徐國良，黃燕，涂招秀,李雄輝，胡居吾

（江西省科學(xué)院，江西南昌330096）

葛根酒中葛根素含量測定及其抗氧化性能研究

徐國良，黃燕，涂招秀,李雄輝，胡居吾

（江西省科學(xué)院，江西南昌330096）

采用SYKAM S501 Series液相色譜儀，Shimadzu Shim-pack VP-ODS C18色譜柱（5μm，4.6mm×250mm），甲醇∶水=35∶65為流動(dòng)相，檢測波長為250nm，快速測定葛根酒中葛根素含量，并通過超氧陰離子自由基（O2-·）、羥基自由基（·OH）、1，1-二苯基-2-苯基自由基（DPPH·）清除率測定法評(píng)價(jià)葛根酒體外抗氧化活性。結(jié)果表明，葛根酒中葛根素的含量為160.83μg/mL。其對(duì)1，1-二苯基-2-苯基自由基的清除率達(dá)到53.1%，對(duì)羥基自由基的清除率 達(dá)到35.67%，對(duì)超氧陰離子自由基的清除率達(dá)到75.36%。這說明葛根酒中含有較多的葛根素，具有較強(qiáng)的體外抗氧化活性，并具有一定的保健作用。

葛根酒；葛根素；高效液相；抗氧化活性

葛根為多年生豆科藤本植物，原產(chǎn)于東南亞地區(qū)，如中國、韓國和日本。藥用價(jià)值高，國人稱之為“南方人參”，國際上譽(yù)稱“亞洲人參”。傳統(tǒng)上一直用于治療急性腹瀉、痢疾、耳聾與心血管等疾病[1，2]，在中國南方及美國北部葛根被用作煲湯資源及膳食補(bǔ)充劑[3]。2000年，葛根和粉葛被收入中國藥典，統(tǒng)稱為葛根，由于其主要成分葛根素含量的不同，直到2005年中國藥典修訂版才將二者分開，即為葛根和粉葛。葛根主要有效活性成分有異黃酮、葛根素、葛根苷、生物堿等物質(zhì)[2，4]，富含鐵、鈣、硒、鍺和錳等人體必需的微量元素。葛根及其制品有清火、排毒、降血壓、降膽固醇、降血糖、減肥和通便，預(yù)防老年性癡呆，防止動(dòng)脈硬化，防止腦血栓等心腦血管疾病之良效。我國衛(wèi)生部2002年正式公布葛根為“藥食同源”植物，可用于功能性保健食品及新藥的研發(fā)[1，5]。

目前在葛根酒的研究中多添加糯米、玉米和粳米，以根霉或黑曲霉類為主要發(fā)酵劑釀制葛根黃酒[6-8]，而以純葛根為原料，釀造低度發(fā)酵酒方面的相關(guān)研究只有零星報(bào)道[9]。本研究以葛根作為釀酒原料，利用淀粉酶和糖化酶快速糖化葛根淀粉，葡萄酒酵母和木糖酵母混合發(fā)酵，在較短的時(shí)間內(nèi)釀制具有葛根風(fēng)味的低度發(fā)酵酒，以葛根酒為考察對(duì)象，采用RP-HPLC法建立測定其中葛根素含量的方法，并測定抗氧化活性，可為葛根保健酒質(zhì)量品質(zhì)控制提供精確的含量檢測方法，并為葛根中藥材現(xiàn)代深加工中的應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品

葛根采自于江西省東鄉(xiāng)縣，葛根酒由江西省科學(xué)院應(yīng)用化學(xué)研究所釀制。

1.1.2 試劑

葛根素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（96.0%，中國食品藥品檢定研究院），二苯基苦味?；诫拢―PPH）購于Sigma公司。抗壞血酸、鄰苯三酚、無水乙醇、過氧化氫、七水硫酸亞鐵、水楊酸、鹽酸、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、三氯化鐵、氫氧化鈉和濃硫酸等試劑均為分析純，色譜甲醇均購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

SYKAM S501 Series高效液相色譜儀；S-3250紫外檢測器；S-4115柱溫箱；S-5300自動(dòng)進(jìn)樣器；S-1130四元泵；SYKAM色譜工作站；分析天平，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；Tecan infinite M200PRO酶標(biāo)儀，瑞士Tecan公司；Direct-Q3 CHAO超純水系統(tǒng)，美國密理博公司；微孔溶劑過濾器，天津津騰過濾器件廠；津騰微孔過濾膜（直徑50mm，孔徑0.45μm）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 葛根素標(biāo)準(zhǔn)曲線

用精度為萬分之一的電子天平精密稱定葛根素對(duì)照品44mg，將該對(duì)照品溶解后用35%甲醇溶液定容于10mL容量瓶中，制得4.4mg/mL葛根素對(duì)照品溶液，以此液為母液，分別精密移取，制備梯度濃度對(duì)照品，則葛根素對(duì)照品濃度分別為880、440、220、110μg/mL和55μg/mL。以濃度（X）對(duì)峰面積（Y）作圖繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.2 色譜條件

