楊鐵柱, 沈和定, 史艷梅, 劉 欣, 吳 欣, 李 杰

?

瘤背石磺表皮生長因子基因的克隆、結構及進化分析

楊鐵柱, 沈和定, 史艷梅, 劉 欣, 吳 欣, 李 杰

(上海海洋大學水產與生命學院, 上海 201306)

首次在瘤背石磺()中克隆得到一種新的表皮生長因子(EGF)的cDNA序列全長。EGF基因cDNA的全長為1158bp, 命名為1, 其中開放閱讀框長度為846 bp, 編碼一條包含281個氨基酸殘基的多肽鏈。根據氨基酸序列比對和結構域分析結果發(fā)現其含有2個保守的EGF結構域和1個EGF-like結構域, 每個結構域中均包含至少6個半胱氨酸殘基, 且形成CX7 CX4-5 CX10-13 CXCX8 C結構, 其結構域由C1~C3、C2~C4和C5~C6之間形成的3個二硫鍵維持, 符合表皮生長因子家族及其相關蛋白的特征結構域, 但其余氨基酸序列與現有相關基因差異較大, 推測可能是一種新的EGF-like基因。利用MEGA6.0軟件構建1與EGF家族相關蛋白的系統進化樹, 表明EGF家族蛋白具有一定的物種特異性。

瘤背石磺(); EGF; 基因克隆; 系統進化分析

瘤背石磺()隸屬于軟體動物門(Mollusca)、腹足綱(Gastropoda)、肺螺亞綱(Pulmonata)、縮眼目(Systellommatophora)、石磺科(Onchidiidae), 是一種具有很高的食用和藥用價值的貝類[1-3]。其分布區(qū)域常見于我國的江蘇、上海、浙江、福建、廣東等地的淡水和咸水交匯處的高潮帶, 其溫度適應性強, 分布范圍廣, 資源量非常豐富。目前國內外學者對石磺的研究主要集中在系統分類[4-5]、生物學特征、胚胎發(fā)育、營養(yǎng)價值、受精和繁殖機制以及活性物質的分離提取等方面[6-8], 未涉及功能基因組的范疇, 本文對于瘤背石磺功能基因的結構和進化進行了較為深入的分析, 希望能為瘤背石磺的功能基因研究積累資料。

EGF(Epidermal growth factor)是由Cohen[9]博士在1962年一次實驗中偶然發(fā)現的, 也是最早發(fā)現并確立結構的生長因子。隨后的研究表明, EGF廣泛存在于人類及其他動物體內, 從低等到高等、單細胞到多細胞、海洋到陸地均能發(fā)現其存在。EGF并不是單一的生長因子, 而是一個有眾多生長因子所組成的大家族, 它包括轉化生長因子-α(transforming growth factor-α, TGF-α)、肝素結合性表皮生長因子(heparin binding EGF, HB-EGF)、雙調蛋白(amphiregulin, AR)、細胞素(betacellulin, BTC)、神經調節(jié)素(neuregulin, NGR)與表皮素(epiregulin, EPR)等[10]。這些因子中都包含至少1個由3對二硫鍵所維持具有高度保守性的EGF-like結構域[11]。在生物學過程中, EGF需要與EGF受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)相結合, 形成同源或異源二聚體, 以引發(fā)諸如ras-raf-MEK-erk/MAPK和P13K-PKC-IKK等下游信號通路, 介導細胞間的信號傳導, 促進細胞內部相應DNA、RNA和蛋白質的合成分泌, 從而誘導細胞進行增殖、遷移和分化等生物學過程[12-13]。

目前對于EGF的研究主要集中在人類等高等脊椎動物上, 例如EGF在腫瘤細胞中的表達水平變化情況[14]、在中樞神經系統中的重要性[15]以及對燒傷創(chuàng)面修復的臨床應用[16]等, 然而在無脊椎動物, 尤其是海洋生物中涉及甚少。朱文杰等[17]從合浦珠母貝()中克隆得到EGF同源基因1, 并發(fā)現在腸道修復和幼蟲表態(tài)發(fā)育階段起著重要作用。Hermann等[18]從靜水椎實螺()中克隆得到EGF同源基因, 發(fā)現其在生長及損傷修復過程中發(fā)揮重要作用。以及Hursh[19]和Bisgrove[20]在紫球海膽()、Woods[21]和Eri[22]從海鞘()中均克隆出EGF家族相關基因。

