張 展，張 春，郭峭峰，馬茍平，沈立峰，俞華軍，林炳遠(yuǎn)，魯 寧，黃 凱

浙江省立同德醫(yī)院骨科，杭州 310012

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·論 著·

重構(gòu)Ⅰ型膠原聯(lián)合聚天冬氨酸在仿骨生物礦化中的應(yīng)用

張 展，張 春，郭峭峰，馬茍平，沈立峰，俞華軍，林炳遠(yuǎn)，魯 寧，黃 凱

浙江省立同德醫(yī)院骨科，杭州 310012

目的 重構(gòu)Ⅰ型膠原聯(lián)合聚天冬氨酸制備仿生物骨。方法 采用酸解方法將鼠尾Ⅰ型膠原蛋白分解成原膠原纖維，然后置于鈣磷礦化液中，在戊二醛交聯(lián)下，重構(gòu)組裝成膠原纖維，并將鈣磷晶體包裹在膠原纖維內(nèi)部進(jìn)行生物礦化。加入聚天冬氨酸，促進(jìn)羥基磷灰石鈣前體滲入膠原纖維內(nèi)部，模仿人體內(nèi)的骨生物礦化。礦化3 d和9 d，采用透射電子顯微鏡和電子衍射觀察骨生物礦化過(guò)程。結(jié)果 透射電子顯微鏡和電子衍射結(jié)果顯示，礦化3 d，羥基磷灰石鈣前體被包裹在膠原纖維內(nèi)部，膠原纖維部分礦化；礦化9 d，羥基磷灰石前體完全滲入膠原蛋白纖維內(nèi)部，其無(wú)定型磷酸鈣狀態(tài)最終轉(zhuǎn)變成羥基磷灰石晶體，從而模擬完成骨生物礦化，形成Ⅰ型膠原蛋白/羥基磷灰石鈣的仿生骨材料。結(jié)論 重構(gòu)Ⅰ型膠原聯(lián)合聚天冬氨酸可制備出與人類(lèi)自體骨組織化學(xué)成分和分子結(jié)構(gòu)接近的仿生骨材料。

Ⅰ型膠原；重構(gòu)；聚天冬氨酸；生物礦化

ActaAcadMedSin，2017,39(3)：318-323

隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，高速公路車(chē)禍、廠礦重大事故等高能量損傷導(dǎo)致的四肢粉碎性骨折越來(lái)越多，此類(lèi)患者往往伴隨骨缺損，選擇適當(dāng)?shù)墓切迯?fù)材料是治療骨缺損的中心環(huán)節(jié)，目前一般采用自體骨移植、同種異體骨移植、人工骨移植。由于自體骨移植和同種異體骨移植均來(lái)自人類(lèi)自身骨組織，數(shù)量有限。因此，為解決這一問(wèn)題，國(guó)內(nèi)外學(xué)者進(jìn)行了大量的骨組織工程學(xué)研究，期待通過(guò)人工骨替代人類(lèi)自體骨組織，如半水硫酸鈣、磷酸三鈣等多種骨陶瓷材料[1- 2]。然而，上述人工骨材料，無(wú)論是組織相容性，還是成骨生物活性，都比不上人類(lèi)自身骨組織。這是因?yàn)椋祟?lèi)自身天然骨組織是由有機(jī)大分子Ⅰ型膠原蛋白和無(wú)機(jī)礦物質(zhì)羥基磷灰石晶體生物礦化組成[3]。而上述人工骨材料無(wú)論化學(xué)成分，還是分子結(jié)構(gòu)，均與人類(lèi)自身天然骨組織相去甚遠(yuǎn)。所以，研發(fā)與人類(lèi)自體骨組織化學(xué)成分、分子結(jié)構(gòu)接近的骨移植材料顯得尤為重要。天然骨組織是以Ⅰ型膠原蛋白為模板，羥基磷灰石晶體沿著Ⅰ型原膠原纖維生物礦化而成[4]。但是，原膠原纖維之間的間隙非常狹小，相鄰平行排列纖維的間距只有0.24 nm[5]，羥基磷灰石晶體要鑲嵌入如此狹小的原膠原纖維間隙進(jìn)行礦化非常困難。本研究擬采用酸解方法將鼠尾肌腱分解成Ⅰ型原膠原纖維，將其置于鈣磷礦化液和交聯(lián)劑戊二醛中進(jìn)行交聯(lián)重構(gòu)和生物礦化，Ⅰ型原膠原纖維在重構(gòu)組裝成Ⅰ型膠原纖維的同時(shí)，將羥基磷灰石鈣前體包裹在重構(gòu)后的Ⅰ型膠原纖維內(nèi)部，并加入聚天冬氨酸，通過(guò)聚天冬氨酸促進(jìn)羥基磷灰石鈣前體再滲入膠原纖維內(nèi)部，模仿骨生物礦化，以期制備一種與人類(lèi)自體骨組織化學(xué)成分和分子結(jié)構(gòu)接近的仿生骨材料。

