孫苗苗, 楊其彬, 陳百堯, 朱彩艷, 黃建華, 江世貴, 周發(fā)林

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斑節(jié)對蝦4個地理群體遺傳多樣性的AFLP分析

孫苗苗1, 2, 楊其彬1, 陳百堯2, 朱彩艷1, 黃建華1, 江世貴1, 周發(fā)林1

(1. 中國水產(chǎn)科學研究院南海水產(chǎn)研究所, 農(nóng)業(yè)部南海漁業(yè)資源開發(fā)利用重點實驗室, 廣東廣州 510300; 2. 連云港市海洋與水產(chǎn)科學研究所, 江蘇連云港 222044)

為研究斑節(jié)對蝦()4個地理群體的遺傳背景, 作者應用AFLP分子標記技術對非洲(F)、中國三亞(S)、泰國(T)和印度尼西亞(Y)的斑節(jié)對蝦群體進行遺傳多樣性分析。選取8對引物組合對斑節(jié)對蝦4個群體共128個個體進行分析比較, 共獲得1 000個位點, 其中多態(tài)性位點數(shù)為830個, 各群體多態(tài)位點比率為47.8 %~58.5 %; 群體Nei’s遺傳多樣性指數(shù)為0.0917~0.1271, Shannon’s 信息指數(shù)為0.1484~0.2032。4個群體間的遺傳距離, Y與F之間最大, 為0.331, T與S之間最小, 為0.217。4個群體UPGMA聚類時, S、T與Y聚為一支, F為單獨一支; 128個個體的UPGMA聚類結果表明, F群體除4個個體外其余個體聚為一大支, S、T、Y群體的部分個體互相混雜。AMOVA分析發(fā)現(xiàn), 35.92%的變異來自于群體間, 64.08% 的變異來自于群體內(nèi), 群體間的遺傳分化系數(shù)為0.3592, 表明4個群體間的遺傳分化程度很大。本研究為斑節(jié)對蝦遺傳育種提供了種質(zhì)遺傳背景資料, 并為斑節(jié)對蝦資源的開發(fā)與利用提供基礎數(shù)據(jù)。

斑節(jié)對蝦; 遺傳多樣性; AFLP; 地理群體

斑節(jié)對蝦(是個體最大的對蝦種, 廣泛分布于印度洋和西太平洋的大部分海區(qū), 是世界上最主要的養(yǎng)殖對蝦之一, 也是中國南方沿海諸省的重要養(yǎng)殖對象。有關其分子水平研究, 國內(nèi)外一些學者也做了相關的研究, 如譚樹華等[1]運用同工酶和RAPD 技術對不同斑節(jié)對蝦養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性進行了研究。姜永杰等[2]對深圳海域斑節(jié)對蝦野生種群線粒體控制區(qū)序列的多態(tài)性進行了探討。周發(fā)林等[3]對海南三亞斑節(jié)對蝦野生種群mtDNA 16S rRNA 基因和控制區(qū)序列的多態(tài)性進行了研究。Tassanakajon等[4]運用RAPD 技術分析了野生種群的基因多樣性水平。Pan等[5]篩選了23 對多態(tài)性較高的微衛(wèi)星標記用于斑節(jié)對蝦的遺傳多樣性和種群結構的分析。Xu等[6]運用微衛(wèi)星標記技術研究了菲律賓野生和養(yǎng)殖的斑節(jié)對蝦群體的遺傳多樣性水平。而利用AFLP分析斑節(jié)對蝦遺傳多樣性研究未見報道。

AFLP是迄今最有效的分子標記之一, 在水生生物中已被廣泛應用于遺傳多樣性分析[7-10]、系統(tǒng)進化和親緣關系的鑒定[11-12]、基因定位克隆[13]、遺傳圖譜構建[14]等諸多領域。本研究采用AFLP技術對斑節(jié)對蝦4個不同地理來源的親本進行遺傳分析, 以了解其遺傳多樣性、種群遺傳結構和遺傳特征等信息, 為斑節(jié)對蝦的遺傳育種積累材料和提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

4個地理群體斑節(jié)對蝦分別從印度尼西亞、泰國、非洲和中國三亞4個地區(qū)引進。體長116.10~ 255.00 mm, 體質(zhì)量122.6~294.8 g。取眼柄或腹足保存于95%的酒精中, 用于DNA的抽提。樣品的詳細信息見表1。

1.2 基因組DNA提取

斑節(jié)對蝦基因組DNA提取參照熊小飛[15]的方法提取的DNA用10g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測, 并制成終質(zhì)量濃度為50 ng/μL的模板DNA備用。

