張小強(qiáng)，吳 云，楊一帆，王振中，丁 崗#（1.江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司，江蘇連云港 222001；2.中藥制藥過程新技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇連云港 222001）

膽木葉藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究Δ

張小強(qiáng)1，2＊，吳 云1，2，楊一帆1，2，王振中1，2，丁 崗1，2#（1.江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司，江蘇連云港 222001；2.中藥制藥過程新技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇連云港 222001）

目的：建立膽木葉藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。方法：采用顯微鑒別法和薄層色譜法（TLC）對(duì)藥材進(jìn)行定性鑒別；測(cè)定藥材水分、灰分；采用高效液相色譜法測(cè)定藥材中異長(zhǎng)春花苷內(nèi)酰胺含量：色譜柱為L(zhǎng)ichrospher C18，流動(dòng)相為乙腈-0.1%磷酸溶液（梯度洗脫），流速為1m L/m in，檢測(cè)波長(zhǎng)為226 nm，柱溫為30℃，進(jìn)樣量為10μL。結(jié)果：膽木葉的顯微鑒別特征性強(qiáng)，TLC圖斑點(diǎn)清晰，分離度好，陰性對(duì)照無干擾。異長(zhǎng)春花苷內(nèi)酰胺檢測(cè)質(zhì)量濃度線性范圍為0.010 5～0.21mg/m L（r＝0.999 5）；精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗(yàn)的RSD＜2.0%；加樣回收率為96.25%～101.82%（RSD＝1.86%，n＝9）。測(cè)得藥材樣品總灰分為5.27%～6.44%，酸不溶性灰分為0.23%～0.36%，水分為9.48%～11.46%，異長(zhǎng)春花苷內(nèi)酰胺含量為0.124%～1.003%。結(jié)論：該研究所建標(biāo)準(zhǔn)可用于膽木葉藥材的質(zhì)量控制。

膽木葉；質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；顯微鑒別法；薄層色譜法；含量測(cè)定；高效液相色譜法

膽木為茜草科烏檀屬烏檀Nauclea officinalis（Pierre ex Pitard）Merr.etChun的干燥莖、枝、樹皮和根，在我國主要分布于海南、廣西、廣東等地。其味苦、性寒，具清熱解毒、消腫止痛之功效[1]，在南方民間常用于治療感冒發(fā)燒、肺炎、腸炎、痢疾、濕疹、皮疹等，現(xiàn)代臨床用于治療急性咽喉炎、急性結(jié)膜炎及上呼吸道感染[2]。

膽木葉為茜草科植物膽木的干燥葉。本課題組從膽木葉中分離鑒定出多個(gè)生物堿和黃酮類成分，如異長(zhǎng)春花苷內(nèi)酰胺、短小蛇根草苷等；并通過比較膽木葉與膽木心的指紋圖譜，發(fā)現(xiàn)二者具有同樣的特征性指標(biāo)成分吲哚類生物堿[3-4]。

據(jù)報(bào)道，烏檀屬植物富含吲哚類生物堿并具有抗增殖、抗瘧、抗菌、抗腫瘤等多種生物活性[5]。相關(guān)藥理研究發(fā)現(xiàn)，膽木葉醇提取物具有抑制耐甲氧西林金黃色葡萄球菌活性[6]及抗氧化[7]、抗炎和鎮(zhèn)痛作用[8]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，膽木葉醇提取部位（ELN）能明顯減少模型大鼠角叉菜膠性炎癥滲出液中前列腺素E2（PGE2）含量[9-10]。以上均說明膽木葉具有潛在的藥用價(jià)值。

目前，關(guān)于膽木葉質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究未見報(bào)道。本課題組首次建立了該藥材的質(zhì)量控制方法，包括基源鑒定，性狀鑒別，水分、總灰分、酸不溶性灰分檢查，顯微鑒別，薄層色譜（TLC）鑒別和異長(zhǎng)春花苷內(nèi)酰胺含量測(cè)定[11-13]，并根據(jù)10批不同產(chǎn)地藥材樣品的相關(guān)檢測(cè)結(jié)果，初步制定了檢測(cè)限度，旨在為保障其質(zhì)量提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