材料和方法

主要材料和試劑 鼠尾、鹽酸、1.67 mmol/L CaCl2溶液25 ml、9.5 mmol/L Na2HPO4溶液25 ml、400 mg/ml谷氨酸、0.05%戊二醛均購(gòu)自上海阿拉丁科技股份有限公司，10 mg/ml聚天冬氨酸[(C4H5NO3)N：相對(duì)分子質(zhì)量9 000～11 000]購(gòu)自成都艾科達(dá)化學(xué)試劑有限公司。

酸解鼠尾Ⅰ型膠原的制備和檢測(cè) 超凈臺(tái)操作取大鼠鼠尾洗凈，75%酒精浸泡5 min；剪開(kāi)，去掉皮毛，剪成小段，抽出銀色肌腱，置于平皿中，滅菌生理鹽水浸泡；在平皿中剪碎，按每克尾鍵50 ml比例加入0.1%醋酸溶液，搖晃，將尾腱分散于醋酸溶液中，4℃放置1周；4000 r/min(r=8 cm)離心20 min，在醋酸溶液的酸解下，尾腱可水解成膠凍狀凝膠。取酸解膠原蛋白上清液20 μl加入4 ml 6×SDS上樣緩沖液，95℃靜置5 min，取10 μl進(jìn)行SDS-PAGE電泳，檢測(cè)酸解鼠尾Ⅰ型膠原的相對(duì)分子質(zhì)量，并檢測(cè)膠原蛋白濃度。

Ⅰ型膠原重構(gòu)及檢測(cè) 吸取制備的Ⅰ型膠原10 μl至小培養(yǎng)皿中，滴入0.05%戊二醛2 ml至小培養(yǎng)皿中浸泡膠原進(jìn)行交聯(lián)，將小培養(yǎng)皿置于恒溫箱中靜置24 h。Ⅰ型膠原可在交聯(lián)劑戊二醛作用下進(jìn)行重構(gòu)，觀察其宏觀形態(tài)。

吸取制備的Ⅰ型膠原3 μl滴至鎳網(wǎng)上；在小培養(yǎng)皿中放置合適大小濾紙，用水濕透后，將滴上膠原的鎳網(wǎng)放置在濾紙上；吸取0.05%戊二醛0.5 ml滴至鎳網(wǎng)膠原上，蓋好蓋子，在恒溫箱中靜置24 h。接著將鎳網(wǎng)撈起，放在濾紙上干燥備用。然后將加載膠原的鎳網(wǎng)，經(jīng)去離子水、50%乙醇、100%乙醇依次漂洗后，放置在透射電子顯微鏡(transmission electron microscope，TEM)下觀察。

仿生骨生物礦化

鈣磷礦化液的配制：取1.67 mmol/L CaCl2溶液5 ml倒入玻璃瓶中，滴加10 mg/ml聚天冬氨酸0.25 ml，再滴加400 mg/ml谷氨酸0.25 ml，然后緩慢倒入9.5 mmol/L Na2HPO4溶液5 ml，形成鈣磷低過(guò)飽和溶液，pH值8.5。

膠原纖維重構(gòu)和生物礦化：取原膠原纖維10 μl浸泡在10 ml鈣磷礦化液中，隨后滴入0.05%戊二醛2 ml進(jìn)行膠原纖維重構(gòu)同時(shí)進(jìn)行生物礦化。每隔3 d換液1次，每次都先將舊的礦化液吸出，然后倒入新配置的礦化液。分別靜置3、9 d，使重構(gòu)膠原蛋白生物礦化，然后觀察其宏觀形態(tài)。

