改善色譜峰的分離度和檢測靈敏度，同時(shí)大大縮短分析周期，因此特別適用于微量復(fù)雜混合物的分離和高通量研究[20-22]。

目前，運(yùn)用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法檢測腦透析液中單胺類的神經(jīng)遞質(zhì)多巴胺（DA）和5-羥基色胺（5-HT）主要有以下難點(diǎn)：①為了改善相對(duì)回收率，微透析經(jīng)常采用較低的流速（0.5～5.0μL/min），因此微透析技術(shù)常承受著樣品量低的困擾[3]；②細(xì)胞間質(zhì)中大多數(shù)神經(jīng)遞質(zhì)的濃度都非常低，特別是單胺類神經(jīng)遞質(zhì)，所以要求非常低的定量下限；③待測物在質(zhì)譜上的響應(yīng)較低，而且極性大，在反相色譜上難保留。本文針對(duì)這些難點(diǎn)，用化學(xué)衍生化結(jié)合反相超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，建立了一種簡單、快速、易操作的檢測方法，同時(shí)檢測DA和5-HT。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器和試劑

AB SCⅠEX QTRAP 6500+質(zhì)譜（AB SCⅠEX）；ACQUⅠTY UPLC 超高壓液相和自動(dòng)進(jìn)樣器（Waters）；Milli-Q 超純水凈化器（Millipore）；微型渦旋混合儀（上海汾西分析儀器廠）；多管混勻儀（Fisher Scientific）；1.5mL離心管（Eppendorf）；96孔進(jìn)樣板（Corelle Life Science Co.Ltd.）。

乙腈，甲醇（色譜純，Merck）；人工腦脊液（Artificial CSF）（Harvard apparatus）；苯甲酰氯，純度≥99%（Sigma-Aldrich）；四硼酸鈉，純度99.5%（Alfa Aesar）。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)品及內(nèi)標(biāo)

鹽酸多巴胺（DA）、5-羥基色胺鹽酸鹽（5-HT）純度分別99.9%和99%，購買于Sigma Aldrich；同位素內(nèi)標(biāo)2-(3,4-Dihydroxyphenyl) ethyl-1,1,2,2-d4-amine HCl (d4-DA)、Serotonin-α,α,β,β-d4 Creatinine Sulfate Complex (d4-5-HT)購買于C/D/NⅠsotopes Ⅰnc.。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品衍生化方法

四硼酸鈉粉末稱重后，配制100mM水溶液備用，加熱后溶解。取10μL透析液樣品加入1.5mL離心管中，然后依次加入25μL四硼酸鈉水溶液和25μL2%苯甲酰氯乙腈溶液，搖勻之后室溫震蕩30min，反應(yīng)完成，將樣品轉(zhuǎn)移至96孔進(jìn)板，準(zhǔn)備進(jìn)樣。

1.3.2 色譜條件

色譜柱：ACQUⅠTY UPLC? BEH C18 2.1mm×50mm Ⅰ.D.，1.7μm（Waters）；柱溫55℃，流速0.6mL/min，進(jìn)樣量15μL；流動(dòng)相A，0.025%甲酸和1mmol/L乙酸銨在5%乙腈溶液中；流動(dòng)相B，0.025%甲酸和1mmol/L乙酸銨在95%乙腈溶液中；洗脫梯度如表1所示。

表1 液相洗脫梯度

1.3.3 質(zhì)譜條件

電離模式，電噴霧離子化；離子源，渦輪噴霧；霧化氣，65psi；輔助加熱氣，65psi；氣簾氣，40psi； 噴霧電壓5500V；離子源溫度500℃；掃描模式，正離子多反應(yīng)離子監(jiān)測，參數(shù)如表2所示。

表2 多巴胺，5-羥基色胺及同位素內(nèi)標(biāo)的母離子，子離子，碰撞能量和保留時(shí)間

1.3.4 數(shù)據(jù)采集和處理

化合物和內(nèi)標(biāo)的保留時(shí)間、色譜圖采集和色譜圖的積分及數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)由軟件Analyst（Applied Biosystems，版本號(hào)1.6.3，F(xiàn)oster City，CA，USA）進(jìn)行處理。校正曲線以1/x2為加權(quán)系，用峰面積比值（分析物/內(nèi)標(biāo)）對(duì)校正標(biāo)樣中DA和5-HT的濃度進(jìn)行線性回歸。

1.3.5 校正曲線和質(zhì)控樣品的配制

稱量DA和5-HT的標(biāo)準(zhǔn)品，分別用20%乙腈溶液溶解成1mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液，存儲(chǔ)于-80℃冰箱備用。

分別量取DA和5-HT的標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液（1mg/mL在20%乙腈/水溶液中），用20%乙腈稀釋到10μg/mL和5μg/mL作為儲(chǔ)備液1；然后繼續(xù)稀釋20倍，得到200ng/mL和100ng/mL的儲(chǔ)備液2；最后，用人工腦脊液稀釋成DA濃度范圍為10～5 000pg/mL，5-HT濃度范圍為5～2 500pg/mL的校正曲線。質(zhì)控樣品用相同的方式配制成定量下限、低、中和高4個(gè)濃度。

2 結(jié)論和討論

2.1 衍生化反應(yīng)路徑

DA和5-HT的結(jié)構(gòu)中都有氨基，可以與醛、酮反應(yīng)或與酰鹵反應(yīng)來衍生化[23，24]。與醛、酮反應(yīng)相對(duì)與酰鹵反應(yīng)來說反應(yīng)條件較復(fù)雜，通常需要較長的反應(yīng)時(shí)間或者嚴(yán)格的pH控制。本文采用苯甲酰氯作為衍生化試劑，對(duì)DA和5-HT進(jìn)行羥基和氨基的?；磻?yīng)。例如，苯甲酰氯可以與DA的氨基及2個(gè)酚羥基發(fā)生反應(yīng)，共3個(gè)分子的苯甲酰氯結(jié)合在DA上，衍生化的結(jié)合位點(diǎn)及路徑如圖1所示。

