吳明俠，李 會，崔永霞，侯珊珊，丁亞慧（河南中醫(yī)藥大學(xué)分析測試中心，鄭州 450046）

金銀花炒炭前后6種成分的含量變化研究Δ

吳明俠＊，李 會，崔永霞#，侯珊珊，丁亞慧（河南中醫(yī)藥大學(xué)分析測試中心，鄭州 450046）

目的：建立同時測定金銀花中6種成分含量的方法，并研究金銀花炒炭前后上述成分含量的變化。方法：采用超高效液相色譜法。色譜柱為Agilent Eclipse Plus C18RRHD，流動相為0.1%磷酸溶液-乙腈（梯度洗脫），流速為0.2m L/m in，檢測波長為350 nm，柱溫為25℃，進樣量為1μL。結(jié)果：綠原酸、蘆丁、木犀草苷、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C檢測進樣量線性范圍分別為21.2～424μg（r＝0.999 3）、1.17～23μg（r＝0.999 5）、2.18～43μg（r＝0.999 8）、5.10～102μg（r＝0.999 3）、2.60～52μg（r＝0.999 1）、4.95～99μg（r＝0.999 8）；精密性、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗的RSD＜2.0%；加樣回收率分別為97.11%～99.76%（RSD＝1.20%，n＝6）、95.20%～99.90%（RSD＝2.20%，n＝6）、95.71%～100.30%（RSD＝2.20%，n＝6）、95.00%～96.98%（RSD＝0.88%，n＝6）、96.47%～103.00%（RSD＝2.40%，n＝6）、95.78%～103.80%（RSD＝3.20%，n＝6）。與炮制前比較，炮制后的金銀花中蘆丁、異綠原酸B、異綠原酸C的含量增加，綠原酸、異綠原酸A的含量明顯下降，而木犀草苷的含量無明顯變化。結(jié)論：該方法操作簡便，精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性好，可用于金銀花中6種成分含量的同時測定；金銀花炒炭前后化學(xué)成分有一定變化。

金銀花；炒炭；超高效液相色譜法；含量；變化

金銀花炭收載于1990年版《中國藥典》、1988年版《全國中藥炮制規(guī)范》及各省炮制規(guī)范。金銀花炒炭后寒性減弱，并具澀性，有止血作用，多用于血痢、崩漏，亦可用于吐血、衄血[1]。目前，國內(nèi)外對金銀花藥材的化學(xué)成分、藥理活性及作用機制研究較多[2-5]，而對金銀花炭止血機制研究尚不深入[6-8]。本課題組從金銀花炒炭前后多種化學(xué)成分變化來分析其炮制機制，旨在為從藥效學(xué)、藥理學(xué)的角度研究金銀花炭的止血機制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 儀器

1290型超高效液相色譜儀，包括1260DAD檢測器（美國Agilent公司）；JP-1500B-8型高速多功能粉碎機（永康市久品工貿(mào)有限公司）；KQ5200DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，功率：300W，頻率：70 kHz）；XS105DU型十萬分之一電子分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；FA2004B型萬分之一電子分析天平（上海精科天美科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 試劑

綠原酸對照品（批號：110753-200212）、蘆丁對照品（批號：110080-200306）、木犀草苷對照品（批號：111520-200201）均購自中國食品藥品檢定研究院，純度均＞98%；異綠原酸A對照品（批號：MUST-09061601）、異綠原酸B對照品（批號：MUST-09061602）、異綠原酸C對照品（批號：MUST-09041001）均購自成都曼思特生物科技有限公司，以上對照品純度均＞98%；甲醇、乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，水為純化水。

1.3 藥材

金銀花藥材購于河南中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院，經(jīng)河南中醫(yī)藥大學(xué)董誠明教授鑒定為真品；金銀花炭是在河南中醫(yī)藥大學(xué)炮制學(xué)科石延榜高級實驗師指導(dǎo)下炒制。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent Eclipse Plus C18RRHD（50mm×2.1 mm，1.8μm）；流動相：0.1%磷酸溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～2 m in，15%B；2～2.5 m in，15%→18%B；2.5～8min，18%B）；流速：0.2m L/min；檢測波長：350 nm；柱溫：25℃；進樣量：1μL[9]。色譜見圖1。