TEM觀測(cè)和電子衍射：吸取3 μl膠原滴至鎳網(wǎng)上，將加載膠原的鎳網(wǎng)懸浮在10 ml礦化液上，然后滴入0.05%戊二醛2 ml。每隔3 d換液1次，每次都先將舊的礦化液吸出，然后倒入新配置的礦化液。分別靜置3、9 d，采用TEM觀測(cè)鎳網(wǎng)上的礦化膠原并進(jìn)行電子衍射。

結(jié) 果

鼠尾Ⅰ型膠原制備情況 鼠尾肌腱在醋酸溶液酸解下，腱性組織被水解成膠凍狀溶液，分解為鼠尾Ⅰ型原膠原蛋白纖維。SDS-PAGE電泳檢測(cè)結(jié)果顯示，Ⅰ型原膠原蛋白纖維的相對(duì)分子質(zhì)量在130 000～200 000間。膠原蛋白濃度為2.0 mg/ml，pH值為5。

原膠原纖維的重構(gòu)情況 將酸解鼠尾Ⅰ型原膠原纖維進(jìn)行重構(gòu)組裝，原膠原纖維重構(gòu)成Ⅰ型膠原蛋白纖維，宏觀表現(xiàn)為半透明果凍樣膠體，具有一定生物力學(xué)強(qiáng)度，可用鑷子夾起(圖1)。將鎳網(wǎng)上的重構(gòu)膠原經(jīng)乙酰雙氧鈾染色30 s，TEM下可見(jiàn)Ⅰ型原膠原纖維重構(gòu)成的膠原纖維具有特征性明暗間隔周期性條紋結(jié)構(gòu)，即D-Bank結(jié)構(gòu)(圖2)。

圖 1 Ⅰ型原膠原纖維重構(gòu)成膠原纖維，形成半透明果凍樣膠體

Fig 1 Type Ⅰ collagen fibers constitute the collagen fibers，forming a translucent jelly-like gel

生物礦化情況

生物礦化3 d：膠體顏色逐漸加深至乳白色(圖3)。鎳網(wǎng)上的重構(gòu)膠原礦化3 d后，TEM下可見(jiàn)Ⅰ型膠原纖維的明暗相隔周期性條紋結(jié)構(gòu)，逐漸模糊；羥基磷灰石鈣前體包裹在膠原纖維內(nèi)部，膠原纖維部分礦化，羥基磷灰石鈣晶核沿著膠原纖維礦化生長(zhǎng)，鼠尾Ⅰ型膠原蛋白纖維忖度變深(圖4)。電子衍射圖結(jié)果顯示，礦化早期，膠原纖維內(nèi)部有磷酸鈣納米顆粒，從圖中衍射環(huán)判斷主要是無(wú)定型態(tài)(圖5)。

TEM：透射電子顯微鏡

TEM：transmission electron microscope

圖 2 TEM下可見(jiàn)，Ⅰ型膠原蛋白重構(gòu)成膠原纖維，重構(gòu)后的膠原纖維具有特征性D-Bank結(jié)構(gòu)(×25 000)

Fig 2 TEM shows that typeⅠcollagen fibers constitute the collagen fibers with typical D-Bank structure(×25 000)

圖 3 礦化3 d后，膠體呈微白色

Fig 3 Three days after mineralization，the colloid was slightly white

圖 4 TEM下可見(jiàn)Ⅰ型膠原纖維的D-Bank結(jié)構(gòu)模糊，忖度變深，部分礦化(×10 000)

Fig 4 TEM displays that the type Ⅰ collagen fiber has fuzzy structure and deeper contrast，along with partial mineralization(×10 000)

圖 5 礦化早期，磷酸鈣納米顆粒包裹在膠原纖維內(nèi)部，從圖中衍射環(huán)判斷主要是無(wú)定型態(tài)

Fig 5 In the early stage of mineralization，calcium phosphate nanoparticles were encapsulated in the inner side of the collagen fiber，the diffraction ring in the graph is mainly in the amorphous state

