田 潔，彭 博，吳世杰，趙麗元，鄒 亮，郝愛(ài)魚(yú)，丁紅雨（大連市藥品檢驗(yàn)所，遼寧大連 116021）

HPLC法同時(shí)測(cè)定市售滴眼液中4種抑菌劑的含量

田 潔＊，彭 博，吳世杰，趙麗元，鄒 亮，郝愛(ài)魚(yú)，丁紅雨（大連市藥品檢驗(yàn)所，遼寧大連 116021）

目的：建立同時(shí)測(cè)定市售滴眼液中羥苯甲酯、羥苯乙酯、羥苯丙酯和苯扎氯銨4種抑菌劑含量的方法。方法：采用高效液相色譜法。色譜柱為HypersilGOLD C18，流動(dòng)相為0.005mol/L醋酸銨溶液（每1 L中含三乙胺10m L，用冰醋酸調(diào)節(jié)pH為5.0± 0.5）-乙腈（45∶55，V/V），流速為1.0m L/min，檢測(cè)波長(zhǎng)分別為262 nm（羥苯甲酯、羥苯乙酯和羥苯丙酯）、214 nm（苯扎氯銨），柱溫為30℃，進(jìn)樣量為20μL。結(jié)果：羥苯甲酯、羥苯乙酯、羥苯丙酯和苯扎氯銨檢測(cè)質(zhì)量濃度線性范圍分別為1.235 0～15.438 0μg/m L（r＝0.999 9）、1.317 0～16.383 6μg/m L（r＝0.999 7）、1.207 2～15.089 4μg/m L（r＝0.999 6）、17.776～222.0μg/m L（r＝0.999 9）；定量限分別為2.0、2.0、2.0、1.11μg，檢測(cè)限分別為0.375、0.375、0.375、0.333μg；精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗(yàn)的RSD＜2.0%；加樣回收率分別為98.14%～102.48%（RSD＝1.6%，n＝9）、98.79%～102.42%（RSD＝1.3%，n＝9）、98.19%～102.49%（RSD＝1.5%，n＝9）和98.76%～100.53%（RSD＝0.6%，n＝9）。結(jié)論：該方法結(jié)果準(zhǔn)確、重復(fù)性好、操作簡(jiǎn)單，適用于市售滴眼液中羥苯甲酯、羥苯乙酯、羥苯丙酯和苯扎氯銨含量的同時(shí)測(cè)定。

高效液相色譜法；滴眼液；抑菌劑；羥苯甲酯；羥苯乙酯；羥苯丙酯；苯扎氯銨

眼用制劑（Ophthalm ic formulations）作為直接用于眼部發(fā)揮治療作用的無(wú)菌制劑，其安全性一直為人們所關(guān)注[1]。目前，國(guó)內(nèi)市場(chǎng)使用的眼用制劑大多數(shù)為多劑量包裝，一旦開(kāi)封后，容易在使用和保存過(guò)程中被淚液及空氣中的微生物污染，從而產(chǎn)生安全隱患[2-3]。為了防止在使用中被微生物污染，大部分眼用制劑都添加了抑菌劑（Preservatives）。抑菌劑是指能抑制病原微生物生長(zhǎng)與繁殖的化學(xué)藥品，通過(guò)干擾微生物有機(jī)體的生長(zhǎng)、繁殖和新陳代謝來(lái)發(fā)揮抑菌作用。但抑菌劑同時(shí)也對(duì)眼部有不同程度的刺激性或副作用[4]，其合理使用和質(zhì)量控制是保證眼用制劑安全性、有效性的關(guān)鍵。目前，眼用制劑中最常用的抑菌劑主要為對(duì)羥基苯甲酸酯類（如羥苯甲酯、羥苯乙酯和羥苯丙酯等）、陽(yáng)離子表面活性劑類（如苯扎氯銨、苯扎溴銨等）和醇類（如三氯叔丁醇等）。

2015年版《中國(guó)藥典》（四部）“通則”中規(guī)定，眼用制劑必須進(jìn)行抑菌效力檢查[5]，但這僅能確定其中抑菌劑的抑菌效力，并未對(duì)所加入的抑菌劑的量進(jìn)行合理控制。每種抑菌劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)均在各個(gè)品種項(xiàng)下分別規(guī)定，且方法各異，缺少統(tǒng)一檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)；而國(guó)內(nèi)外很多文獻(xiàn)報(bào)道的不同抑菌劑品種含量測(cè)定的色譜條件也有所不同[6-9]。為了更好地保證滴眼液的用藥安全、對(duì)其中抑菌劑的使用進(jìn)行定量控制，筆者采用高效液相色譜法（HPLC）同時(shí)測(cè)定了市售滴眼液中羥苯甲酯、羥苯乙酯、羥苯丙酯和苯扎氯銨4種常用抑菌劑的含量。