表1 實驗所用的樣品信息

1.3 AFLP分析

用于AFLP分析的內(nèi)切酶為R I和I, 均為NEB公司生產(chǎn); 實驗所用的接頭和引物由英駿公司合成, 序列見表2; T4 DNA 連接酶由Takara公司生產(chǎn)。反應步驟和反應體系如下:

(1)R I酶切反應: DNA (20 ng/μL) 5 μL,R I (10 U/μL) 0.5 uL 10×R I Buffer 1 μL, ddH2O補齊至10 μL, 37℃酶切1 h。

(2)I酶切反應:R I酶切反應液10 μL,I (10 U/uL) 0.2 μL, 10×I Buffer 0.1 μL, 37℃酶切2.5 h。

(3) 接頭連接反應: 雙酶切產(chǎn)物10 μL, 10×T4 DNA連接酶Buffer 2 μL, E接頭(2.5 μmol/L)1 μL, M接頭(12.5 μmol/L)2 μL, T4連接酶(6 U/μL)0.2 μL, ddH2O補齊至20 μL, 37℃反應1 h, 16℃連接20 h。

(4) 預擴增: 10×PCR Buffer (Mg2+) 2.5 μL,R I +1引物(50 ng/μL)1 μL,I +1引物(50 ng/μL)1 μL, dNTPs (2 mmol/L) 3 μL, rTap酶(5 U/μL)0.3 μL, 模板DNA的連接產(chǎn)物4μL, ddH2O補齊至25μL。反應程序: 94℃變性3 min后, 進行24個循環(huán)(94℃ 30 s, 56℃30 s, 72℃ 30 s), 最后72℃延伸10 min。

(5) 選擇擴增: 10×PCR Buffer (Mg2+)2.1 μL,R I +3引物(100 ng/μL)2 μL,I +3引物(100 ng/μL) 2 μL, dNTPs (2 Mm/each)1.5 μL, rTap酶(5 U/μL)0.1 μL,預擴增產(chǎn)物5 μL, ddH2O補齊至25 μL。反應程序: 94℃變性3 min, 進入9個循環(huán)(94℃ 30 s, 65℃ 30 s, 72℃ 60 s), 然后進行24個循環(huán)(94℃ 30 s, 56℃ 30 s, 72℃ 60 s), 最后72℃延伸10 min。

(6) 取10 uL產(chǎn)物, 采用ABI 3730 DNA分析儀進行分析。

1.4 數(shù)據(jù)分析

根據(jù)所獲得的AFLP峰值, 將分子量大小一致的峰值看作1個位點, 在各位點上, 針對不同個體若存在清晰可辨的擴增峰則標記為1, 否則標記為0, 由此構建0-1矩陣。統(tǒng)計多樣性位點比率, 并采用POPGENE3.2[16]計算該種群內(nèi)部觀測等位基因數(shù)、有效等位基因數(shù)、Nei’s基因多樣性指數(shù)以及Shannon’s 多樣性信息指數(shù), 分析種群內(nèi)和種群間的遺傳距離。然后根據(jù)遺傳距離表, 采用MEGA軟件構建遺傳距離聚類圖, 對4個群體的數(shù)據(jù)用Arlequin軟件進行AMOVA分析。

2 結果

2.1 AFLP擴增多態(tài)性

采用8對AFLP 引物對4個群體共128個個體進行DNA 擴增。共得到1 000個AFLP 位點。每對引物擴增位點在111~130個, 平均每對引物擴增出125個AFLP 位點。擴增位點最多的引物對是E2M2和E5M5, 擴增位點數(shù)均為130。每對引物擴增的多態(tài)位點均較高(>75%)。其中, E2M2引物對產(chǎn)生的位點多態(tài)比例最高, 為95.38%。8對引物在4個群體中共產(chǎn)生了群體特異性位點245個, 其中, F群體中出現(xiàn)的特異性位點70個、S群體62個、T群體50個, Y群體63個(表3)。

2.2 各群體遺傳結構和遺傳多樣性分析

由表4 可知, 8 個引物對在非洲、中國三亞、泰國、印尼4個斑節(jié)對蝦群體中檢測出多態(tài)位點數(shù)及比例分別為: 478個(47. 8%)、525個(52.5%)、585個(58.5%)、530個(53.0%), 其中非洲群體的多態(tài)位點數(shù)最低。F群體的Nei’s遺傳多樣性指數(shù)和Shannon’s指數(shù)最小, 分別為0.0917、0.1484。

