胡居吾，朱仁果*，王慧賓，鄧朝陽(yáng)，張蕾

（1.江西省科學(xué)院應(yīng)用化學(xué)研究所，江西南昌330096；2.山西省實(shí)驗(yàn)中學(xué)，山西太原030200）

松針中游離氨基酸代謝對(duì)環(huán)境氮的響應(yīng)

胡居吾1，朱仁果1*，王慧賓1，鄧朝陽(yáng)1，張蕾2

（1.江西省科學(xué)院應(yīng)用化學(xué)研究所，江西南昌330096；2.山西省實(shí)驗(yàn)中學(xué)，山西太原030200）

通過(guò)分析貴州省貴陽(yáng)市區(qū)雪松松針組織中總游離氨基酸含量和氨基酸單體含量變化，發(fā)現(xiàn)貴陽(yáng)市雪松針葉組織的總游離氨基酸含量從貴陽(yáng)市遠(yuǎn)郊到交通主干道呈上升趨勢(shì)，從遠(yuǎn)郊的484.5μg/g增加到交通主干道的2 449.6μg/g，該變化趨勢(shì)與總氮變化一致，但針葉中總游離氨基酸含量的變化范圍（增加了5.1倍）要大于針葉中總氮含量變化范圍（增加了1.6倍）。該結(jié)果表明松針中的游離氨基酸也能用于指示環(huán)境氮含量的變化，且對(duì)環(huán)境氮的響應(yīng)比植物總氮更靈敏。貴陽(yáng)市區(qū)雪松針葉中20種游離氨基酸的含量都隨著組織總氮含量的增加而增加。其中，以脯氨酸（Pro）和賴(lài)氨酸（Lys）含量的增加最為顯著，分別增加了25倍和30倍。當(dāng)組織總氮增加時(shí)，每種氨基酸占總氨基酸的比例會(huì)發(fā)生變化。其中，脯氨酸（Pro）、精氨酸（Arg）增加的比例最多，Pro占總游離氨基酸的比例從3%增加15%，Arg占總游離氨基酸的比例從8%增加13%；而谷氨酸（Glu）占總氨基酸的比例減少最多從37%下降到23%，表明環(huán)境氮含量增加時(shí)，多余的含氮會(huì)通過(guò)合成特定的低C/N比游離氨基酸來(lái)消解。

環(huán)境氮；松針；貴陽(yáng)市

近年來(lái)增加的氮沉降使得一些原本氮缺乏的生態(tài)系統(tǒng)有著過(guò)多的氮供給。當(dāng)?shù)两党^(guò)了生態(tài)系統(tǒng)氮的保留能力時(shí)將會(huì)導(dǎo)致氮飽和。氮飽和會(huì)給植物帶來(lái)一系列的影響，比如礦物的不平衡（必須礦物Mg、K、P相對(duì)于N的缺乏）[1]，針葉發(fā)黃[2]，菌根數(shù)量減少[3]，甚至?xí)沟蒙滞嘶蜕锒鄻有詼p少[4]。

在過(guò)量氮沉降引起某種植物種類(lèi)和數(shù)量大量變化之前，植物自身的新陳代謝會(huì)對(duì)高的氮輸入作出響應(yīng)，如葉子氮濃度的增加[4，5]和游離氨基酸的累積[3]。這些植物組織內(nèi)新陳代謝的變化可以用于指示該植物種、采樣點(diǎn)或是生態(tài)系統(tǒng)是否受到了過(guò)量氮沉降的影響。

已有研究表明植物葉片中的含氮化合物（非蛋白氮和溶解性氨基酸）可以用于指示植物組織中早期的氮積累[3]。對(duì)松針[6]、森林下層林木[7]、歐石楠植物[5]、側(cè)生萌苔蘚組織[8]中游離氨基酸的研究，都發(fā)現(xiàn)了植物組織中游離氨基酸對(duì)大氣氮沉降的響應(yīng)。但是，目前對(duì)植物中特定游離氨基酸單體對(duì)環(huán)境氮響應(yīng)的研究還較少。

本研究通過(guò)分析貴州省貴陽(yáng)市區(qū)雪松松針組織中游離氨基酸含量的變化，揭示環(huán)境氮沉降變化對(duì)植物氨基酸代謝可能產(chǎn)生的影響，探討特定氨基酸對(duì)環(huán)境氮的響應(yīng)差異，以及利用游離氨基酸含量變化示蹤環(huán)境氮含量變化的可行性。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)域狀況

貴州省貴陽(yáng)市是我國(guó)西南喀斯特地區(qū)的一個(gè)省會(huì)城市。貴陽(yáng)市大氣氮沉降的主要特征是氨濃度高，氮氧化物的濃度較低。隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，貴陽(yáng)市氮氧化物的排放量呈上升趨勢(shì)，見(jiàn)表1。從表1可見(jiàn)，2011年氮氧化物排放總量為55.32萬(wàn)t，比2010年增加12.24%。

