楊 微，許 琪

中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所 北京協(xié)和醫(yī)學院基礎學院 生物化學與分子生物學系醫(yī)學分子生物學國家重點實驗室，北京 100005

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·論 著·

Dysbindin- 1B+/+小鼠海馬凋亡及認知功能

楊 微，許 琪

中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所 北京協(xié)和醫(yī)學院基礎學院 生物化學與分子生物學系醫(yī)學分子生物學國家重點實驗室，北京 100005

目的 觀察人源特異性表達dysbindin- 1B+/+(dys1B)小鼠的組織學及行為學表現(xiàn)。方法 建立dys1B轉(zhuǎn)基因小鼠，采用TUNEL法檢測野生型(WT)和dys1B小鼠海馬腦區(qū)凋亡情況，并在電鏡下觀察WT和dys1B小鼠海馬區(qū)的凋亡情況，曠場實驗和T迷宮實驗觀測小鼠在新環(huán)境中的自主活動能力、焦慮程度及空間記憶能力。結果 dys1B小鼠海馬區(qū)神經(jīng)元凋亡率明顯高于WT小鼠(t=12.98，P<0.0001)，且在電鏡下有凋亡中期和晚期表現(xiàn)。曠場實驗結果顯示，dys1B小鼠的總運動距離為(2887±376)cm，明顯低于WT小鼠的(3632±606)cm(t=2.993，P=0.0122)；中心活動時間為(64.22±14.67)s，明顯少于WT小鼠的(114.00±34.09)s(t=4.649，P=0.0023)。T迷宮實驗結果顯示，forced run與test run間隔60和180 s時，dys1B小鼠的正確率分別為(70.40±15.17)%和(59.28±9.10)%，明顯低于WT小鼠的(91.67±13.94)%(t=3.261，P=0.0258)和(83.33±14.89)%(t=3.687，P=0.0291)；間隔15 s時，dys1B小鼠和WT小鼠的正確率差異無統(tǒng)計學意義[100%比(94.45±6.08)%；t=0.851，P=0.0756]。結論 dys1B表達可引起小鼠海馬區(qū)細胞凋亡并可導致自主活動能力降低，焦慮程度增加，空間記憶能力障礙。

dysbindin- 1；細胞凋亡；自主活動；焦慮程度；認知障礙

ActaAcadMedSin，2017,39(3)：307-311

精神分裂癥是一組病因未明的重性精神疾病，多在青壯年緩慢或亞急性起病，終身患病率約為1%。小肌營養(yǎng)蛋白結合蛋白(dystrobrevin-binding protein 1，DTNBP1)是精神分裂癥主要的易感基因之一[1]，其編碼的dysbindin- 1在人體內(nèi)存在dysbindin- 1A、1B、1C 3種異構體[2]。研究表明，偏執(zhí)型精神分裂癥患者DTNBP- 1b mRNA表達升高且聚集于核旁形成aggresome樣結構[3]，提示dysbindin- 1B聚集體可能造成神經(jīng)元損傷，形成特定的病理特征，最終參與精神分裂癥的陰性癥狀、陽性癥狀和認知功能障礙的形成。本研究觀察了人源特異性表達的dysbindin-1B+/+(dys1B)小鼠海馬區(qū)的凋亡情況及其行為表現(xiàn)。

材料和方法

dysbindin- 1B+/+轉(zhuǎn)基因小鼠模型的建立和取材 dysbindin- 1B+/-轉(zhuǎn)基因小鼠由北京百奧賽圖基因生物技術有限公司建立。利用得到的dysbindin- 1B+/-轉(zhuǎn)基因小鼠和Cre小鼠進行交配，獲得全基因敲除的雜合子小鼠，再由敲除雜合子小鼠互交得到敲除純合子dys1B小鼠。所得新生小鼠1周內(nèi)剪鼠尾進行PCR，鑒定轉(zhuǎn)基因動物的基因表型，保留陽性小鼠。野生型(wild type，WT)基因PCR 產(chǎn)物長169 bp，dysbindin- 1B基因PCR 產(chǎn)物長209 bp。同窩生4月齡WT小鼠12只、dys1B小鼠12只(北京協(xié)和醫(yī)學院實驗動物中心)，24 h明暗各半條件飼養(yǎng)，取海馬組織塊并制作海馬區(qū)石蠟切片。