1200型高效液相色譜儀，包括四元泵、DAD檢測(cè)器（美國Agilent公司）；XS205型電子分析天平、AL204型電子分析天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]；KH2200B型超聲波清洗器（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司，功率：250W，頻率：40 kHz）；DESA型全自動(dòng)紫外攝像儀（德國Desaga公司）；DEM-11型數(shù)碼顯微鏡（北京清大德人科技有限公司）；DHG-9023A型電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）。

1.2 試劑

異長(zhǎng)春花苷內(nèi)酰胺對(duì)照品（中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：111778-201102，純度：95.3%）；硅膠GF254預(yù)制板（青島海洋化工廠分廠，批號(hào)：20150408）；乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，水為純化水。

1.3 藥材

膽木葉藥材采自廣西、海南各地（見表1），由中藥制藥工程新技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室丁崗高級(jí)工程師鑒定為真品。

表1 膽木葉藥材來源Tab 1 Source of the leavesof N.officinalis

2 方法與結(jié)果

2.1 性狀

膽木葉多皺縮卷曲，有的破碎。完整葉片展開后呈長(zhǎng)橢圓形至長(zhǎng)圓狀倒披針形，長(zhǎng)5～14 cm，寬3～7 cm，頂端漸尖而略鈍，基部呈楔形；上表面呈墨綠色，背面褐色，葉脈呈網(wǎng)狀，側(cè)葉脈明顯，纖細(xì)，向上斜伸，近邊緣處連結(jié)，在葉片兩邊略凸起。葉柄長(zhǎng)0.5～3 cm，棕褐色。氣微，味苦、澀。

2.2 顯微特征

藥材樣品粉末為黃棕色。導(dǎo)管眾多，大小不一，多為螺紋導(dǎo)管。纖維多成束，壁較厚。非腺毛較粗大，頂端細(xì)胞尖銳。薄壁細(xì)胞類圓形。厚角組織較多，黃棕色，詳見圖1。

2.3 TLC鑒別

取藥材樣品粉末1 g，加70%乙醇溶液25m L，超聲處理30m in，冷卻，濾過，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。取對(duì)照品適量，精密稱定，加70%乙醇溶液制成異長(zhǎng)春花苷內(nèi)酰胺質(zhì)量濃度為1 mg/m L的對(duì)照品溶液。以70%乙醇溶液作為陰性對(duì)照溶液。按TLC法[2015年版《中國藥典》（四部）][14]試驗(yàn)，量取上述供試品溶液5μL、對(duì)照品溶液和空白對(duì)照溶液各3μL，分別點(diǎn)于同一硅膠GF254薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-乙酸乙酯-水（15∶22∶ 40∶10，V/V/V/V）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視。結(jié)果，供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)，空白對(duì)照無干擾，詳見圖2。

圖1 顯微特征Fig 1 M icroscopic characteristics

2.4 水分測(cè)定

取各批藥材樣品粉末約3 g，精密稱定，按2015年版《中國藥典》（四部）“通則0832第一法”[14]測(cè)定，每批平行測(cè)定2次，詳見表2。結(jié)果表明，藥材樣品水分在9.48%～11.46%之間，平均水分為10.34%。故初步擬定膽木葉藥材水分不得過12.0%。

圖2 薄層色譜圖Fig 2 TLC chromatograms

表2 藥材樣品水分、灰分測(cè)定結(jié)果（n＝2）Tab 2 Resultsofmoisture and ash determ ination（n＝2）

2.5 總灰分、酸不溶性灰分的測(cè)定

取各批藥材樣品粉末約2 g，精密稱定，按2015年版《中國藥典》（四部）“通則2302總灰分、酸不溶性灰分測(cè)定法”[14]測(cè)定。每批平行測(cè)定2次，詳見表2。結(jié)果表明，藥材樣品總灰分在5.27%～6.44%之間，平均總灰分為5.76%；酸不溶性灰分在0.23%～0.36%之間，平均酸不溶性灰分為0.28%。故初步擬定膽木葉藥材總灰分不得過6.5%，酸不溶性灰分不得過0.50%。