生物礦化9 d：膠體顏色加深至乳白色(圖6)。鎳網(wǎng)上的重構(gòu)膠原礦化9 d后，TEM下可見(jiàn)Ⅰ型膠原纖維的明暗相隔D-Bank結(jié)構(gòu)完全消失，鼠尾膠原蛋白纖維內(nèi)部可見(jiàn)黑色羥基磷灰石晶體，嵌入膠原纖維縱向生長(zhǎng)。當(dāng)鼠尾Ⅰ型膠原纖維完全礦化時(shí)，由于整條膠原蛋白纖維都被羥基磷灰石晶體占據(jù)，膠原纖維呈現(xiàn)黑色(圖7)。電子衍射圖像結(jié)果顯示，膠原礦化已經(jīng)完成。強(qiáng)的衍射環(huán)提示，羥基磷灰石鈣前體已經(jīng)全部從無(wú)定型轉(zhuǎn)化為結(jié)晶態(tài)，每個(gè)亮環(huán)對(duì)應(yīng)1個(gè)晶面，依次是002、211、004(圖8)。

圖 6 膠原纖維礦化9 d后，顏色加深至乳白色

Fig 6 After 9 days of mineralization，the color is deepened to milky white

A. 礦化膠原放大20k倍的TEM圖像；B. 礦化膠原放大80k倍的TEM圖像

A. mineralized collagen (×20 000)；B. mineralized collagen (×80 000)

圖 7 TEM下可見(jiàn)Ⅰ型膠原纖維的 D-Bank結(jié)構(gòu)完全消失，羥基磷灰石晶體嵌入膠原蛋白纖維內(nèi)部縱向生長(zhǎng)，忖度加深至黑色

Fig 7 TEM reveals that the D-Bank structure of typeⅠcollagen fibers completely disappeared，the hydroxyapatite crystals were embedded into the collagen fibers and showed longitudinal growth，and the contrast became black

圖 8 膠原的選區(qū)電子衍射圖像顯示，礦化9 d后，膠原礦化已經(jīng)完成；強(qiáng)衍射環(huán)結(jié)果顯示，磷酸鈣礦物已經(jīng)從無(wú)定型轉(zhuǎn)化為結(jié)晶態(tài)，每個(gè)亮環(huán)對(duì)應(yīng)1個(gè)晶面，依次是002、211、004

Fig 8 Selected area of the electron diffraction pattern of collagen reveals that：after 9 days of mineralization，the collagen mineralization was the strong diffraction ring shows that the amorphous calcium phosphate mineral has been transformed into crystalline state；each bright ring corresponds to one crystal plane，which is 002，211，and 004，respectively

討 論

從天然骨組織的生物多級(jí)結(jié)構(gòu)來(lái)看，它由Ⅰ型膠原蛋白和羥基磷灰石晶體生物礦化而成，其中Ⅰ型膠原蛋白最基本的單位為原膠原纖維，每條原膠原纖維是由3條α多肽鏈組成，相對(duì)分子質(zhì)量為100 000～300 000，每5條原膠原纖維平行排列，組裝成1根膠原微纖維，長(zhǎng)300 nm，寬1.1 nm。在同一水平面上，每2條原膠原纖維首尾相接，首尾之間間距40 nm，形成了膠原纖維的空腔區(qū)；而上下每2條原膠原纖維錯(cuò)位1/4.5分子長(zhǎng)度，其原膠原纖維重疊的區(qū)域形成了重疊區(qū)，長(zhǎng)度約27 nm，從而形成67 nm具有周期性橫紋的膠原微纖維[6- 7]；在重疊區(qū)，相鄰的兩條平行排列原膠原纖維的間距非常小，只有0.24 nm。