2.2 混合對照品溶液的制備

精密稱取待測成分對照品各適量，加甲醇溶解制成綠原酸、蘆丁、木犀草苷、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C質(zhì)量濃度分別為106.00、5.86、10.90、25.50、13.00、24.75μg/m L的混合對照品溶液。

2.3 金銀花炭樣品的制備

取金銀花藥材適量，共3份，每份約200 g，分別置于炒鍋中，炒制溫度為270℃，炒制時間為8.5min，炒至外焦褐色內(nèi)焦黃色，取出，晾干，即得。

2.4 供試品溶液的制備

取金銀花藥材及其炭品粉末（過4號篩）各約0.25 g，精密稱定，分別置于具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇30m L，超聲處理45m in，稱定質(zhì)量，加70%乙醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，經(jīng)0.45μm微孔濾膜濾過，即得。

圖1 超高效液相色譜圖Fig 1 UPLC chromatograms

2.5 線性關(guān)系考察

分別精密量取“2.2”項下混合對照品溶液0.2、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0μL，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以待測成分進樣量（x，μg）為橫坐標、峰面積（y）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程與線性范圍，詳見表1。

表1 回歸方程與線性范圍Tab 1 Regression equationsand linear ranges

2.6 精密度試驗

取“2.2”項下混合對照品溶液適量，按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣測定6次，記錄峰面積。結(jié)果，綠原酸、蘆丁、木犀草苷、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C峰面積的RSD分別為0.28%、0.47%、0.83%、1.01%、0.74%、0.66%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗

取“2.4”項下金銀花炭供試品溶液適量，分別于室溫下放置0、2、4、8、12、24 h時按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，綠原酸、蘆丁、木犀草苷、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C峰面積的RSD分別為0.33%、0.51%、0.79%、0.85%、0.46%、0.53%（n＝6），表明供試品溶液在室溫下放置24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.8 重復(fù)性試驗

精密稱取同一批金銀花炭樣品適量，按“2.4”項下方法制備供試品溶液，共6份，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，綠原酸、蘆丁、木犀草苷、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C峰面積的RSD分別為0.95%、1.07%、1.22%、1.56%、1.37%、1.78%（n＝6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.9 加樣回收率試驗

取已知含量金銀花炭樣品適量，共6份，分別加入一定質(zhì)量的待測成分對照品，按“2.4”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算加樣回收率，結(jié)果見表2。

表2 加樣回收率試驗結(jié)果（n＝6）Tab 2 Resultsof recovery test（n＝6）

2.10 樣品含量測定

取樣品各適量，分別按“2.4”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算樣品含量，結(jié)果見表3。

表3 樣品含量測定結(jié)果（n＝3，mg/g）Tab 3 Resultsof contentdetermination of samples（n＝3，mg/g）

3 討論

通過炮制前后化學(xué)成分的變化發(fā)現(xiàn)，金銀花經(jīng)炒炭后，增加的主要成分有蘆丁、異綠原酸B、異綠原酸C，而綠原酸和異綠原酸A的含量明顯下降，木犀草苷的含量變化不明顯。分析各成分含量變化的原因，可能是綠原酸和異綠原酸類化合物結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，隨著炮制時間延長及炮制溫度改變其結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，加熱后一部分轉(zhuǎn)化成異綠原酸B、C，一部分結(jié)構(gòu)分解破壞，總綠原酸類成分含量呈現(xiàn)下降趨勢。但金銀花炮制前后這6種成分含量的變化，是否與金銀花炒炭后止血作用增強、抑菌能力下降等藥理活性改變有關(guān)，仍有待進一步的試驗驗證。

[1] 孫赫.金銀花藥性與臨床應(yīng)用的文獻研究及系統(tǒng)性評價[D].長沙：湖南中醫(yī)藥大學(xué)，2015.