TUNEL凋亡檢測 采用TUNEL BrightGreen試劑盒(萬類生物科技有限公司)，用PBS稀釋蛋白酶K至20 μg/ml，加至脫蠟入水后的樣品片上室溫放置20 min。室溫下PBS洗樣品片3次，每次3 min，樣品片上加TdT標記緩沖液20 μl/片，37℃于濕盒中標記60 min；PBS洗3次，每次3 min；DAPI染核，常規(guī)封片，鏡檢。

電鏡觀察 采用1 ml戊二醛灌流小鼠，在4℃下取出海馬組織塊于多聚甲醛-戊二醛固定液中固定24 h，用pH 7.3 0.1 mol/L PBS 緩沖液沖洗并過夜，逐級緩慢脫水，Epon812 浸透和包埋，超薄切片，醋酸鈾(鉛)雙染色，TEM- 1400plus透射電鏡(日本電子株式會社)觀察。

曠場實驗 觀察小鼠在新環(huán)境中的自主活動能力和焦慮程度。將小鼠置于開口的白色盒子(內(nèi)部場地大小為81 cm×81 cm，高28 cm)。盒底漆成縱橫各3條黑線(寬3 mm)，從而形成16個等大的方格(每格大小20 cm×20 cm)。照明來自一高出場地中央2.80 m 的40 W白熾燈，于安靜環(huán)境下進行實驗。每只小鼠接受1次測試，將小鼠面朝墻放入4個拐角方格之一，讓其自由探索環(huán)境5 min。每只小鼠測試結束后，濕布洗擦場地并用干布擦干。采用SMART數(shù)據(jù)自動采集和處理系統(tǒng)，記錄小鼠運動總路程、中間場時間、跨越方格總數(shù)和站立次數(shù)。

T迷宮 訓練前2 d，撫摸小鼠并將其放入T迷宮適應5 min，在迷宮兩臂碗里放入食物，待小鼠取食完畢后將其取出。訓練實驗：每個實驗包括Forced run和Test run兩部分。Forced run：任意選擇T迷宮的一臂，用木閘門將之關閉，小鼠只能進入一臂獲取食物。取食完畢，立即取出，用酒精清洗去除氣味。15 s后，撤去所有的閘門。Test run：兩臂全部打開，將小鼠放入開始臂中，若小鼠選擇未曾進入的臂，為正確選擇，給予食物獎勵；若重復進入相同的臂，則為錯誤選擇，不給予食物。每只動物每天進行8次實驗(上午4次，下午4次)，每次間隔15 min，連續(xù)2 d，分別計算每天每組小鼠的正確率。當平均正確率都達到85%以上，訓練階段結束。測試實驗：設置Forced run和Test run之間的時間間隔為15、60、180 s，分別計算每組小鼠的正確率。

統(tǒng)計學處理 采用Graphpad Prism 5.0統(tǒng)計軟件，所有結果以均數(shù)±標準誤表示，先進行方差齊性檢驗；若P<0.05，則進行Welch’s檢驗，若P>0.05，則進行雙尾非配對t檢驗；組間不同時間變化情況的比較采用Two-way ANOVA分析。

結 果

dys1B小鼠基因表型的鑒定 WT基因PCR 產(chǎn)物長169 bp，dysbindin- 1B基因PCR 產(chǎn)物長209 bp(圖1)。

dys1B小鼠海馬區(qū)出現(xiàn)凋亡 TUNEL+細胞的核呈綠色，形態(tài)呈碎點狀、不規(guī)整、大小不一。在WT小鼠海馬區(qū)未見TUNEL+神經(jīng)元，dys1B小鼠海馬則可見較多TUNEL+細胞，主要分布在齒狀回(dentate gyrus，DG)區(qū)(圖2A)。dys1B小鼠海馬區(qū)神經(jīng)元凋亡率明顯高于WT小鼠(t=12.98，P<0.0001)(圖2B)。透射電鏡下可見WT小鼠海馬區(qū)存在典型突觸結構，細胞結構正常。細胞核形態(tài)規(guī)則，染色質(zhì)均勻分布，細胞器豐富。粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分布規(guī)則，網(wǎng)腔均勻一致。線粒體發(fā)達，排列密集(圖2C)；dys1B小鼠海馬神經(jīng)元細胞則出現(xiàn)不同程度的凋亡改變。核膜變薄并輕度下陷，核內(nèi)染色體分布不均、顆?；?、凝集成塊并呈半月形。線粒體腫脹，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)網(wǎng)腔不規(guī)則，核糖核蛋白體脫顆粒。高爾基器形態(tài)不規(guī)則，腫脹，極性消失(圖2D)。核呈固縮性改變，染色質(zhì)凝集成塊，邊集；還可見核碎裂，形成凋亡小體(圖2E)。