本實驗采用瘤背石磺作為研究對象, 主要是由于其作為棲息于灘涂半咸水區(qū)域的兩棲性生物方便采集。另外, 在采集后的暫養(yǎng)工作在本實驗室已趨于成熟。而在攝食和運動過程中, 瘤背石磺直接與外界接觸的表皮有大量損耗, 也相應刺激表皮生長因子的表達。故在本實驗中選取瘤背石磺作為研究客體。

作者首次從瘤背石磺的背部表皮中克隆并鑒定出一個EGF-like基因, 并從結構和進化兩方面進行深入分析, 發(fā)現EGF-like基因具有一定的物種特異性, 為進一步研究1基因奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與主要試劑

實驗所用的瘤背石磺采自上海市東海大橋沿岸的蘆葦蕩, 并放置于實驗室暫養(yǎng)箱中暫養(yǎng), 定時向箱內投放玉米粉、添加清水、清理排泄物, 及時清除掉死亡個體。實驗前選取健康活力強、體長50 mm左右的個體, 并用清水洗凈其身體表面的附著物。

實驗所用的RNA提取試劑盒、2*Taq PCR Mix、DH5-α感受態(tài)細胞購自天根(北京)生化科技有限公司; LA-Taq酶、反轉錄試劑盒(RT reagent Kit with gDNA Eraser)、RACE試劑盒(含5′和3′)購自TAKARA公司; 瓊脂糖、LB培養(yǎng)基、DNA片段純化試劑盒、三氯甲烷、異丙醇等購自生工生物工程(上海)有限公司; pGEM-easy vector購自Promega公司; 核酸電泳緩沖液購自萊峰生物公司。實驗中所用到的引物合成及序列測定工作均由生工生物工程(上海)有限公司完成。

1.2 RNA提取與cDNA合成

取瘤背石磺的背部皮膚, 按照RNA提取試劑盒的說明書提取總RNA, 使用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測完整性并使用超微量分光光度計(Nano Drop ND-2000/2000C, Thermo Fisher Scientific, USA)測其核酸濃度和260/280后置于超低溫冰箱中保存?zhèn)溆肹23]。利用RT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒合成cDNA第一鏈; 利用TaKaRa 3′Full RACE Kit合成3RACE-cDNA, 用5′Full RACE Kit合成5RACE-cDNA,于–20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 EGF-like的基因克隆

根據瘤背石磺轉錄組序列中得到的EGF-like基因片段, 利用Primer 5.0軟件設計出引物F1、R1擴增目的片段(表1)。利用引物已知的Tm值, 設計溫度梯度實驗, 確定最適退火溫度61.7℃。50 μL PCR反應體系為2*Taq PCR Mix 25 μL, ddH2O 20 μL, 上下游引物(F/R)(10μmol/L)各1.5 μL, cDNA 2 μL。PCR反應條件為94℃ 3 min; 94℃ 30 s, 61.7℃ 30 s, 72 ℃ 1 min, 循環(huán)35次; 72℃ 10 min。1%瓊脂糖凝膠電泳后使用DNA膠回收試劑盒純化目的片段, 并將目的片段連接到pGEM-easy vector載體上, 轉化進入到大腸桿菌感受態(tài)細胞.DH5-α, 在LB/AMP固體平板上37℃培養(yǎng), 經藍白斑篩選和菌液PCR檢測后將陽性克隆送生工測序, 并將所得序列結果與已知序列進行比對。