表1 貴州省貴陽(yáng)市近年來(lái)氮氧化物的排放量

1.2 試樣的采集和處理方法

于2012年3月在貴陽(yáng)市遠(yuǎn)郊、公園、市中心和交通干道采集雪松樣品。采樣點(diǎn)開(kāi)闊不受建筑物等遮擋。所有采集的松樹(shù)沒(méi)有明顯損傷。松針枝條位于樹(shù)的北面或是東北面以避免可能的光照對(duì)氨基酸濃度的影響。所有樣品用干凈塑料自封袋保存，迅速放入冰盒，帶回實(shí)驗(yàn)室冰箱-20℃冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

ST16高速離心機(jī)，美國(guó)Thermo公司；Essential 5 Millipore純水機(jī)，美國(guó)Millipore公司；BS210S分析天平，德國(guó)Sartorius公司；SL-200小型萬(wàn)能粉碎機(jī)，杭州三思儀器公司；PHS-2C數(shù)顯恒溫水浴鍋，江蘇金壇市醫(yī)療器械；Agilent 6890氣相色譜儀，美國(guó)安捷倫公司。

1.4 游離氨基酸的提取和測(cè)定方法

將采集樣品冷凍干燥后，準(zhǔn)確稱(chēng)取200mg樣品。用10mL 90℃超純水提取30min，待冷卻后離心（1萬(wàn)轉(zhuǎn)；45min）取上清液過(guò)0.22μm濾膜，再用10mL超純水超聲波復(fù)提30min后離心（1萬(wàn)轉(zhuǎn)；45min），取上清液過(guò)0.22μm濾膜。將2次過(guò)濾后的上清液混合于-20℃條件下保存。

游離氨基酸含量的測(cè)定參照J(rèn)iménez-Martín（2012）的方法[9]。用硅烷化衍生方法（MTBSTFA）將19種蛋白質(zhì)氨基酸和1種非蛋白質(zhì)氨基酸（GABA）衍生成其相對(duì)應(yīng)的N（O）-叔丁基二甲基硅烷氨基酸衍生物后用氣相色譜（Agilent 6890，美國(guó)）測(cè)定氨基酸含量。分析時(shí)的測(cè)試條件是：色譜柱為DB-5MS（30m×0.25mm×0.25μm）；載氣為氦氣；恒流模式為流速1.2mL/min；進(jìn)樣口溫度270℃；采用三階段程序：90℃保留1min，8℃/min升到140℃，保留5min，3℃/min升到220℃，12℃/min升到285℃保持12.5min。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同氮沉降下針葉中總游離氨基酸含量變化

本文分析了貴陽(yáng)市4個(gè)采樣點(diǎn)雪松針葉中總游離氨基酸的變化以及占總氮的比例，結(jié)果如圖1所示。

圖1 貴州省貴陽(yáng)市雪松針葉總氨基酸含量和總氮含量的變化

從圖1可見(jiàn)，貴陽(yáng)市雪松針葉組織的總氮含量從貴陽(yáng)市遠(yuǎn)郊到交通主干道增加，變化范圍為1.6%～2.7%。相應(yīng)的針葉組織中的總游離氨酸含量也呈上升趨勢(shì)，從郊區(qū)的484.5μg/g增加到交通主干道的2 449.6μg/g。針葉中總游離氨基酸含量的變化（增加了5.1倍）要大于針葉中總氮含量變化（增加了1.6倍）。

2.2 不同氮沉降下針葉中總游離氨基酸占總氮的比例變化

通過(guò)分析市區(qū)4個(gè)采樣點(diǎn)雪松針葉中游離氨基酸占總氮的比例發(fā)現(xiàn)，隨著雪松針葉中總氮含量增加，針葉組織中游離氨基酸會(huì)也相應(yīng)增加，并且當(dāng)組織總氮到達(dá)某一閾值時(shí)，針葉中游離氨基酸會(huì)發(fā)生顯著的累積。郊區(qū)雪松針葉組織中總游離氨基酸含量占總氮含量的2.7%，而在市區(qū)交通主干道上這個(gè)比例上升到了9.8%。雪松針葉的總氮含量增加小于19mg/g時(shí)，總游離氨基酸占總氮的百分比變化不大，占松針總氮的比例小于3.5%。當(dāng)雪松針葉中的總氮含量大于19mg/g時(shí)，總游離氨基酸占總氮的百分比明顯增大，占總氮的比例大于7%（見(jiàn)圖2）。

