陳鴻玉，李勁平，李文莉，丁 野，孫 輝，楊 清，黃曉燕（.湖南省藥品檢驗研究院，長沙 4000；2.中南大學(xué)藥學(xué)院，長沙 4003）

UPLC-QQQ/MS法檢測驢膠補血顆粒中的阿膠Δ

陳鴻玉1，2＊，李勁平2#，李文莉1，2，丁 野1，孫 輝1，楊 清1，黃曉燕1（1.湖南省藥品檢驗研究院，長沙 410001；2.中南大學(xué)藥學(xué)院，長沙 410013）

目的：建立驢膠補血顆粒中阿膠的檢測方法。方法：采用胰蛋白酶對制劑中阿膠進行酶解，并采用超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用法檢測制劑中阿膠成分。色譜條件：色譜柱為HypersilGOLD C18，流動相為0.1%甲酸溶液-乙腈（梯度洗脫），流速為0.3m L/m in，柱溫為30℃，進樣量為5μL。質(zhì)譜條件：離子源為電噴霧離子源，離子化模式為電噴霧正離子化模式（多反應(yīng)監(jiān)測），檢測離子對為阿膠特征分子離子峰m/z 539.8（雙電荷）→612.4和m/z 539.8（雙電荷）→923.8，噴霧電壓為3 100 V，鞘氣壓為20Arb，輔助氣壓為8Arb，離子傳熱管溫度為350℃，蒸發(fā)溫度為350℃，掃描模式為單離子檢測掃描，碰撞氣體為高純氬氣。結(jié)果：阿膠成分檢測質(zhì)量濃度線性范圍為20.24～2 024μg/m L（r＝0.997 8）；檢測限為1%；精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗的RSD＜6.0%。27批樣品中均檢出阿膠特征分子離子峰。結(jié)論：該方法專屬性強，可用于驢膠補血顆粒中阿膠的檢測。

超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜法；驢膠補血顆粒；阿膠；特征分子離子峰

驢膠補血顆粒為由阿膠、黃芪、黨參、熟地黃、白術(shù)、當歸6味藥材組方而成，具有補氣養(yǎng)血之功效，臨床用于久病氣血兩虛所致的倦怠乏力、面黃肌瘦、頭暈?zāi)垦５劝Y的治療[1]。方中阿膠為君藥，阿膠是由馬科動物驢的皮熬制而成的膠，具有滋陰補血之功效，為治療血虛之首選藥[2-3]。隨著阿膠的需求量日益增大及資源萎縮，致使該藥材摻偽造假問題嚴重，存在使用其他劣質(zhì)皮類替代驢皮熬制阿膠的違法行為[4-5]。近年來，相關(guān)研究針對阿膠藥材摻偽造假的問題建立了以特征肽段為指標的專屬性檢測方法，該方法有效地應(yīng)用于打擊阿膠藥材摻偽造假違法行為[6-9]。然而，對于一些阿膠成藥摻偽摻假的情況仍缺乏專屬性檢測方法。本課題組研究的驢膠補血顆粒為2015年版《中國藥典》（一部）收載的含阿膠中成藥，但現(xiàn)行質(zhì)量標準中無與阿膠藥材相關(guān)的檢測項目[2]。為了提高該制劑質(zhì)量標準的專屬性和可控性，本課題組采用超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用法（UPLC-QQQ/MS）建立了其中阿膠的專屬性檢測方法，并進行了方法學(xué)驗證。

1 材料

1.1 儀器

Dionex UltiMate 3000型 UPLC儀，包括 TSQ Endura QQQ/MS系統(tǒng)（美國Thermo Scientific公司）；CG-300型超聲波清洗儀（廣州比朗儀器有限公司，功率：300W，頻率：25 kHz）；AE240型電子分析天平、XSE205DU型電子分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）。