表1 實驗中所用到的引物序列

Tab.1 Sequences of primers used in this study

根據測序得到的目的片段, 分別設計5′和3′RACE特異性引物(表1), 以3′RACE-cDNA和5′RACE-cDNA為模板, 按照TAKARA RACE說明書中步驟分別進行3′RACE和5′RACE反應, 所得PCR產物經瓊脂糖電泳、割膠回收、連接轉化后, 通過藍白斑篩選和菌液PCR檢測后將陽性克隆送生工測序。使用DNAMAN6.0軟件將3次測序結果進行拼接, 獲得基因的cDNA全長序列。

1.4 序列特征和結果分析

使用NCBI中ORF Finder(http: //www.ncbi.nlm. nih.gov/gorf/gorf.html)查找基因的開放閱讀框(ORF); 使用BioEdit和DNAstar軟件預測氨基酸序列; 使用ProtParam(Http: //web.expasy.org/protparam/)來預測所編碼蛋白的理化性質; 使用SignalP4.1(http: //www. cbs.dtu.dk/services/SignalP/)來預測蛋白質的信號肽序列; 使用TMHMM services 2.0(http: //www.cbs.dtu. dk/services/TMHMM/)來預測蛋白質的跨膜結構域; 使用NetPhos2.0 Serber(http: //www.cbs.dtu.dk/services/ NetPhos/)來預測蛋白質的磷酸化位點; 使用Subloc v1.0(http: //www.bioinfo.tsinghua.edu.cn/SubLoc/)對蛋白質進行亞細胞定位; 使用SMART(http: //smart. embl-heidelberg.de/)分析蛋白質的功能結構域; 使用Mega6.0軟件構建系統進化樹。

2 結果與分析

2.1 EGF-like基因的基因克隆

通過對瘤背石磺轉錄組數據的綜合分析比對, 發(fā)現轉錄組數據中的S_Unigene427_c2_seq6基因被描述為epidermal growth factor-like, 且與NCBI數據庫比對后發(fā)現其與multiple epidermal growth factor-like domains protein 10 ()相識度最為接近。

根據該核苷酸序列在其保守區(qū)設計驗證引物, 獲得802 bp的PCR擴增產物。用BioEdit進行雙序列比對結果顯示, 該片段與待驗證核苷酸序列中被擴引物之間的序列99%的一致, 覆蓋度達到67.57%, 一方面證明該序列的正確性, 可以應用于cDNA全長的克隆; 另一方面也發(fā)現原預測的核苷酸序列存在一定的缺失, 或是基因測序拼接的不完整性造成的[24]。

3′RACE擴增得到一條569 bp的片段, 包含加尾信號(AACAAA)和poly(A)尾巴。5′RACE擴增得到一條301bp的片段。將上述序列片段進行拼接后, 得到一條全長為1158bp的cDNA序列(GenBank登錄號: KU556757), 通過blastx比對分析, 確定該基因屬于EGF大家族。其中開放閱讀框長846 bp, 編碼一條長為281個氨基酸殘基的多肽鏈, 終止密碼子為TGA, 加尾信號位于1129~1134, 后面緊跟著poly(A)尾巴。5′UTR長度為166 bp, 3′UTR長度為130 bp(圖3)。

2.2 EGF-like基因的cDNA序列分析

通過RACE克隆技術獲得的瘤背石磺表皮生長因子(EGF-like)基因命名為1。ProtParam軟件預測其分子量為30.51 ku, 理論等電點(PI)是5.41。SignalP4.1信號肽預測1沒有信號肽序列, 跨膜結構預測軟件TMHMM services 2.0顯示該基因存在一個跨膜結構域(膜內1~16aa, 膜上17~39aa, 膜外40~281aa)。磷酸化位點預測軟件NetPhos2.0 Serber顯示1基因含有6個Ser、3個Thr、3個Tyr, 可能為蛋白激酶磷酸化位點。細胞定位預測表明1基因定位在細胞外, 是分泌性蛋白的可能性較大。功能結構域預測軟件SMART顯示1基因含有2個EGF結構域(46~77aa、139~170aa)和一個EGF-like結構域(92~137aa), 每個EGF結構域均包含6個半胱氨酸殘基, 結構域內部各自形成3個二硫鍵, EGF-like結構域包含8個半胱氨酸殘基。使用SWISSmodel軟件對1氨基酸序列進行三維結構預測, 結果如圖1。