2.3 群體間遺傳相似度和遺傳距離

群體間遺傳相似度和遺傳距離見表5。F與S、T和Y之間的遺傳距離均較遠, 分別為0.299、0.330和0.331; S、T與Y之間遺傳距離均較近。

表2 用于AFLP分析的接頭和引物序列

表3 8對AFLP引物組合的擴增結果

表4 斑節(jié)對蝦4個群體的遺傳多樣性參數(shù)

表5 群體間相似度和遺傳距離

注: 對角線上為遺傳相似度; 對角線下為遺傳距離

2.4 4個群體間的遺傳分化

AMOVA 分析表明, 35.92%的變異來自于群體間, 64.08% 變異來自于群體內(nèi), 群體間的遺傳分化系數(shù)(F)為0.3592, 遺傳分化值小于0.01, 表明3個群體間的遺傳分化程度很大, 達到了顯著性水平(表6)。4個群體之間的遺傳分化指數(shù)在0.103 48~0.502 32, 遺傳分化順序為F-S >F-Y>F- T>S-Y> S-T>T-Y(表7)。

表6 4個群體間的AMOVA分析

表7 3個群體間的遺傳分化系數(shù)和基因流

注: 對角線下為遺傳分化系數(shù)(F), 對角線上為基因流(N)

2.5 聚類分析

基于Nei遺傳距離構建UPGMA系統(tǒng)發(fā)生樹。聚類分析表明, 4個斑節(jié)對蝦群體聚成兩支, 其中F群體獨立聚為一支, S、T、Y 這3個群體聚為另一支(圖1)。4個群體128個個體的UPGMA聚類結果表明, F群體除4個個體外, 其余個體均聚在一起, 具有獨立的遺傳結構; 而S、T、Y 3個群體較F群體混雜的情況更嚴重一些, 說明這3個群體間存在較大的交流(圖2)。

3 討論

遺傳多樣性是生物對復雜環(huán)境適應能力的一種反應, 對該生物的可持續(xù)發(fā)展、合理開發(fā)利用有著重要的意義[17]。遺傳多樣性是評價生物資源狀況的重要依據(jù), 是物種適應環(huán)境變化、維持生存與進化的遺傳基礎。平均多態(tài)位點比例和平均雜合度是衡量生物群體遺傳多樣性高低的重要參數(shù)[18]。在AFLP分析中, 多態(tài)位點比率既與研究的樣本來源及其數(shù)量有關, 也與各個引物的擴增效率有關。黃羽等[19]采用AFLP技術分析了6個克氏原螯蝦()群體遺傳多樣性, 結果發(fā)現(xiàn)多態(tài)位點百分比為39.53%~75.74%。頡曉勇等[20]利用AFLP方法, 依靠6對引物對6個群體180尾凡納濱對蝦()進行分析, 結果顯示各群體的多態(tài)位點比率在68.39%~71.20%。在本研究中, 斑節(jié)對蝦4個地理群體多態(tài)位點百分比為47.80%~58.50%, 因此可以認為這4個群體斑節(jié)對蝦具有較高的遺傳多樣性。非洲群體親本較其他3個群體遺傳多樣性較低, 多態(tài)位點百分比為47.80%, Nei’s遺傳多樣性指數(shù)(0.091 7)和Shannon’s信息指數(shù)(0.148 4)均低于其他3個群體。

標尺為遺傳距離(圖2同)

Bar: genetic distance (the same as Fig.2)

Thorp[21]研究認為, 不同物種間的遺傳相似系數(shù)為0.2~0.8, 同科屬群體間為0.5~0.9, 同種群體間為0.8~0.97。遺傳分化系數(shù)是衡量群體再分效應的指標, 反映因遺傳漂變引起物種雜合度的降低程度。遺傳分化系數(shù)在 0.00~0.05, 表明群體分化程度較小; 0.05~0.15, 說明群體分化程度中等; 0.15~0.25, 表明群體分化程度較大; 0.25~1.00則表明群體分化程度很大[22]。當種群基因流大于1 時, 種群間存在一定的基因流動, 如果種群基因流遠遠小于1, 種群則會出現(xiàn)強烈的分化[23]。在本研究中, 非洲群體與中國三亞、泰國、印度尼西亞群體的遺傳距離相對較大, 遺傳相似度較小(表5)。本研究結果顯示(表7), 非洲群體與其他3個群體間的遺傳分化系數(shù)為0.43575~ 0.50232, 基因流為0.49538~0.64745, 遠小于1, 說明非洲群體與中國三亞、泰國、印度尼西亞群體分化程度很大。而中國三亞、泰國、印度尼西亞群體間存在一定的基因交流, 遺傳分化較小。中國三亞、泰國群體位于西太平洋, 印度尼西亞群體來自東印度洋, 盡管不在一個大洋內(nèi), 但從地理位置上講印度尼西亞群體與中國三亞、泰國群體相隔較近, 中間雖有島嶼海峽隔離, 但還是存在一定程度的基因交流。而非洲群體則位于西印度洋, 與其他3個群體相隔較遠, 群體間的交流受到制約。4個群體聚類分析顯示, S、T、Y 3個群體聚為一支, F群體獨立為一支; 4個群體的128個個體聚類顯示, S、T、Y 3個群體個體間混雜程度較高, 進一步驗證了上述結論。Duda等[24]研究證實西太平洋內(nèi)部各地理群體斑節(jié)對蝦之間基因交流頻繁, 而印度洋內(nèi)部各群體之間的交流則受到一定程度的制約。其結論與作者的結論基本一致。