色譜柱Shimadzu Shim-pack VP-ODSC18色譜柱（5μm，4.6mm×250mm），甲醇∶水=35∶65為流動(dòng)相，檢測波長為250nm，流速為1mL/min，柱溫為30℃，進(jìn)樣量為10μL。

1.3.3 葛根酒中葛根素樣品測定

吸取自制葛根酒1mL，過微孔濾膜，進(jìn)樣量為10μL，注入高效液相色譜議。

1.3.4 DPPH·清除率的測定

按照Hu[10]方法稍作修改，取葛根酒及維生素C（濃度為100μg/mL）100μL加到96孔透明板中，分別加入100μL 0.2mM的DPPH溶液。依照相同的操作方法，將葛根酒樣品液分別與80%甲醇混勻作為空白組，采用酶標(biāo)儀在波長517nm處測其吸光值，重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)，每次3組平行，取平均值。DPPH·清除率的計(jì)算公式如下：DPPH清除率/%=[1-（Asample-Ablank）/Acontrol]×100%。其中，Asample為DPPH溶液與樣品液的吸光度之和，Ablank為樣品與溶劑的吸光度之和，Acontrol為DPPH溶液與溶劑的吸光度之和。

1.3.5 羥基自由基清除率的測定

參照文獻(xiàn)[11]的方法進(jìn)行改良，利用H2O2和FeSO4混合發(fā)生Fenton反應(yīng)，生成具有高反應(yīng)活性的·OH，以抗壞血酸作陽性對(duì)照，在96孔板中依次加入6mmol/L FeSO4溶液50μL、葛根酒溶液50μL，6mmol/L H2O2溶液50μL，搖勻，靜置10min，再加入6mmol/L水楊酸溶液50μL，搖勻，水浴37℃保溫30min采用酶標(biāo)儀在波長510nm處測其吸光值，重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)，每次3組平行，取平均值。測得樣品吸光度為Ai；用水代替水楊酸時(shí)測得本底Aj，用水代替樣品時(shí)測得空白對(duì)照A0。·OH自由基清除率的計(jì)算公式如下：·OH自由基清除率/%=[1-（Ai-Aj）/A0]×100%。

1.3.6 對(duì)超氧陰離子自由基（O2-·）的清除作用

實(shí)驗(yàn)在參考羅秋水等[12]的方法上進(jìn)行改良。采用鄰苯三酚自氧化法測定對(duì)·的清除作用，具體步驟是：在離心管中依次加入0.05mol/L Tris-HCl緩沖液（pH=8.2）450μL，25℃恒溫水浴20min，分別加入50μL試樣和40μL 25mmol/L鄰苯三酚溶液，混勻后于25℃水浴反應(yīng)5min，加入8mmol/L HCl終止反應(yīng)，于波長299nm處測定吸光度Ai?？瞻讓?duì)照組以同樣體積的蒸餾水代替樣品（A0）。每個(gè)試樣做3個(gè)平行樣，取平均值。超氧陰離子自由基清除率計(jì)算公式如下：·清除率/%=[（A0-Ai）/Ao]×100%。

2 結(jié)果與討論

2.1 葛根酒中葛根素的含量

依照上述色譜條件依次注入液相色譜儀，以峰面積積分值Y為縱坐標(biāo)，以標(biāo)品葛根素的濃度值X為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得葛根素的線性回歸方程Y=48.864X+611.05，R2=0.999 7。標(biāo)準(zhǔn)曲線圖見圖1，葛根素對(duì)照品色譜圖如圖2所示。

圖1 葛根素標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖2 葛根素標(biāo)品（A）和葛根酒樣品（B）色譜圖

根據(jù)所得葛根酒樣品峰面積，代入標(biāo)準(zhǔn)方程，所得葛根酒中葛根素含量為160.83μg/mL。王明強(qiáng)等[13]報(bào)道云南省沾益福上福葛根酒業(yè)有限公司生產(chǎn)的葛根酒中葛根素含量，葛根酒A中葛根素的含量為1.0mg/100mL，葛根酒B中葛根素的含量為1.5mg/100mL，葛根酒C中葛根素含量為1.3mg/100mL，葛根酒D中葛根素的含量為0.79mg/100mL。而本課題釀制的葛根酒中葛根素的含量為16.083mg/100mL，高出15倍之多，這可能與葛根原料和釀造工藝不同所引起的。廣東蕉嶺縣滸竹酒廠釀制的“中葛008”葛根酒葛根素含量為15.4mg/100mL，其原料以葛根、葛花為主料，并與富含生物色素的桑果、黑豆、有機(jī)蜂蜜等黑色食品為配料[1]。嚴(yán)格意義上說，本課題研制的葛根酒含量略高于“中葛008”葛根酒。