將1的氨基酸序列在NCBI中Blast同源性比對得知, 與其匹配度最高的是腹足綱生物中的multiple epidermal growth factor-like domains protein 10蛋白序列(XP_013086610.1),匹配度達到51%。相似度較低一點的是, 同樣是multiple epidermal growth factor-like domains protein 10的蛋白序列(XP_011433900.1), 同源性為43%。將兩者的氨基酸序列同1進行多重序列比對后, 結果如圖2所示。

瘤背石磺1基因cDNA序列及其編碼的氨基酸序列如圖3所示。

使用BioEdit軟件將瘤背石磺1基因的3個EGF-like結構域同EGF家族及其相關蛋白的EGF-like結構域做比較, 結果表明1與EGF家族及相關蛋白的6個半胱氨酸殘基是高度保守的, 且均符合CX7 CX4-5 CX10-13 CXCX8 C結構, 如圖4。

使用Mega6.0軟件, 對瘤背石磺1及EGF家族其他成員的氨基酸序列進行比對并構建系統進化樹圖5。結果表明, 大體上EGF家族每個成員的不同物種基因相應的聚為群組。的TGF-α蛋白單獨聚為一支, 小家鼠()和人類()的相關蛋白聚為一支,1單獨聚為一支, 剩余4種的EGF相關蛋白形成兩分支又聚為一支。

圖中藍色字體為起始密碼子和終止密碼子, 黑色加粗字體為加尾信號; 陰影部分是保守的EGF-like結構域, 紅色字體為6個典型的半胱氨酸殘基

Blue indicates the initiation codon and stop codon; bold black indicates polyadenylation signals; shadow indicates the conserved EGF-like domain; red indicates six typical cysteine residues

3 討論

表皮生長因子(EGF)家族的研究報道在脊椎動物中比較豐富。本文利用瘤背石磺轉錄組, 首次在該物種中克隆得到EGF-like基因1, 通過功能結構域分析發(fā)現其包含1個跨膜結構域(17~39aa)、2個EGF結構域(46~77aa、139~170aa)和一個EGF-like結構域(92~137aa), 將其與家族中其他成員及其相關蛋白的結構域比較, 發(fā)現1和他們有著相同的EGF-like結構特征, 包含典型的6個半胱氨酸殘基, 且符合CX7 CX4-5 CX10-13 CXCX8 C結構, 其中完全保守的6個半胱氨酸殘基C1~C3、C2~C4和C5~C6之間形成的3個二硫鍵, 使得這些多肽鏈能夠形成相似的空間結構, 因而可以與EGF受體結合介導細胞間的信號傳遞。

字體C表示6個保守的半胱氨酸殘基

C indicates six conserved cysteine residues

EGF家族蛋白在高等哺乳類動物中已能夠廣泛獲取, 同時, 在海洋軟體動物、兩棲類生物甚至病毒細菌中均發(fā)現有EGF-like結構域, 可說明在物種的進化過程中EGF-like結構域是相對保守的。目前在貝類中研究報道的EGF家族及其相關蛋白基因有16種之多, 例如太平洋牡蠣()的EGF-like基因[25]、光滑雙臍螺()的EGF想關基因[26]、新西蘭青蠔()的EGF相關基因[27]、九孔鮑()的HdEGF1基因[28]、紫貽貝()的EGF相關基因[29]、菲律賓蛤仔()的EGF_CA相關基因[30]、合浦珠母貝的1基因。將1和上述基因的序列比對, 結果表明除了EGF-like結構域之外(圖4), 其余氨基酸序列并沒有表現出相似性。而根據在NCBI上BLAST結果及多重序列比對顯示,1同其他物種的EGF-like基因同源性并不高, 最高僅為51%, 這也符合海洋生物之間基因差異較大的規(guī)律。以此推測1基因是EGF家族及其相關蛋白基因的新成員。