1：轉(zhuǎn)基因雜合小鼠; 2：DL2000 marker; 3～14：dys1B轉(zhuǎn)基因純合小鼠

1：dys1B heterozygous mouse; 2：DNA molecular weight marker DL2000; 3- 14：homozygous mice

圖 1 PCR 鑒定dys1B轉(zhuǎn)基因動物的凝膠電泳分析

Fig 1 Gel electrophoresis for the identification of dys1B transgenic mice by PCR

dys1B小鼠的曠場行為變化 曠場實驗結果顯示，dys1B小鼠的總運動距離為(2887±376)cm，明顯低于WT小鼠的(3632±606)cm(t=2.993，P=0.0122)；中心活動時間為(64.22±14.67)s，明顯少于WT小鼠的(114.00±34.09)s(t=4.649，P=0.0023)；dys1B小鼠和WT小鼠在跨格次數(shù)[(210.00±23.14)次比(214.80±19.61)次；t=0.4388，P=0.6724]及站立次數(shù)[(52.67±17.75)次比(66.92±16.6)次；t=1.655，P=0.124]方面差異均無統(tǒng)計學意義；兩組小鼠的運動軌跡見圖3。

dys1B小鼠認知功能變化 T迷宮實驗結果顯示，F(xiàn)orced run與Test run間隔60和180 s時，dys1B小鼠的正確率分別為(70.40±15.17)%和(59.28±9.10)%，明顯低于WT小鼠的(91.67±13.94)%(t=3.261，P=0.0258)和(83.33±14.89)%(t=3.687，P=0.0291)；間隔15 s時，dys1B小鼠和WT小鼠的正確率差異無統(tǒng)計學意義[100%比(94.45±6.08)%；t=0.851，P=0.0756]。

討 論

蛋白合成與降解的不平衡可導致大量蛋白形成不可溶的聚集體，而聚集體的形成與傳播又會直接或間接對神經(jīng)元的正常功能造成損傷。精神分裂癥作為一種慢性精神疾病，由于未找到明確的病理診斷[4]，并不屬于典型的神經(jīng)退行性疾病。但仍有很多研究者致力于精神分裂癥神經(jīng)病理的研究，其方向主要集中在精神分裂癥斷裂基因1(disrupted in schizophrenia 1，DISC1)和dysbindin- 1。

DISC1是精神分裂癥最重要的易感基因之一。研究表明，在部分具有精神分裂癥表型的尸檢腦組織樣品中可檢測到顯著不溶的DISC1聚集體[5- 7]。此外，在部分慢性精神疾病患者尸檢腦組織中，研究者發(fā)現(xiàn)DISC1與dysbindin- 1共同存在于不可溶的沉淀中[5]。

DTNBP1位于人類染色體6p22.3，主要有DTNBP1a、1b、1c 3種選擇性剪接體，分別編碼蛋白dysbindin- 1A[8]、- 1B[3，9]、- 1C[10]。有研究報道，偏執(zhí)型精神分裂癥患者的外周血中DTNBP1b的表達顯著升高，而對單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide poly-morphism，SNP)篩查發(fā)現(xiàn)，rs117610176的C位點使DTNBP1b表達升高，且編碼的dysbindin- 1B有聚集成aggresome的傾向[3]。提示對于有該SNP的精神分裂癥患者，高表達的dysbindin- 1B有可能形成特定的神經(jīng)病理。因此，本研究觀察了dysbindin- 1B高表達對于小鼠海馬神經(jīng)元及行為的影響。結果顯示，在dys1B小鼠的海馬中，高表達的dysbindin- 1B可造成海馬區(qū)神經(jīng)元的凋亡，以DG區(qū)最為顯著。在透射電鏡下可觀察到處于凋亡中期和晚期的神經(jīng)元。行為學研究則發(fā)現(xiàn)，與WT小鼠相比，dys1B小鼠表現(xiàn)出自主活動能力降低、焦慮程度增加和記憶能力減退。