通過AFLP遺傳多樣性分析, 盡管非洲群體遺傳多樣性略低于其他群體, 但與其他群體間的遺傳分化較大。因此, 大致可以將4個群體分為2個種質(zhì)類型, 三亞、泰國和印度尼西亞群體可以看作是同一個種質(zhì)類型, 而非洲群體則為一個單獨的種質(zhì)類型?，F(xiàn)代雜交優(yōu)勢理論認為, 親本間遺傳差異的大小影響了其后代雜交優(yōu)勢的水平, 遺傳距離愈大所產(chǎn)生的雜交優(yōu)勢則愈大[25]。作者認為, 在斑節(jié)對蝦雜交選育工作中, 將遺傳分化較大的非洲群體與其他群體進行雜交可能會取得更好的雜交效果。

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(本文編輯: 譚雪靜)

Genetic diversity in four populations ofassessed by AFLP makers

SUN Miao-miao1, 2, YANG Qi-bin1, CHEN Bai-yao2, ZHU Cai-yan1, HUANG Jian-hua1, JIANG Shi-gui1, ZHOU Fa-lin1

(1. Key Lab of South China Sea Fishery Resources Exploitation ＆ Utilization, Ministry of Agriculture, South China Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Guangzhou 510300, China; 2. Lianyungang Marine and Fishery Sciences Research Institution, Lianyungang 222044, China)

The genetic diversity of fourpopulations (Africa population, F; Sanya population, S; Thailand population, T; Indonesia population, Y) was analyzed by the AFLP technique. One thousand bands were detected with eight primer combinations. The polymorphic bands of four populations and the ratio of polymorphic loci were 478–585 and 47.8%–58.5%, respectively. Nei’s gene diversity index and Shannon’s information index were 0.0917–0.1271 and 0.1484–0.2032, respectively. The genetic distance between populations F and Y was the largest (0.331), while it was the smallest between populations T and S (0.217). UPGMA dendrogram analysis showed that populations S, T and Y clustered onto one branch, and population F formed another branch. Except for four individuals, the other samples from population F clustered onto one branch, and most samples of populations S, T and Y clustered with their respective populations, while a small number of them were mixed together. AMOVA analysis showed that 35.92% of the variation was among populations and 64.08% variation was within populations. Fst (0.3592) among populations indicated large genetic differentiation. The germ styles of populations S, T and Y were similar, but they were different from that of population F. The results of this study accumulated information on the genetic background ofthat will be useful in genetics and breeding and can provide basic information for further development of specific molecular markers in different populations.

; genetic diversity; AFLP; geographical populations

Mar. 14, 2016

[China Agriculture Research System, No.CARS-47; Guangdong Marine Fishery Science & Technology and Industry Development Special Key Project, No. A201501A06; Science and Technology Planning Project of Guangdong Province, No.2013B020201001; Science and Technology Planning Project of Guangdong Province, No. 2014B020202003]

S917

A

1000-3096(2017)03-0041-07

10.11759//hykx20160314001

2016-03-14;

2016-10-08

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術體系(CARS47); 廣東省海洋漁業(yè)科技與產(chǎn)業(yè)發(fā)展專項重點項目(A201501A06); 廣東省科技計劃項目(2013B020201001); 廣東省科技計劃項目(2014B020202003)

孫苗苗(1983-), 男, 江蘇徐州人, 博士, 主要從事水產(chǎn)動物遺傳育種與增養(yǎng)殖學研究, E-mail: miaosun2007@163.com; 周發(fā)林, 通信作者, E-mail: zhoufalin@aliyun.com