2.6 異長(zhǎng)春花苷內(nèi)酰胺含量測(cè)定

2.6.1 色譜條件和系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 色譜柱：Lichrospher C18（250mm×4.6mm，5μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B），梯度洗脫（0～30m in，15%→32%A；30～35min，32%→95%A）[11]；流速：1m L/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：226 nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10μL。在上述色譜條件下，理論板數(shù)以異長(zhǎng)春花苷內(nèi)酰胺峰計(jì)不少于3 000[12]；基線分離良好，分離度＞1.5，詳見圖3。

2.6.2 對(duì)照品溶液的制備 取對(duì)照品適量，精密稱定，加75%乙醇溶液制成異長(zhǎng)春花苷內(nèi)酰胺質(zhì)量濃度為1 mg/m L的對(duì)照品溶液。

2.6.3 供試品溶液的制備 取樣品粉末（過3號(hào)篩）1 g，精密稱定，置于250m L圓底燒瓶中，加75%乙醇溶液100m L，稱定質(zhì)量，加熱回流2 h，放冷，再次稱定質(zhì)量，加75%乙醇溶液補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.6.4 空白對(duì)照溶液的制備 以75%乙醇溶液作為空白對(duì)照溶液。

圖3 高效液相色譜圖Fig 3 HPLC chromatograms

2.6.5 線性關(guān)系考察 分別精密量取“2.6.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液0.1、0.2、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0m L，分別置于10m L量瓶中，加75%乙醇溶液定容，制成系列對(duì)照品溶液。精密量取上述系列對(duì)照品溶液各10μL，按“2.6.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以異長(zhǎng)春花苷內(nèi)酰胺質(zhì)量濃度（x，mg/m L）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程y＝4 056.3x－5.949 2（r＝0.999 5）。結(jié)果表明，異長(zhǎng)春花苷內(nèi)酰胺檢測(cè)質(zhì)量濃度線性范圍為0.010 5～0.21mg/m L。

2.6.6 精密度試驗(yàn) 取“2.6.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液適量，按“2.6.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄峰面積。結(jié)果，異長(zhǎng)春花苷內(nèi)酰胺峰面積的RSD＝0.72%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.6.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.6.3”項(xiàng)下供試品溶液（批號(hào)：15090807）適量，分別于室溫下放置0、2、4、6、8、12、24 h時(shí)按“2.6.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，異長(zhǎng)春花苷內(nèi)酰胺峰面積的RSD＝0.21%（n＝7），表明供試品溶液室溫下放置24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.6.8 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取同一批樣品（批號(hào)：15090807）適量，按“2.6.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，共6份，再按“2.6.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算含量。結(jié)果，異長(zhǎng)春花苷內(nèi)酰胺平均含量為0.423%，RSD＝1.18%（n＝6），表明本方法重復(fù)性良好。2.6.9 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量樣品（批號(hào)：15090807）0.5 g，共6份，分別加入低、中、高質(zhì)量的異長(zhǎng)春花苷內(nèi)酰胺對(duì)照品各適量，按“2.6.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.6.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表3。

2.6.10 藥材樣品含量測(cè)定 取10批樣品各適量，分別按“2.6.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.6.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算樣品含量，結(jié)果見表4。

由表4可知，10批膽木葉藥材中異長(zhǎng)春花苷內(nèi)酰胺含量在0.124%～1.003%之間，平均含量為0.433%?？紤]到不同產(chǎn)地、不同采收期采集的膽木葉藥材的含量差異，暫定膽木葉藥材按干燥品計(jì)算，含異長(zhǎng)春花苷內(nèi)酰胺（C26H30N2O8）不得少于0.30%。

表3 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝9）Tab 3 Resultsof recovery tests（n＝9）

表4 藥材樣品含量測(cè)定結(jié)果（n＝3，%）Tab 4 Results of content determination of samples（n＝3，%）