[2] 宋亞玲，倪付勇，趙祎武，等.金銀花化學(xué)成分研究進展[J].中草藥，2014，45（24）：3656-3664.

[3] 莊麗，張超，阿里穆斯.金銀花的藥理作用與臨床應(yīng)用研究進展[J].遼寧中醫(yī)雜志，2013，40（2）：378-381.

[4] 羅時旋，趙稷，張宇，等.代謝組學(xué)法考察金銀花醇提物對模型小鼠肝損傷的預(yù)防作用[J].中國藥房，2015，26（22）：3109-3112.

[5] 馬官英，張慶剛，鐘瑞華，等.金銀花總黃酮對氧化應(yīng)激中肝星狀細胞的保護作用[J].中國藥房，2014，25（31）：2895-2897.

[6] 王英姿，張兆旺.金銀花炮制研究述評[J].山東中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2000，24（1）：66-59.

[7] 黃艷英，黃敏，陸中海.金銀花炮制的實驗研究[J].中藥材，1994，17（1）：25-26.

[8] 叢悅，王艷，李勉.金銀花炮制機制的初步探討[J].河南大學(xué)學(xué)報（醫(yī)學(xué)版），2009，28（4）：242-246.

[9] 韓永成，劉偉，陳寧，等.UPLC法同時測定金銀花中6種有效成分的含量[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2015，27（1）：89-93.

Study on Content Changesof 6 Components in Lonicera japonica before and after Carbonized

WU M ingxia，LIHui，CU IYongxia，HOU Shanshan，DING Yahui（Center of Analysisand Testing Henan University of Chinese Medicine，Zhengzhou 450046，China）

OBJECTIVE：To establish themethod for simultaneous determination of 6 components in Lonicera japonica，and to study the content changes of them before and after before and after carbonized.METHODS：UPLCmethod was adopted.The determ ination was performed on Agilent Eclipse Plus C18RRHD column w ith mobile phase consisting of 0.1%phosphoric acid solutionacetonitrile（gradient elution）at the flow rate of 0.2 m L/m in.The detection wavelength was set at 350 nm，and column temperaturewas 25℃.The sample size was 1μL.RESULTS：The linear ranges of chlorogenic acid，rutin，galuteolin，isochlorogenic acid A，isochlorogenic acid B and isochlorogenic acid C were 21.2-424μg（r＝0.999 3），1.17-23μg（r＝0.999 5），2.18-43μg（r＝0.999 8），5.10-102μg（r＝0.999 3），2.60-52μg（r＝0.999 1），4.95-99μg（r＝0.999 8），respectively.RSDs of precision，stability and repeatability tests were all lower than 2.0%.Recoveries were 97.11%-99.76%（RSD＝1.20%，n＝6），95.20%-99.90%（RSD＝2.20%，n＝6），95.71%-100.30%（RSD＝2.20%，n＝6），95.00%-96.98%（RSD＝0.88%，n＝6），96.47%-103.00%（RSD＝2.40%，n＝6），95.78%-103.80%（RSD＝3.20%，n＝6）.Compared w ith before processing，the contents of rutin，isochlorogenic acid B and isochlorogenic acid C in L.japonica were increased along w ith processing，the contents of chlorogenic acid and isochlorogenic acid A were decreased significantly，while the content of galuteolin had no significant change.CONCLUSIONS：Themethod is simple，precise，stable and repeatable，and can be used for simultaneous determ ination of 6 components in L.japonica.Those chem ical components have certain changes before and after carbonized.

Lonicera japonica；Carbonize；UPLC；Content；Change

R927.2

A

1001-0408（2017）15-2112-03

2016-06-31

2016-11-03）

（編輯：張 靜）

河南省高等學(xué)校重點科研項目（No.17A360022）；河南中醫(yī)藥大學(xué)科研苗圃工程項目（No.MP2016-17）

＊副教授。研究方向：中藥質(zhì)量控制和新藥研發(fā)。E-mail：mxwu711@163.com

#通信作者：副教授。研究方向：中藥質(zhì)量控制和新藥研發(fā)。E-mail：1020076356@qq.com

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2017.15.27