增加原膠原纖維間空隙最直接的方法是打開(kāi)原膠原纖維間的化學(xué)鍵聯(lián)系，將膠原微纖維水解成原膠原纖維。在這種水解狀態(tài)下，原膠原纖維間沒(méi)有空間限制，鈣磷礦化液可以肆意地在原膠原纖維上形成羥基磷灰石晶體的晶核。然后再重構(gòu)膠原蛋白，原膠原纖維一邊組裝成膠原微纖維，一邊將羥基磷灰石晶體前體以及晶核包裹在膠原纖維間隙。接著再進(jìn)行礦化，羥基磷灰石晶體就能在膠原纖維內(nèi)充分生長(zhǎng)。但是打開(kāi)原膠原纖維間的化學(xué)鍵聯(lián)系時(shí)，一定要在保持膠原分子三螺旋結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的前提下進(jìn)行；因?yàn)橹挥芯哂腥菪€(wěn)定結(jié)構(gòu)的膠原蛋白分子，才可以通過(guò)其α1鏈在N末端肽的第9位置處的醛基與相鄰α2鏈的第930位置處的羥賴(lài)氨酸殘基形成Aldol醇醛鍵[9]，從而重疊組裝成Ⅰ型膠原蛋白纖維。故本研究采取的方法是酸解膠原，利用低濃度酸性條件分解膠原分子間的希夫堿鍵和鹽鍵，將失去交聯(lián)的原膠原纖維溶解出來(lái)提取膠原[10]。因?yàn)榇姿峥伤饽z原分子間的希夫堿鍵和鹽鍵，而且不會(huì)破壞Ⅰ型膠原分子的三螺旋結(jié)構(gòu)，可保持Ⅰ型膠原分子的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。只要Ⅰ型膠原分子的三螺旋結(jié)構(gòu)仍然存在，原膠原纖維分子經(jīng)過(guò)重構(gòu)組裝，仍然可以組裝成膠原纖維。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)酸解提取的鼠尾Ⅰ型膠原蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量在130 000～200 000間，而具有三螺旋結(jié)構(gòu)的Ⅰ型膠原蛋白相對(duì)分子質(zhì)量也在100 000～300 000間，提示本研究酸解的Ⅰ型膠原是符合具有三螺旋結(jié)構(gòu)的Ⅰ型膠原蛋白。此外，TEM下可見(jiàn)經(jīng)過(guò)重構(gòu)組裝后的酸解Ⅰ型膠原所形成的膠原纖維具有膠原蛋白纖維所特有的D-Bank結(jié)構(gòu)，也從另一個(gè)角度證實(shí)酸解鼠尾Ⅰ型膠原不影響膠原分子的三螺旋結(jié)構(gòu)，保持了分子結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，所以膠原蛋白分子可以重構(gòu)成Ⅰ型膠原特有的D-Bank結(jié)構(gòu)纖維。

本研究將鼠尾Ⅰ型膠原酸解成原膠原纖維分子后，置于鈣磷礦化液中，然后加入戊二醛交聯(lián)進(jìn)行生物礦化，結(jié)果顯示，在礦化早期，TEM下可見(jiàn)羥基磷灰石鈣前體被包裹在膠原纖維內(nèi)部，膠原纖維部分礦化，羥基磷灰石鈣晶核沿著膠原纖維礦化生長(zhǎng)，鼠尾Ⅰ型膠原蛋白纖維忖度變深，膠體的顏色逐漸加深至乳白色。由于在游離的原膠原纖維分子重構(gòu)組裝成膠原纖維時(shí)，隨著原膠原纖維分子間的間隙變小，部分羥基磷灰石前體可被擠出膠原纖維內(nèi)部。因此為使羥基磷灰石能夠充分礦化到膠原纖維內(nèi)部，本研究還在鈣磷礦化液中加入高分子聚合物聚天冬氨酸。根據(jù)聚合物誘導(dǎo)液晶前體理論，羥基磷灰石晶體最初并不是以固體形成，而是先在膠原蛋白纖維表面形成羥基磷灰石前體，即無(wú)定型磷酸鈣(amorphous-calciumphosphate，ACP)。而聚天冬氨酸則可以將ACP穩(wěn)定在飽含水分子的無(wú)定型狀態(tài)，由于ACP含有大量水分子，以至于其無(wú)定型狀態(tài)類(lèi)似液晶態(tài)。類(lèi)液晶態(tài)的ACP能通過(guò)毛細(xì)管作用，滲入至膠原纖維內(nèi)部，轉(zhuǎn)化為沿膠原纖維長(zhǎng)軸平行排列的羥基磷灰石晶體[11]。Beniash等[12]通過(guò)拉曼光譜也證實(shí)，在小鼠牙釉質(zhì)的生物礦化過(guò)程中存在著磷酸鈣晶體的前體，即ACP狀態(tài)。同樣，在小鼠顱骨和長(zhǎng)骨生物礦化過(guò)程中，也發(fā)現(xiàn)了ACP；即在骨生長(zhǎng)過(guò)程中，成骨細(xì)胞先釋放出ACP，ACP再透入膠原內(nèi)部，然后轉(zhuǎn)化為羥基磷灰石[13]。所以本研究就是通過(guò)加入聚天冬氨酸化模仿了天然骨組織的生物礦化。