1 材料

1.1 儀器

2695型HPLC儀，包括二極管陣列檢測(cè)器、Empower色譜工作站（美國(guó)Waters公司）；BP211D型十萬(wàn)分之一電子分析天平（德國(guó)Sartorius公司）。

1.2 藥品與試劑

氯霉素滴眼液（A廠，批號(hào)：130203，規(guī)格：8m L∶20 mg；B廠，批號(hào)：140316，規(guī)格：8m L∶20mg）；鹽酸環(huán)丙沙星滴眼液（C廠，批號(hào)：20140904，規(guī)格：5m L∶15mg）；阿昔洛韋滴眼液（D廠，批號(hào)：14031901，規(guī)格：8m L∶8 mg）；鹽酸洛美沙星滴眼液（E廠，批號(hào)：1405081，規(guī)格：8 m L∶24 mg）；鹽酸左氧氟沙星滴眼液（F廠，批號(hào)：1312285，規(guī)格：5m L∶15mg）；鹽酸嗎啉胍滴眼液（G廠，批號(hào)：1203003，規(guī)格：8m L∶0.32 g）；氧氟沙星滴眼液（G廠，批號(hào)：13071025F，規(guī)格：5m L∶15mg）；珍珠明目滴眼液（H廠，批號(hào)：20131111，規(guī)格：8m L/瓶）；羥苯甲酯對(duì)照品（批號(hào)：100278-201103）、羥苯乙酯對(duì)照品（批號(hào)：100874-201102）、羥苯丙酯對(duì)照品（批號(hào)：100444-201102）、苯扎氯銨對(duì)照品（批號(hào)：100549-201102）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院，純度均為99.6%；乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，水為重蒸水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Hypersil GOLD C18（150mm×4.6mm，5 μm）；流動(dòng)相：0.005mol/L醋酸銨溶液（每1 L中含三乙胺10m L，用冰醋酸調(diào)節(jié)pH為5.0±0.5）-乙腈（45∶55，V/V）；流速：1.0m L/m in；檢測(cè)波長(zhǎng)：262 nm（羥苯甲酯、羥苯乙酯和羥苯丙酯）、214 nm（苯扎氯銨）；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：20μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對(duì)照品溶液 分別精密稱取羥苯甲酯對(duì)照品15.50mg、羥苯乙酯對(duì)照品16.40mg、羥苯丙酯對(duì)照品15.15mg，置于同一200m L量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取10m L，置于50m L量瓶中，再精密加入苯扎氯銨對(duì)照品1m L，加水稀釋至刻度，搖勻，作為混合對(duì)照品貯備液。精密量取上述混合對(duì)照品貯備液4 m L，置于10m L量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，經(jīng)0.45μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.2.2 供試品溶液 精密量取樣品1m L，置于10m L量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，經(jīng)0.45μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 空白溶液 取重蒸水作為空白溶液。

2.2.4 系統(tǒng)適用性溶液 精密量取苯扎氯銨對(duì)照品0.5 m L，置于50m L量瓶中。分別精密稱取羥苯甲酯、羥苯乙酯、羥苯丙酯對(duì)照品各2mg，置于100m L量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取20m L，置于上述50m L量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，經(jīng)0.45μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

取“2.2”項(xiàng)下系統(tǒng)適用性溶液、混合對(duì)照品溶液、空白溶液和供試品溶液（批號(hào)：140316）各適量，分別按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜，詳見(jiàn)圖1。由圖1可知，在該色譜條件下，各成分均能達(dá)到基線分離，分離度均＞1.5；理論板數(shù)以羥苯甲酯峰計(jì)為5 730，保留時(shí)間為2.44m in。結(jié)果表明，空白溶液在相應(yīng)的保留時(shí)間處無(wú)色譜峰出現(xiàn)，其他成分對(duì)測(cè)定無(wú)干擾。

2.4 線性關(guān)系考察

分別精密量取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品貯備液2、5、4、6、8、10 m L，分別置于25、25、10、10、10、10m L量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，即得系列混合對(duì)照品溶液。分別量取上述系列混合對(duì)照品溶液各適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以待測(cè)抑菌劑質(zhì)量濃度（x，μg/m L）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，回歸方程與線性范圍見(jiàn)表1。

2.5 定量限與檢測(cè)限考察

取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，倍比稀釋，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄峰面積。當(dāng)信噪比為10∶1時(shí)，得定量限（LOQ）；當(dāng)信噪比為3∶1時(shí)，得檢測(cè)限（LOD）。結(jié)果表明，羥苯甲酯、羥苯乙酯、羥苯丙酯和苯扎氯銨的LOQ分別為2.0、2.0、2.0、1.11 μg；LOD分別為0.375、0.375、0.375、0.333μg。