3 討論

關(guān)于膽木的基源，1977年版《中國藥典》（一部）[15]記載為茜草科植物烏檀N.officinalis Pierre ex Pitard的干燥莖及根。2004年版《廣東省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》（第一冊(cè)）[1]記載為茜草科植物膽木N.officinalis（Pierre ex Pitard）Merr.ex Chun的干燥木材。經(jīng)對(duì)照二者基源相同，均為茜草科烏檀屬植物烏檀（又稱膽木），但入藥部位稍有不同（前者為干燥莖及根，后者為干燥木材）。從1999年版《中國植物志》[16]來看，1940年烏檀（又稱膽木）的拉丁名已明確為N.officinalis（Pierre ex Pitard）Merr.et Chun，因未查閱到1977年版《中國藥典》起草說明，其中收載的烏檀（又稱膽木）將拉丁名定為N.officinalis Pierre ex Pitard的原因不明。2004年版《廣東省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》（第一冊(cè)）[1]中，將膽木的拉丁名定為N.officinalis（Pierre ex Pitard）Merr.ex Chun，這與1999年版《中國植物志》中的拉丁名存在細(xì)微差異，相關(guān)起草說明也未給予解釋。鑒于以上情況，考慮到膽木藥材基源考證的歷史變革及藥材名稱的普及性，將膽木葉的基源確定為茜草科烏檀屬植物膽木N.officinalis（Pierre ex Pitard）Merr.etChun的干燥葉。目前，膽木葉尚未被國家或地方標(biāo)準(zhǔn)收錄，有必要建立膽木葉藥材標(biāo)準(zhǔn)，便于其新用藥部位的開發(fā)利用。

根據(jù)10批膽木葉藥材的各項(xiàng)檢測(cè)結(jié)果，建議膽木葉藥材按干燥品計(jì)算，含異長(zhǎng)春花苷內(nèi)酰胺（C26H30N2O8）不得少于0.30%，水分不得過12.0%，總灰分不得過6.5%，酸不溶性灰分不得過0.50%。

綜上所述，本研究建立的膽木葉藥材定性、定量檢測(cè)方法具有簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、靈敏度高、重復(fù)性好等特點(diǎn)，可為膽木葉藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供科學(xué)依據(jù)，并為膽木新藥用部位的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

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Study on Quality Standard for the Leavesof Nauclea officinalis

ZHANG Xiaoqiang1，2，WU Yun1，2，YANG Yifan1，2，WANG Zhenzhong1，2，DING Gang1，2（1.Jiangsu Kanion Pharmaceutical Co.，Ltd.，Jiangsu Lianyungang 222001，China；2.State Key Lab of New-tech for Chinese Medicine Pharmaceutical Process，Jiangsu Lianyungang 222001，China）

OBJECTIVE：To establish the quality standard for the leaves of Nauclea officinalis.METHODS：M icroscopic identification and TLC methods were used for qualitative identification of N.officinalis.Themoisture and ash ofmedicinalmaterials were determined.HPLC method was adopted to determine the content of strictosam ide inmedicinalmaterials.The determination was performed on Lichrospher C18column w ith mobile phase consisted of acetonitrile-0.1%phosphoric acid solution（gradient elution）at the flow rate of 1m L/min，injection volume was 10μL.The detection wavelength was set at 226 nm，and the column temperature was 30℃.RESULTS：M icroscopic identification of the leaves of N.officinalis had strong characteristics，and TLC sports were clear and well-separated w ithout interference from negative control.The linear range of strictosam ide were 0.010 5-0.21 mg/m L（r＝0.999 5）；RSDs of precision，stability and reproducibility tests were all lower than 2.0%.Average recoveries were 96.25-101.82%（RSD＝1.86%，n＝9）.Total ash of medicinalmaterials was 5.27%-6.44%，acid insoluble ash was 0.23%-0.36%，water content was 9.48%-11.46%，strictosamide was 0.124%-1.003%.CONCLUSIONS：Established standard can be used for quality evaluation of N.officinalis.

Leaves of Nauclea officinalis；Quality standard；M icroscopic identification；TLC；Content determ ination；HPLC

R927

A

1001-0408（2017）15-2097-04

2016-09-14

2016-10-14）

（編輯：張 靜）

“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項(xiàng)（No.2013ZX09402203）

＊助理研究員，碩士。研究方向：中藥、天然藥物新藥研發(fā)。E-mail：zhangxq15@163.com

#通信作者：高級(jí)工程師，博士。研究方向：中藥新藥研發(fā)。電話：025-87181862。E-mail：dingg2000@126.com

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2017.15.23