1.2 藥品與試劑

驢膠補血顆粒（湖南時代陽光藥業(yè)股份有限公司，批 號 ：20120410、20120510、20120901、20120921、20121006、20121015、20130145、20130209、20130409、20130507、20130910、20131129、20140312、20140508、20140803、20150215、20150301、20150310，規(guī)格：20 g/袋；九芝堂股份有限公司，批號：201306013、201309058、201310033、 201312006、 201403032、 201404019、201405025、201411086、201412014，規(guī)格：20 g/袋）；阿膠對照藥材（批號：121274-201202）、黃明膠對照藥材（批號：121695-201301）、鹿角膠對照藥材（批號：121694-201301）均購自中國食品藥品檢定研究院；豬皮膠對照藥材（筆者自制）；胰蛋白酶為質(zhì)譜級，甲酸、乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 試驗條件

2.1.1 色譜條件 色譜柱：HypersilGOLD C18（75mm× 2.1mm，1.8μm）；流動相：0.1%甲酸溶液-乙腈，梯度洗脫（0～6 min，95%→93%A；6～8 min，93%→10%A；8～9 m in，10%A；9～9.5 m in，10%→95%A；9.5～12 min，95%A）；流速：0.3m L/min；柱溫：30℃；進樣量：5μL。

2.1.2 質(zhì)譜條件 離子源：電噴霧離子源；離子化模式：電噴霧正離子化模式，進行多反應(yīng)監(jiān)測；檢測離子對：阿膠特征分子離子峰m/z 539.8（雙電荷）→612.4和m/z 539.8（雙電荷）→923.8；噴霧電壓：3 100 V；鞘氣壓：20 Arb；輔助氣壓：8 Arb；離子傳熱管溫度：350℃；蒸發(fā)溫度：350℃；掃描模式：單離子檢測掃描[m/z539.8（雙電荷）→612.4，碰撞能量：16 V；m/z 539.8（雙電荷）→923.8，碰撞能量：20V]；碰撞氣體：高純氬氣。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照藥材溶液 稱取阿膠對照藥材0.1 g，置于350m L量瓶中，加1%碳酸氫鈉溶液40m L，超聲處理30m in，加1%碳酸氫鈉溶液定容，搖勻，用0.22μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液100μL，加胰蛋白酶溶液（取胰蛋白酶，加1%碳酸氫鈉溶液使溶解，制成質(zhì)量濃度為2μg/μL的溶液，臨用新配，下同）15μL，搖勻，37℃下恒溫酶解8 h，制成阿膠對照藥材溶液。同法制成黃明膠、豬皮膠、鹿角膠對照藥材溶液。

2.2.2 供試品溶液 取樣品適量，研細，稱取1 g（約相當于含阿膠0.1 g），置于50m L量瓶中，加1%碳酸氫鈉溶液40m L，超聲處理30m in，加1%碳酸氫鈉溶液定容，搖勻，經(jīng)0.22μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液100μL，加胰蛋白酶溶液15μL，搖勻，37℃下恒溫酶解8 h，即得。

2.2.3 陰性對照溶液 按驢膠補血顆粒處方和工藝制備缺阿膠的陰性樣品，并按“2.2.2”項下方法制成陰性對照溶液。

2.3 專屬性試驗

分別取“2.2”項下對照藥材溶液、供試品溶液和陰性對照溶液各適量，按“2.1”項下試驗條件進樣測定，記錄色譜，詳見圖1。結(jié)果，陰性對照色譜圖中，在與阿膠對照藥材和供試品相應(yīng)位置上無相應(yīng)色譜峰，表明陰性對照對阿膠成分檢測無干擾，方法專屬性良好。

圖1 特征分子離子峰色譜圖Fig 1 Characteristicmolecular ion peak chromatograms

2.4 線性關(guān)系考察

精密稱取阿膠對照藥材0.101 2 g，置于50m L量瓶中，加1%碳酸氫鈉溶液40m L，超聲處理30m in，加1%碳酸氫鈉溶液定容，搖勻，作為溶液A。精密量取溶液A 1、2、5、10、20m L，分別置于100m L量瓶中，加1%碳酸氫鈉溶液定容，搖勻，經(jīng)0.22μm微孔濾膜濾過，精密量取續(xù)濾液100μL，置于10m L量瓶中，加胰蛋白酶溶液15μL，搖勻，37℃下恒溫酶解8 h，制成系列阿膠對照藥材溶液。精密量取上述系列阿膠對照藥材溶液各5μL，按“2.1”項下試驗條件進樣測定，記錄離子信號相對強度。以阿膠對照藥材溶液質(zhì)量濃度（x，μg/m L）為橫坐標、離子信號相對強度（y）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程y＝42 810x－5 053.3（r＝0.997 8）。結(jié)果表明，阿膠對照藥材溶液檢測質(zhì)量濃度線性范圍為20.24～2 024μg/m L。