EGF家族蛋白在人類高等生物中的分布和表達十分豐富, 而且對其的研究也比較深入。S Kumar發(fā)現, 長期吸煙的人群會誘導EGF家族的肝素結和性表皮生長因子HB-EGF在巨噬細胞中過量表達, 使人患胰腺癌的幾率變大數倍[31]。Hoda I發(fā)現通過藥物降低EGF和EGFR基因的表達量可以顯著抑制艾氏腹水瘤生長[32]。另外, Ito J的研究發(fā)現呼吸道上皮損傷可以通過HBEGF和TGF-α來誘導TGF-β1和TGF-β2的表達量增加來達到修復效果, 這同EGF家族細胞成員細胞素(BTC)在人體中的腸道等表皮易損傷的部位表達量較高時想吻合的[33-34]。

本研究首次在瘤背石磺中克隆得到表皮生長因子類似(EGF-like)基因1的cDNA全長序列, 并對其從結構和進化兩方面進行了生物學信息分析, 分析結果表明1可能是一個新的EGF-like基因。本研究為進一步研究1的功能奠定基礎。

[1] 吳旭峰, 沈和定, 吳文健, 等.我國華東沿海4種石磺形態(tài)學比較[J]. 動物學雜志, 2010, 6: 92-100.Wu Xufeng, Shen Heding, Wu Wenjian, et al. Comparison on morphology of Onchidiidae in eastern coast of China [J]. Journal of Zoology, 2010, 6: 92-100.

[2] 孫變娜, 沈和定, 吳洪喜, 等.石磺營養(yǎng)價值、活性物質的研究現狀及開發(fā)前景[J]. 江蘇農業(yè)科學, 2013, 41(8): 14-17.Sun Bianna, Shen Heding, Wu Hongxi, et al. The research status and development prospects ofnutritional value and active substance [J].Jiangsu Agricultural Sciences, 2013, 41(8): 14-17.

[3] 孫變娜, 沈和定, 吳洪喜, 等.崇明島瘤背石磺的化學成分研究. 天然產物研究與開發(fā)[J]. 天然產物研究與開發(fā), 2014, 26(7): 987-989. Sun Bianna, Shen Heding, Wu Hongxi, et al. Chemical constituents of onchidium struma from Chongming Island, Shanghai [J]. Natural Product Research and Development, 2014, 26(7): 987-989.

[4] Sun B N, Chen C, Shen H D, et al.Species diversity of Onchidiidae (Eupulmonata: Heterobranchia) on the mainland of China based on molecular data [J]. Molluscan Research, 2014, 34 (1): 62-70.

[5] 姚理想, 周娜, 沈和定, 等.中國沿海平疣桑椹石磺基因的遺傳多樣性與遺傳分化[J]. 中國水產科學, 2015, 22(4): 729-749. Yao Lixiang, Zhou Na, Shen Heding, et al. Genetic diversity and differentiation ofthe coastal area of China based on mitochondrialgene [J]. Journal of Fishery Sciences of China, 2015, 22(4): 729-749.

[6] 陳美英, 李建榜, 黃克蠶, 等. 瘤背石磺的生殖系統結構特點及生殖周期研究[J]. 四川動物, 2010, 3: 426-431. Chen Meiying, Li Jianbang, Huang Kecan, et al. Study on the structural characteristics of the reproductive system and reproductive cycle of[J]. Sichuan Journal of Zoology , 2010, 29(3): 426-431.

[7] 程知慶, 沈和定, 姚理想, 等. 貝類多糖的生物活性研究現狀及其藥用價值[J]. 安徽農業(yè)科學, 2015, 43(24): 17-19. Cheng Zhiqing, Shen Heding, Yao Lixiang, et al. Biological activity status and medicinal value of shellfish polysaccharide [J]. Journal of Anhui Agri, 2015, 43(24): 17-19.

[8] Sun Bianna, Shen Heding (Correspondence), Wu Hongxi, et al. Determination of chemical constituents of the marine pulmonate slug,[J]. Tropical Journal of Pharmaceutical Research, 2014, 13(12): 2071-2074.

[9] Carpenter G, Cohen S. Epidermal growth factor[J]. Annual Review of Biochemistry1979, 48(10): 6389-6402.