2.2 抗氧化能力

清除DPPH自由基是一種用途最為廣泛的抗氧化模型，由于其快捷、高效、穩(wěn)定的特點(diǎn)常被用來檢測各種樣品的清除自由基的能力。由圖3可知，維生素C濃度為100μg，葛根酒對(duì)DPPH自由基的清除率為53.10%，對(duì)DPPH自由基的清除能力可能是葛根酒中所含異黃酮的羥基具有供氫質(zhì)體能力的結(jié)果。

圖3 葛根酒對(duì)1，1-二苯基-2-苯肼自由基、羥基自由基和超氧陰離子自由基的清除作用

羥基自由基化學(xué)性質(zhì)特別活潑，也是毒性最大的自由基，幾乎與細(xì)胞內(nèi)各類有機(jī)物反應(yīng)，是造成組織脂質(zhì)過氧化、蛋白質(zhì)解聚與聚合、核酸斷裂、多糖解聚的重要活性氧，而羥基自由基清除率是反映其抗氧化作用的重要指標(biāo)[14]。Fenton反應(yīng)是產(chǎn)生羥基自由基的重要機(jī)理。本試驗(yàn)中考察葛根酒對(duì)·OH的清除效果，對(duì)·OH自由基的清除率為35.67%。

鄰苯三酚自氧化反應(yīng)產(chǎn)生超氧陰離子自由基且其自身氧化產(chǎn)物在322nm處有紫外吸收。在pH＜9.0時(shí)，鄰苯三酚自氧化速率與生成的超氧陰離子自由基濃度呈正相關(guān)，故可通過紫外吸收來定量測定抗氧化劑在此體系中對(duì)超氧陰離子自由基的清除作用，間接評(píng)價(jià)葛根酒的抗氧化能力[15]。對(duì)超氧陰離子自由基的清除率為75.36%。

在正常情況下，機(jī)體內(nèi)的自由基處于動(dòng)態(tài)平衡中，如果該平衡被打破，就會(huì)對(duì)機(jī)體造成損害，從而引發(fā)一系列相關(guān)疾病[16]。本實(shí)驗(yàn)中采用3種常用的體外抗氧化模型評(píng)價(jià)葛根酒的抗氧化活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，葛根酒對(duì)DPPH自由基、羥基自由基和超氧陰離子自由基都有良好的清除效果，這與里面含有大量的葛根素等異黃酮類物質(zhì)有關(guān)。就3種自由基相比，葛根酒在清除超氧陰離子自由基方面顯示出更強(qiáng)的能力，而對(duì)羥基自由基清除能力最弱。由此可知，同一抗氧化物質(zhì)在不同的環(huán)境下抗氧化效力并不相同，使用時(shí)宜讓其處于最佳的反應(yīng)環(huán)境以發(fā)揮其最大的抗氧化功效[11]。

3 結(jié)論

葛根在預(yù)防高血壓、動(dòng)脈硬化、祛痰、解熱，提高機(jī)體免疫能力，抗菌抗病毒、解酒、抗腫瘤及益智等方面均呈現(xiàn)出良好的效果，這可能與葛根在各種體系中表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗氧化活性有關(guān)。目前，國內(nèi)外已將抗氧化檢測用于抗衰老等保健食品的評(píng)價(jià)，對(duì)保健食品的開發(fā)具有積極作用。本研究以葛根作為釀酒原料，釀制具有葛根風(fēng)味的低度發(fā)酵酒，對(duì)DPPH自由基、羥基自由基和超氧陰離子自由基都有良好的清除效果，為葛根中藥材現(xiàn)代深加工中的應(yīng)用提供參考依據(jù)。

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Determination of Puerarin Content in Pueraria Wine and Its Antioxidantion

Xu Guo-liang,Huang Yan,Tu Zhao-xiu,Li Xiong-hui,Hu Ju-wu
(Jiangxi Academy of Sciences,Jiangxi Nanchang 330096)

SYKAM S501 Series High Performance Liquid Chromatography was used for rapid measurement of puerarin content in pueraria wine (Shimadzu Shim-pack (5 μm，4.6 mm× 250 mm),methanol∶water =35∶65 as mobile phase,and detection wavelength was 250 nm),and through measuring scavenging rate of ultra oxygen anion free radical,hydroxyl radicals (·OH) and 1， 1-diphenyl-2-phenyl-free radical (DPPH·) was to evaluate the antioxidant activity of pueraria wine in vitro.The results showed that the content of puerarin in pueraria wine was 160.83μg/mL and the scavenging rate of DPPH·,·OH and·free radical reached 53.1%,35.67% and 75.36%respectively.This shows that puerarin wine contains many puerarin compound,which has strong antioxidant activity in vitro and has healthcare functions.

Puerarin wine;Puerarin;High Performance Liquid Chromatography;Antioxidant activity

O657.7；TS262.91

A

2096-0387（2017）03-0023-04

徐國良（1964-），男，本科，副研究員，研究方向：天然產(chǎn)物。