2.5 檢測限考察

精密量取“2.2.1”項下阿膠對照藥材溶液適量，倍比稀釋，并按“2.1”項下試驗條件進樣測定。當信噪比為3∶1時，得檢測限為1%。

2.6 精密度試驗

取“2.2.2”項下供試品溶液（批號：20150310）適量，按“2.1”項下試驗條件連續(xù)進樣測定6次，記錄離子信號相對強度。結(jié)果，m/z539.8（雙電荷）→612.4、923.8提取離子流峰保留時間的RSD＝0（n＝6）；m/z 539.8（雙電荷）→923.8、m/z539.8（雙電荷）→612.4提取離子流峰離子信號相對強度的RSD分別為4.53%、3.47%（n＝6），表明本方法精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗

取“2.2.2”項下供試品溶液（批號：20150310）適量，分別于室溫下放置0、3、6、9、15、24 h時按“2.1”項下試驗條件進樣測定，記錄離子信號相對強度。結(jié)果，m/z 539.8（雙電荷）→612.4、923.8提取離子流峰保留時間的RSD＝0.10%（n＝6）；m/z 539.8（雙電荷）→923.8、m/z 539.8（雙電荷）→612.4提取離子流峰離子信號相對強度的RSD分別為2.97%、5.64%（n＝6），表明供試品溶液室溫下放置24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.8 重復(fù)性試驗

精密稱取同一批樣品（批號：20150310）適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，共6份，再按“2.1”項下試驗條件進樣測定，記錄離子信號相對強度。結(jié)果，m/z539.8（雙電荷）→612.4、923.8提取離子流峰保留時間的RSD＝0（n＝6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.9 樣品檢測

取27批樣品各適量，分別按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下試驗條件進樣測定，記錄離子信號相對強度。結(jié)果，27批樣品中均檢出阿膠特征分子離子峰。

3 討論

3.1 色譜條件的選擇

在流動相方面，筆者主要考察了乙腈-0.1%甲酸溶液（梯度洗脫）、甲醇-水（梯度洗脫）、乙腈-水（梯度洗脫）、0.1%甲酸-乙腈溶液（梯度洗脫），結(jié)果表明，乙腈-0.1%甲酸溶液（梯度洗脫）的分離效果和峰形較好。在柱溫方面，筆者考察了柱溫為25、30、35℃對色譜分離效果的影響，結(jié)果表明，柱溫對分離效果和峰形影響不大，本試驗選擇柱溫為30℃。在色譜柱方面，筆者考察了2個品牌的色譜柱，分別是Hypersil GOLD C18（75 mm×2.1 mm，1.8μm）和ACQUITY UPLC BEH C18（50mm×2.1mm，1.7μm），結(jié)果前者分離效果較好。

3.2 酶解時間、酶量和酶解溫度的考察

筆者參照2015年版《中國藥典》（四部）“通則3405肽檢查法”中的溶劑條件，考察酶解時間和酶量[10-12]。在37℃恒溫水浴中，于酶解8、12、16、20、24 h時分別進樣，發(fā)現(xiàn)酶解8、12 h時阿膠特征分子離子峰離子信號相對強度一致，因此選擇8 h作為酶解時間。將樣品和酶比例分別設(shè)置為800∶3（m/m）、800∶6（m/m）、800∶9（m/ m），發(fā)現(xiàn)當比例為800∶6（m/m）和800∶9（m/m）時，阿膠特征分子離子峰離子信號相對強度一致，考慮盡量降低成本，故選擇比例為800∶6（m/m）。酶解溫度選擇30、37、45℃進行考察，發(fā)現(xiàn)37℃時阿膠特征分子離子峰離子信號相對強度最大，故選擇酶解溫度為37℃。