圖1 多巴胺衍生化路徑

2.2 線性范圍

大鼠腦部微透析的動(dòng)物試驗(yàn)是將灌注液（Artificial CSF）通過探針灌注到目標(biāo)位置，由于灌注液的稀釋，微透析樣品中神經(jīng)遞質(zhì)的濃度要低于在大腦中的濃度。因此，微透析樣品中神經(jīng)遞質(zhì)的檢測限越低越好。該試驗(yàn)中，DA的線性范圍為10～5 000pg/mL，校準(zhǔn)曲線的濃度設(shè)置由低到高分別是10、20、50、250、500、2 500、4 250pg/mL和5 000pg/mL；5-HT的線性范圍為5～2 500pg/mL，校準(zhǔn)曲線的濃度設(shè)置有低到高分別是5、10、25、125、250、150、2 125pg/mL和2 500pg/mL。標(biāo)準(zhǔn)曲線采用線性回歸，DA和5-HT的校正曲線決定系數(shù)（R2）分別0.995 2和0.999 5。

2.3 分析方法靈敏度

DA和5-HT的定量下限具有良好的信噪比和靈敏度。在人工腦脊液中的定量下限分別是10pg/mL和5pg/mL，DA和5-HT的定量下限色譜峰如圖2所示。

圖2 DA和5-HT的定量下限色譜峰

2.4 準(zhǔn)確度和精密度

準(zhǔn)確度和精密度通過定量下限、低、中、高4個(gè)濃度，每個(gè)質(zhì)控樣品濃度水平6個(gè)測定值來評(píng)價(jià)以考察方法的準(zhǔn)確性和精密度，DA的4個(gè)質(zhì)控樣品濃度分別為10、30、1 500、4 000pg/mL，平均的準(zhǔn)確度為98.6%～107.7%，變異系數(shù)為1%～13%；5-HT的4個(gè)質(zhì)控樣品濃度分別為5、15、750、2 000pg/mL，平均的準(zhǔn)確度為95.8%～111.8%，變異系數(shù)為2%～5%。

2.5 實(shí)際樣品檢測

利用微透析技術(shù)采集腦部透析液，每隔20min采集一次，在40min處大鼠給藥安非他命（Amphetamine）2mg/kg，得到的安非他命，在給藥前后腦透析液中DA和5-HT的濃度變化情況如圖3所示。結(jié)果顯示，本方法能夠檢測大鼠在給藥前腦部透析液中DA和5-HT的基礎(chǔ)水平，以及給藥之后透析液中DA和5-HT隨時(shí)間的變化情況。由此說明，本方法靈敏度高，可滿足大鼠腦微透析試驗(yàn)的樣品檢測。

圖3 安非他命及多巴胺和5羥基色胺在給藥安非他命前后在大鼠腦透析液中的變化

3 結(jié)論

本文成功開發(fā)了超高壓液相-串聯(lián)質(zhì)譜結(jié)合衍生化檢測人工腦脊液中DA和5-HT的方法，本方法的優(yōu)點(diǎn)是：①定量下限低，完全滿足微透析樣品檢測需求，可以檢測到透析液樣品中DA和5-HT的基礎(chǔ)水平；②操作簡單，衍生化方法簡單、快速、易操作、重現(xiàn)性好，反應(yīng)僅需30min，可進(jìn)行批量樣品處理；③UPLC-MS/MS 方法快速，僅2.3min即可達(dá)到很好的分離效果，并且通過衍生化處理，改善了DA和5-HT在反相色譜上的保留，尤其顯著提高了質(zhì)譜響應(yīng)；④本方法檢測限低，線性范圍良好，同時(shí)具有較好的準(zhǔn)確性和精密度。

此方法不僅可用于大鼠腦微透析樣品檢測，前處理方法稍加改變即可應(yīng)用于其他生物基質(zhì)的樣品檢測。

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Simultaneous Quantification of Dopamine and 5-hydroxytryptaphane in Rat Brain Dialysate by Ultra Performance Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry

Lu Jin-lian1,2,Hu Wei-min1,Cao Wei-qun1,Tao Yi1*,Zhang Xu-min2
(1.Non-GLP BAS,WuXiAppTec,Shanghai 200131;2.School of Science,Fudan University,Shanghai 200433)

In this paper,a method was developed for the combination of ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS) and derivatization,to determine the concentration of dopamine (DA) and 5-hydroxytryptaphane (5-HT) in the rat brain dialysates.Benzoyl chloride was used as derivatization reagent.The components were well separated in the 2.3min.Using 10 μL dialysate samples,the lower limit of DA and 5-HT could reach 10 pg/mL and 5 pg/mL respectively,the linear range of DA was from 10 to 5 000 pg/mL,the linear range of 5-HT was from 5 to 2 500 pg/mL,and the determination coefficient (R2) was greater than 0.99.The sensitivity and precision of the method were verified by the analysis of the quality control samples.This method can be successfully applied to the microdialysis study of the basal level detection of both the neurotransmitters.

Dopamine;5-hydroxytryptaphane;Microdialysis;Neurotransmitter;Liquid chromatography-mass spectrometry

R446.1；O657.63

A

2096-0387（2017）03-0035-05

盧金蓮（1987-），女，遼寧丹東人，碩士在讀，研究方向：生物樣本定量分析。

陶怡（1974-），女，河北天津人，博士，研究方向：生物分析。