[10] Wilson K J, Gilmore J L, Foley J, et al. Functional selectivity of EGF family peptide growth factors: Implications for cancer [J]. Pharmacology and Therapeutics, 2009, 122(1): 1-8.

[11] Harris R C, Chung E, Coffey R J. EGF receptor ligands[J]. Experimental Cell Research2003, 284 (1): 2-13.

[12] Herbst R S. Review of epidermal growth factor receptor biology [J]. International Journal of Radiation Oncology, Biology, Physics2004, 59 (2Suppl): 21-26.

[13] Stortelers C, Souriau C, van Liempt E, et al. Role of the N-terminus of epidermal growth factor in ErbB-2 / ErbB-3 binding studied by phage display[J]. Biochemistry2002, 41 (27): 8732-8741.

[14] Taherian A, Zadeh S M M, Ghani H, et al. ST6Gal1, Cox-2 and HB-EGF mRNAexpression in breast cancer samplesfrom Kashan, Iran[J]. Middle East Journal of Cancer, 2015, 6(1): 43-50.

[15] Fallon J H, Seroogy K B, Loughlin S E, et al. Epidermal growth factor immuno reactive material in the central nervous system location and development[J]. Nippon Ishikai Zasshi Journal of the Japan Medical1968, 60(3): 207-212.

[16] Gonul B, Erdogan D, Ozogul C, et al. Effect of EGF dosage forms on alkali burned corneal wound healing of mice.[J]. Burn1995, 21(1): 7-10.

[17] 朱文杰, 黃桂菊, 張東玲, 等. 合浦珠母貝表皮生長因子樣(EGF-like)基因的克隆與表達分析[J]. 水產學報, 2015, 5: 648-657. Zhu Wenjie, Huang Guijiu, Zhang Dongling, et al. Cloning and expressing of an novel EGF-like gene from[J]. Journal of Fisheries of China, 2015, 5: 648-657.

[18] Hermann P M, Van Kesteren R E, Wildering W C, et al. Neurotrophic actions of a novel molluscan epidermal growth factor.[J]. The Journal of Neuroscience, 2000, 20(17): 6355-6364.

[19] Hursh D A, Andrews M E, Raff R A. A sea urchin gene encodes a polypeptide homologous to epidermal growth factor [J]. Science, 1987, 237(4821): 1487-1490.

[20] Bisgrove B W, Andrews M E, Raff R A. Fibropellins, products of an EGF repeat-containing gene, form a unique extracellular matrix structure that surrounds the sea urchin embryo [J]. Developmental Biology, 1991, 146(1): 89-99.

[21] Woods R G, Roper K E, Gauthier M. Gene expression during early ascidian metamorphosis requires signalling by Hemps, an EGF-like protein[J]. Development, 2004, 131(12): 2921-2933.

[22] Eri R, Arnold J M, Hinman V F. Hemps, a novel EGF-likeprotein, plays a central role in ascidian metamorphosis [J]. Development, 1999, 126 (24): 5809-5818.

[23] 馮政夫, 王琳, 李文俠, 等. 海洋無脊椎動物組織總RNA提取方法的探討[J]. 海洋科學, 2014, 11: 24-28. Feng Zhengfu, Wang Lin, Li Wenxia, et al. Extraction of total RNA from marine invertebrate tissue [J]. Marine Sciences, 2014, 11: 24-28.

[24] 宋小瑞, 王曉通, 李莉, 等. 長牡蠣nacrein基因的克隆、結構及進化分析[J]. 海洋科學, 2015, 10: 85-93. Song Xiaorui, Wang Xiaotong, Li Li, et al. Molecular cloning and characterization of nacrein gene in() [J]. Marine Sciences, 2015, 10: 85-93.

[25] Zhang G, Fang X, Guo X, et al. Thegenome reveals stress adaptation and complexity of shell formation[J]. Nature, 2012, 490(7418): 49-54.

[26] Lockyer A E, Spinks J N, Walker A J, et al.transcriptome: Identification of cell— signalling, transcriptional control and immune related genes from open reading frame expressed sequence tags (ORESTES) [J]. Developmental & Comparative Immunology, 2007, 31 (8): 763-782.