3.3 提取溶劑pH的考察

提取溶劑分別選擇1%碳酸氫鈉溶液（甲酸調(diào)pH至6.0）、1%碳酸氫鈉溶液、1%碳酸氫鈉溶液（氨試液調(diào)pH至9.0），按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，分別進樣。結(jié)果，1%碳酸氫鈉溶液阿膠特征分子離子峰離子信號相對強度最大。故選擇其作為提取溶劑。

3.4 特征分子離子的選擇

在本課題組的前期研究中[5-9]，以主成分分析法找出阿膠與龜甲膠、鹿角膠、黃明膠、新阿膠的區(qū)別，并通過偏最小二乘法分析找出特征分子離子。故本試驗中以m/z 539.8（雙電荷）→612.4、923.8為樣品中阿膠的特征分子離子。

3.5 耐用性考察

筆者主要考察了UltiMate 3000/TSQ Endura QQQ/ MS儀、API 5500 QQQ/MS儀、Waters I-Class/Xevo TQD QQQ/MS儀。結(jié)果表明，3個品牌QQQ/MS儀檢測供試品的m/z539.8（雙電荷）→923.8和m/z539.8（雙電荷）→612.4提取離子流色譜圖中，同時出現(xiàn)與阿膠特征分子離子峰保留時間相同的色譜峰，說明本方法的耐用性較好[13-14]。

綜上所述，本方法專屬性強，可用于驢膠補血顆粒中阿膠的檢測。

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Determination of Donkey-hide Gelatin in Lüjiao Buxue Granulesby UPLC-QQQ/MS

CHEN Hongyu1，2，LIJinping2，LIW enli1，2，DING Ye1，SUN Hui1，YANG Qing1，HUANG Xiaoyan1（1.Hunan Provincial Institute for Drug Control，Changsha 410001，China；2.School of Pharmaceutical Sciences，Central South University，Changsha 410013，China）

OBJECTIVE：To establish amethod for the determ ination of donkey-hide gelatin in Lüjiao buxue granules.METHODS：Trypsin was used for enzymatic hydrolysis of donkey-hide gelatin.UPLC-QQQ/MS was adopted for the determ ination of donkey-hide gelatin in the preparation：Hypersil GOLD C18column wasused w ith mobile phase consisted of 0.1%form ic acid solution-acetonitrile（gradient elution）at the flow rate of 0.3 m L/m in.The column temperature was 30℃，and sample size was 5μL. Mass chromatography condition was that ion source was electrospray ion source；ionization mode was ESI+；multiple responsemonitoring was adopted，and characteristic molecular ion peaks of donkey-hide gelatin w ith mass-to-charge ratio of m/z 539.8（double charge）→ 612.4 and m/z 539.8（double charge）→ 923.8 were used as detection ion pair.Spray voltage was 3 100 V；sheath gas was20 Arb；auxiliary gaswas 8 Arb；ion transfer tube temperature was350℃；evaporation temperature was 350℃；scan mode was SRM.Collision gaswas high purity argon.RESULTS：The sample size of donkey-hide gelatin ranged 20.24-2 024μg/m L（r＝0.997 8）.The detection lim it was 1%.RSDs of precision，stability and reproducibility testswere all lower than 6.0%.The characteristic molecular ion peaks of donkey-hide gelatin could be detected in 27 batches of samples.CONCLUSIONS：The method is specific and can be used for the determ ination of donkey-hide gelatin in Lüjiao buxue granules.

UPLC-QQQ/MS；Lüjiao buxue granules；Donkey-hide gelatin；Characteristicmolecular ion peak

R927

A

1001-0408（2017）15-2101-04

2016-06-24

2016-11-05）

（編輯：張 靜）

國家科技重大專項課題（No.2014ZX09304307）；湖南省食品藥品監(jiān)督管理局食品藥品安全科技項目（No.湘食藥科R201504）

＊主管藥師。研究方向：藥物分析與質(zhì)量標準。E-mail：649409690@qq.com

#通信作者：副教授，碩士生導(dǎo)師。研究方向：藥物分析與質(zhì)量標準。電話：0731-82650340。E-mail：pjingli@163.com

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2017.15.24