2.6 精密度試驗(yàn)

取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄峰面積。結(jié)果，羥苯甲酯、羥苯乙酯、羥苯丙酯、苯扎氯銨峰面積的RSD分別為0.4%、0.1%、0.3%、0.9%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液（批號(hào)：140316）適量，分別于室溫下放置0、2、4、6、8、12 h時(shí)按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，供試品溶液中只檢出羥苯乙酯，其峰面積的RSD＝0.8%（n＝6），表明供試品溶液在室溫下放置12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批樣品（批號(hào)：140316）適量，共6份，分別按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算各待測(cè)抑菌劑含量。結(jié)果，供試品溶液中只檢出羥苯乙酯，其平均含量為0.12%，RSD＝1.2%（n＝6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.9 加樣回收率試驗(yàn)

精密量取樣品（批號(hào)：130203）8m L，共9份，分別置于100m L量瓶中，分別加入低、中、高質(zhì)量的羥苯甲酯、羥苯乙酯、羥苯丙酯和苯扎氯銨對(duì)照品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見(jiàn)表2。

圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatogram s

表1 回歸方程與線性范圍Tab 1 Regression equationsand linear ranges

2.10 樣品抑菌劑含量測(cè)定

取9批樣品各適量，分別按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算各待測(cè)抑菌劑的含量，結(jié)果見(jiàn)表3。

表2 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝9）Tab 2 Resultsof recovery tests（n＝9）

表3 樣品抑菌劑含量測(cè)定結(jié)果（n＝3，%）Tab3 Results of contents determ ination of preservatives in sam p les（n＝3 ，%）

3 討論

3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

筆者分別在262、256 nm波長(zhǎng)處測(cè)定羥苯甲酯、羥苯乙酯、羥苯丙酯，結(jié)果在262 nm波長(zhǎng)條件下，無(wú)雜質(zhì)峰干擾測(cè)定，各峰之間分離良好；另外在214 nm波長(zhǎng)處，苯扎氯銨有最大吸收峰。因此，選擇262 nm波長(zhǎng)測(cè)定羥苯甲酯、羥苯乙酯、羥苯丙酯，214 nm波長(zhǎng)測(cè)定苯扎氯銨。

3.2 流動(dòng)相的選擇

筆者分別考察了0.005mol/L醋酸銨溶液-乙腈、乙腈-三乙胺磷酸溶液、甲醇-庚烷磺酸鈉溶液3種流動(dòng)相體系。結(jié)果，以乙腈-三乙胺磷酸溶液作為流動(dòng)相時(shí)，羥苯甲酯、羥苯乙酯分離度不能達(dá)到要求，且樣品色譜中有雜質(zhì)峰干擾測(cè)定；以甲醇-庚烷磺酸鈉溶液作為流動(dòng)相時(shí)，苯扎氯銨峰形拖尾，且保留時(shí)間過(guò)長(zhǎng)；而以0.005 mol/L醋酸銨溶液-乙腈為流動(dòng)相時(shí)，4種抑菌劑均能夠良好分離，且樣品色譜中無(wú)雜質(zhì)峰干擾測(cè)定。故最終選擇0.005mol/L醋酸銨溶液-乙腈為本試驗(yàn)的流動(dòng)相。

3.3 抑菌劑的含量

抑菌劑作為眼用制劑中不可缺少的成分，由于其同時(shí)具有抑菌作用和毒性作用兩個(gè)方面，其在制劑中的處方量顯得尤為關(guān)鍵。羥苯乙酯的有效抑菌濃度為0.03%～0.06%，羥苯甲酯與羥苯丙酯混合使用，其有效抑菌濃度分別為0.16%和0.02%，而苯扎氯銨的常用抑菌濃度為0.001%～0.002%[10-11]。本試驗(yàn)中，筆者隨機(jī)抽取的8個(gè)廠家的8個(gè)不同品種的滴眼液中，2個(gè)廠家的氯霉素滴眼液和鹽酸環(huán)丙沙星滴眼液中羥苯乙酯的含量均超出上述范圍，1個(gè)廠家的氧氟沙星滴眼液中苯扎氯銨的含量超出上述范圍；同時(shí)，5個(gè)廠家的抑菌劑加入量未達(dá)到有效抑菌濃度。可見(jiàn)，對(duì)滴眼液中抑菌劑的含量進(jìn)行控制具有實(shí)際意義，可督促生產(chǎn)廠家考察及確定抑菌劑的有效濃度，控制處方用量，保證用藥安全、有效。

綜上所述，本方法結(jié)果準(zhǔn)確、重復(fù)性好、操作簡(jiǎn)單，適用于市售滴眼液中羥苯甲酯、羥苯乙酯、羥苯丙酯和苯扎氯銨含量的同時(shí)測(cè)定。

[1] 吳盈盈，石森林.引起眼用制劑局部安全性問(wèn)題的主要原因及改善措施[J].中國(guó)醫(yī)藥工業(yè)雜志，2010，41（12）：943-947.