本研究TEM和電子衍射結(jié)果顯示，在剛開(kāi)始礦化3 d時(shí)，膠原纖維是部分礦化的，磷酸鈣礦物以無(wú)定型狀態(tài)存在。隨著時(shí)間推移，生物礦化繼續(xù)深入，ACP礦物持續(xù)滲入膠原纖維內(nèi)部；當(dāng)膠原礦化到第9天時(shí)，膠原纖維基本已全部礦化，ACP已經(jīng)轉(zhuǎn)化為羥基磷灰石晶體。而羥基磷灰石晶體與膠原纖維之間的生物礦化結(jié)合，正是仿生了人類(lèi)自身骨組織的化學(xué)成分和分子結(jié)構(gòu)。

綜上，本研究通過(guò)酸解鼠尾膠原，在保證其三螺旋結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的情況下，打開(kāi)原膠原纖維之間的分子間隙；一邊將原膠原纖維重構(gòu)組裝成Ⅰ型膠原蛋白，一邊將鈣磷晶核包裹在膠原內(nèi)部生物礦化。而且通過(guò)加入聚天冬氨酸，將羥基磷灰石晶體穩(wěn)定在ACP鈣狀態(tài)，滲入膠原纖維間隙內(nèi)部，模擬了人體內(nèi)骨生物礦化，最后形成Ⅰ型膠原蛋白/羥基磷灰石仿生骨材料。由于此仿生骨材料在化學(xué)成分和分子結(jié)構(gòu)接近天然骨組織，有望取代自體骨移植，為其在臨床上進(jìn)一步應(yīng)用研究打下基礎(chǔ)。

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Application of Recombinant Collagen Type Ⅰ Combined with PolyasparticAcid in Biomimetic Biomineralization

ZHANG Zhan，ZHANG Chun，GUO Qiaofeng，MA Gouping，SHEN Lifeng，YU Huajun，LIN Bingyuan，LU Ning，HUANG Kai

Department of Orthopedics，Tongde Hospital of Zhejiang Province，Hangzhou 310012，ChinaCorresponding author：GUO Qiaofeng Tel：0571- 89972356，E-mail：hzgqf@hotmail.com

Objective To prepare biomimetic bone material by reconstructing type Ⅰ collagen combined with polyaspartic acid. Methods By acid hydrolysis，rat tail type Ⅰ collagen was decomposed into collagen fibers，which were then placed in the calcium phosphate mineralization solution. Under the cross-linking of glutaraldehyde，the collagen fibers were reconstructed and assembled into collagen fibers，and the calcium phosphate crystals were wrapped in the inner side of the collagen fibers for biomineralizationin. After poly aspartate acid was added，calcium hydroxyapatite calcium precursor was added into the collagen fibers to simulate thebiomimetic biomineralizationin the human body. After mineralization for 3- 9 days，the bone mineralization process was observed by transmission electron microscopy and electron diffraction. Results Transmission electron microscopy and electron diffraction displayed that，after 3 days of mineralization，calcium hydroxyapatite precursor was wrapped in the collagen fiber gap，and the collagen fiber was partially mineralized. After 9 days of mineralization，calcium hydroxyapatite precursor completely infiltrated into the collagen fiber，and the amorphous calcium phosphate was transformed into hydroxyapatite calcium crystal. Thus，the simulation of bone mineralization was completed，and collagen type Ⅰ collagen/hydroxyapatite calcium biomimetic bone material was formed. Conclusion Reconstruction of type Ⅰ collagen combined with polyaspartic acid can prepare biomimetic bone material that has close chemical composition and molecular structure to the human bone tissue.

typeⅠcollagen；reconstruction；polyaspartic acid；biomineralization

浙江省科技廳院所專(zhuān)項(xiàng)基金項(xiàng)目(2013F50006)、浙江省科技廳公益技術(shù)研究社會(huì)發(fā)展項(xiàng)目(2014C33207)和浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科技計(jì)劃項(xiàng)目(2014KYA030) Supported by the Special Fund of the Science and Technology Department of Zhejiang Province (2013F50006)，the Public Welfare Project of the Science and Technology Department of Zhejiang Province (2014C33207)，and the Medical and Health Science and Technology Program of Zhejiang Province (2014KYA030)

郭峭峰 電話(huà)：0571- 89972356，電子郵件：hzgqf@hotmail.com

R318.08

A

1000- 503X(2017)03- 0318- 06

10.3881/j.issn.1000- 503X.2017.03.004

2016- 11- 21)