[27] Zhao H, Waite J H. Coating proteins: structure and cross-linking in fp-1 from the green shell mussel[J]. Biochemistry, 2005, 44 (48), 15915- 15923.

[28] 張潔, 陳志森, 陳軍, 等. 雜色鮑后消化道生長相關基因的研究[J]. 廈門大學學報(自然科學版), 2013, 04: 560-568. Zhang Jie, Chen Zhishen, Chen Jun, et al. A study of, an EGF-related gene in the lower digestive tract from small abalone[J]. Journal of Xiamen University (Natural Science), 2013, 4: 560-568.

[29] Inoue K, Takeuchi Y, Miki D, et al. Mussel adhesive plaque protein gene is a novel member of epidermal growth factor-like gene family[J].Biol Chem, 1995, 270 (12), 6698-6701.

[30] Kim J Y, Adhya M, et al. Characterization, tissue expression, and immunohisto chemical localization of MCL3, a C-type lectin produced by-infected() [J]. Fish and shellfish immunology, 2008, 25(5): 598-603.

[31] Kumar S, Torres M P, Kaur S, et al. Smoking accelerates pancreatic cancer progression by promoting differentiation of MDSCs and inducing HB-EGF expression in macrophages [J]. Oncogene, 2015, 34(16): 2052-2060.

[32] Hoda I, Bahra, E A, et al. Chemopreventive effect of leflunomide against Ehrlich's solid tumor grown in mice: Effect on EGF and EGFR expression and tumor proliferation [J]. Life Sci, 2015, 141: 193-201.

[33] Ito J, Harada N, Nagashima O, et al. Wound-induced TGF-beta 1 and TGF-beta 2 enhance airway epithelial repair via HB-EGF and TGF-alpha [J]. Biochemical and Biophysical Research Communications, 2011, 412(1): 109-114.

[34] Seno M, Tada H, Kosaka M, et al. Human betacellulin, a member of the EGF family dominantly expressed in pancreas and small intestine, is fully active in a monomeric form [J]. Growth Factors, 1996, 13(3-4): 181-191.

(本文編輯: 梁德海)

Molecular cloning and characterization of EGF-like gene in

YANG Tie-zhu, SHEN He-ding, SHI Yan-mei, LIU Xin, WU Xin, LI Jie

(Key Laboratory of Exploration and Utilization of Aquatic Genetic Resources, Ministry of Education, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China)

The complete cDNA sequence of the EGF-like gene was cloned fromfor the first time. cDNA of the EGF-like gene was named1; it consisted of 1158 bp containing a 846-bp ORF that encoded a peptide of 281 amino acids. Multiple alignment and conserved domain analysis indicated that this peptide chain contained two conserved EGF domains and one EGF-like domain. Each domain contained at least six cysteine residues (CX7 CX4–5 CX10–13 CXCX8 C) that can form three disulfide bonds between C1 and C3, C2 and C4, and C5 and C6. These characteristics are consistent with the EGF protein family. However, the remaining sequences of1 were considerably different from other members of the EGF family. Thus, we proposed that1 is a novel EGF-like gene. A phylogenetic tree was built using MEGA6.0 to investigate the relationship between1 and proteins belonging to the EGF family. The study also suggested that proteins belonging to the EGF family are species-specific.

; EGF; gene cloning; phylogenetic analysis

Jun. 19, 2016

[National Natural Science Foundation of China, No. 41276157; Shanghai Fisheries College discipline construction project]

S917.4

A

1000-3096(2017)03-0008-09

10.11759/hykx 20160121002

2016-06-19;

2016-11-18

國家自然科學基金資助項目(41276157); 上海高校水產學一流學科建設項目

楊鐵柱(1990-), 男, 河南周口人, 碩士研究生, 主要從事海洋貝類功能基因研究, E-mail: yangtiezhu1234@163.com; 沈和定, 通信作者, 教授, 電話: 021-61900446, E-mail: hdshen@shou.edu.cn