[2] 寧黎麗.眼用制劑研發(fā)過(guò)程中應(yīng)關(guān)注抑菌劑的合理使用和質(zhì)量控制[J].中國(guó)藥學(xué)雜志，2007，42（23）：1836-1838.

[3] 寧黎麗.對(duì)多劑量眼用制劑不添加抑菌劑的思考[J].中國(guó)新藥雜志，2009，18（7）：589-591.

[4] 安彥.眼用制劑中抑菌劑的應(yīng)用與質(zhì)量控制[J].天津藥學(xué)，2011，23（1）：56-58.

[5] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典：四部[S].2015年版.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2015：151-153.

[6] 韓文芳，韓保萍，朱啟登，等.HPLC測(cè)定鹽酸奧洛他定滴眼液中苯扎氯銨的含量[J].食品與藥品，2010，12（11）：425-427.

[7] 辛繼躍，朱樣根，危雪暉，等.馬來(lái)酸噻嗎洛爾滴眼液中羥苯乙酯含量測(cè)定方法研究[J].中國(guó)執(zhí)業(yè)藥師，2011，8（11）：33-35.

[8] 張菁，常旸，朱建平，等.HPLC法同時(shí)測(cè)定鹽酸林可霉素滴眼液中有關(guān)物質(zhì)和防腐劑含量[J].中國(guó)藥房，2013，24（45）：4298-4300.

[9] Labranche LP，Dumont SN，Levesque S，etal.Rapid determination of totalbenzalkonium chloride content in ophthalmic formulation[J].J Pharm Biomed Anal，2007，43（3）：989-993.

[10] 陳龍浩，王雪榮，孫春玲，等.HPLC法測(cè)定鹽酸丁卡因滴眼液中羥苯乙酯的含量[J].西北藥學(xué)雜志，2015，20（2）：149-151.

[11] 崔福德.藥劑學(xué)[M].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2002：90.

（編輯：劉 柳）

SimultaneousDeterm ination of 4 Preservatives in Marketed Eye Dropsby HPLC

TIAN Jie，PENG Bo，WU Shijie，ZHAO Liyuan，ZOU Liang，HAO Aiyu，DING Hongyu（Dalian Institute for Drug Control，Liaoning Dalian 116021，China）

OBJECTIVE：To establish a method for simultaneous determ ination of residualmethylparaben，ethylparaben，nipasol and benzalkonium chloride in marketed eye drops.METHODS：HPLC method was adopted.The determination was performed on Hypersil GOLD C18column w ith mobile phase consisted of 0.005 mol/L ammonium acetate（10 m L triehtylam ine in 1 L solution，pH adjusted to 5.0±0.5 w ith glacial acetic acid）-acetonitrile（45∶55，V/V）at the flow rate of 1.0 m L/min.The detection wavelength was 262 nm（methylparaben，ethylparaben，nipasol）and 214 nm（benzalkonium chloride），respectively.The column temperature was 30℃and sample size was 20μL.RESULTS：The linear range were 1.235 0-15.438 0μg/m L formethylparaben（r＝0.999 9），1.317 0-16.383 6μg/m L for ethylparaben（r＝0.999 7），1.207 2-15.089 4μg/m L for nipasol（r＝0.999 6）and 17.776-222.0μg/m L for benzalkonium chloride（r＝0.999 9），respectively.Lim its of quantitation were 2.0，2.0，2.0，1.11μg，respectively；limits of determination were 0.375，0.375，0.375，0.333μg，respectively.RSDs of precision，stability and reproducibility testswere all lower than 2.0%.The average recoverieswere 98.14%-102.48%（RSD＝1.6%，n＝9），98.79%-102.42%（RSD＝1.3%，n＝9），98.19%-102.49%（RSD＝1.5%，n＝9）and 98.76%-100.53%（RSD＝0.6%，n＝9），respectively.CONCLUSIONS：Themethod is accurate，reproducible，simple and suitable for the determination of residualmethylparaben，ethylparaben，nipasol and benzalkonium chloride in marketed eye drops.

HPLC；Eye drops；Preservatives；Methylparaben；Ethylparaben；Nipasol；Benzalkonium chloride

R927.2

A

1001-0408（2017）15-2134-04

2016-06-03

2016-12-30）

＊副主任藥師，碩士。研究方向：藥物分析。電話：0411-84255137。E-mail：sugar_tianjie@163.com

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2017.15.33