圖2 貴陽(yáng)市總氨基酸占總氮含量的百分比

2.3 雪松針葉中20種游離氨基酸含量分析

貴陽(yáng)市區(qū)雪松針葉中20種游離氨基酸的含量都隨著組織總氮含量的增加而增加。其中，以脯氨酸（Pro）和賴(lài)氨酸（Lys）含量的增加最為顯著，分別增加了25倍和30倍。其他含量顯著增加的氨基酸還有異亮氨酸（Ⅰle）、天冬酰胺（Asn）、精氨酸（Arg）、組氨酸（His）。松針中Ⅰle、Asn含量增加了9倍，Arg含量增加了8倍，His含量增加了6倍（見(jiàn)圖3）。

圖3 市區(qū)松針組織中20種氨基酸含量

2.4 雪松針葉中20種游離氨基酸占總氨基酸含量比例變化

雪松針葉組織總氮含量增加時(shí)，20種游離氨基酸增加幅度并不相同，當(dāng)組織總氮增加時(shí)，每種氨基酸占總氨基酸的比例會(huì)發(fā)生變化。丙氨酸（Ala）、纈氨酸（Val）、異亮氨酸（Ⅰle）、脯氨酸（Pro）、絲氨酸（Ser）、天冬氨酸（Asp）、天冬酰胺（Asn）、賴(lài)氨酸（Lys）、精氨酸（Arg）、組氨酸（His）和色氨酸（Trp）占總游離氨基酸比例增加，甘氨酸（Gly）、亮氨酸（Leu）、蛋氨酸（Met）、蘇氨酸（Thr）、苯丙氨酸（Phe）、谷氨酸（Glu）、谷氨酰胺（Gln）和酪氨酸（Tyr）占游離氨基酸比例減少。其中，Pro、Arg增加的比例最多，Pro占總游離氨基酸的比例從3%增加15%，Arg占總游離氨基酸的比例從8%增加13%；而Glu占總氨基酸的比例減少最多，從37%下降至23%（見(jiàn)圖4）。

圖4 20種氨基酸游離氨基酸占總氨基酸含量的比例

3 結(jié)論

貴陽(yáng)市從遠(yuǎn)郊到交通主干道松針組織中總游離氨基酸含量和總氮含量也有相似的變化規(guī)律，并且總游離氨基酸含量的變化范圍要大于植物總氮的變化，說(shuō)明松針中的游離氨基酸對(duì)環(huán)境氮的響應(yīng)比植物總氮更靈敏。

環(huán)境氮含量會(huì)改變植物的氮代謝機(jī)制，多余的含氮化合物會(huì)通過(guò)合成低的C/N比游離氨基酸來(lái)解毒?？梢酝ㄟ^(guò)測(cè)定特定氨基酸含量變化來(lái)指示環(huán)境氮沉降。

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Free Amino Acids in Pine Needles Response to Environment Nitrogen

Hu Ju-wu1，Zhu Ren-guo1*，Wang Hui-bin1，Deng Zhao-yang1，Zhang lei2
(1.Institute of Applied Chemistry,Jiangxi Academy of Sciences,Jiangxi Nanchang 330029;2.Shanxi Experimental Secondary School,Shanxi Taiyuan 030200)

Total nitrogen content of cedar needles tissues increased from rural of Guiyang city of Guizhou province to the main traffic road ,corresponding total free amino acid content in the needles showed the same ascendant trend,increased from 484.5μg/g in the suburbs of Guiyang to 2 449.6 μg/g in traffic trunk road.Change trend of free amino acids content in needle was consistent with total nitrogen,and the changes of the content of free amino acid (5.1) were greater than the total nitrogen of needle tissues (1.6).The response of the free amino acid of needles to environment nitrogen was more sensitive than total nitrogen of the needle tissues.The content of twenty kinds of free amino acids of cedar pine increased by the total content of nitrogen of cedar pine in Guiyang city,but increased proportion of Twenty amino acids was different,which finally result proportion of amino acids in needle changed.Pro and Arg increased most significantly.Pro increased from 3% to 15%.Arg increased from 8% to 13%.Glu decreased from 37% to 23%.Higher doses of nitrogen or long term impacts in pine stands lead to changes in the detoxification mechanism.In order to avoid an accumulation of cytotoxic ammonia,assimilated nitrogen compounds must be detoxified by forming amino acids with available C-skeletons.

Environmental nitrogen;Pine needles;Guiyang City

X173

A

2096-0387（2017）03-0005-04

江西省自然科學(xué)基金（2014FBAB203021）。

胡居吾（1977-），男，博士在讀，副研究員，研究方向：天然產(chǎn)物化學(xué)。

朱仁果（1985-），博士，研究方向：天然產(chǎn)物化學(xué)。