CA：安蒙角；DG：齒狀回；a：t=12.98，P<0.0001

CA：cornu ammonis；DG：dentate gyrus；a：t=12.98，P<0.0001

A.WT小鼠海馬區(qū)未見凋亡細胞，dys1B小鼠海馬區(qū)出現(xiàn)大量TUNEL+細胞；B.dys1B小鼠海馬區(qū)神經(jīng)元凋亡率明顯高于WT小鼠；C.WT小鼠海馬神經(jīng)元可見較典型突觸結構(箭頭)；D. dys1B小鼠海馬神經(jīng)元可見細胞凋亡中期的形態(tài)學改變(箭頭)；E. dys1B小鼠海馬神經(jīng)元可見較典型凋亡小體結構(箭頭)

A.while there is no TUNEL+cell in hippocampus of WT mice，a large number of TUNEL+cells are seen in hippocampus of dys1B mice; B.the proportion of the apoptosis cells in hippocampus of dys1B mice is larger than that in hippocampus of WT mice; C.normal synaptic junction of hippocampus of WT mice (arrow)；D.middle-stage apoptotic changes of hippocampus of dys1B mice (arrow); E.late-stage apoptotic changes of hippocampus of dys1B mice (arrow)

圖 2 Dysbindin- 1B表達導致海馬區(qū)細胞凋亡

Fig 2 Dysbindin- 1B expression induces apoptosis in hippocampus

圖 3 兩組小鼠曠場實驗的運動軌跡

Fig 3 Movement track of WT and dys1B mice in open field

目前很多研究表明，海馬參與了情緒、焦慮行為以及初級認知功能，且功能的區(qū)分與形態(tài)結構上腹側海馬和背側海馬的分區(qū)有關。腹側海馬被認為參與情緒及焦慮行為的控制，而背側海馬被認為參與初級認知功能[11]。本研究結果發(fā)現(xiàn)，dys1B小鼠無論腹側海馬還是背側海馬都有較多TUNEL+細胞，說明整個海馬區(qū)域都有損傷，以DG區(qū)最為嚴重，這提示相較于WT小鼠，dys1B小鼠可能有明顯的情緒異常及初級認知功能損傷。因此，本研究又采用曠場實驗和T迷宮實驗來檢測dys1B的行為。在曠場實驗中，dys1B小鼠表現(xiàn)出總運動距離降低，中心活動時間減少，而跨格次數(shù)及站立次數(shù)無明顯變化。由于跨格次數(shù)以及站立次數(shù)無明顯變化，說明dys1B小鼠同WT小鼠一樣具有較好的適應性。通常小鼠喜歡在較暗的地方活動，而dys1B小鼠較WT小鼠中心活動時間減少可表明dys1B小鼠自主活動能力降低。在跨格次數(shù)無明顯差異的情況下，dys1B小鼠總運動距離顯著降低，提示dys1B小鼠焦慮程度增加，推測這可能由于dysbindin- 1B+/+損傷腹側海馬神經(jīng)元，導致腹側海馬神經(jīng)遞質(zhì)轉(zhuǎn)運異常所致[12]。而T迷宮實驗結果則表明，dys1B小鼠空間記憶能力降低。

綜上，本研究結果顯示，與WT小鼠相比，dys1B小鼠海馬區(qū)出現(xiàn)顯著凋亡，且具有行為表型，表現(xiàn)為自主活動能力下降，焦慮程度增加以及認知功能障礙，提示海馬區(qū)凋亡可能作為特定的精神分裂癥患者的病理表現(xiàn)協(xié)助診斷。

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Hippocampal Apoptosis and Cognitive Function in Dysbindin- 1B+/+Mice

YANG Wei，XU Qi

State Key Laboratory of Medical Molecular Biology，Department of Biochemistry and Molecular Biology，Institute of Basic Medical Sciences，CAMS and PUMC，Beijing 100005，ChinaCorresponding author：XU Qi Tel：010- 69156432，E-mail：xuqi@pumc.edu.cn

Objective To explore the apoptosis in the hippocampus of dysbindin- 1B+/+mice and the behaviors of 4-month-old dysbindin- 1B+/+mice and wild-type mice. Methods The hippocampus of dysbindin- 1B+/+mice and corresponding wild-type mice were assessed by TUNEL assay and transmission electron microscopy. Then twelve 4-month-old male dysbindin- 1B+/+mice and twelve wild-type mice were enrolled. The open field and T maze test were conducted to observe locomotor activity，exploratory behaviors，and spatial memory. Result TUNEL+neurons were found in hippocampus of dysbindin- 1B+/+mice，especially in dentate gyrus region，but not in that of wild-type mice(t=12.98，P<0.0001). Transmission electron microscopy showed the presence of middle-and late-stage apoptosis in the hippocampus of dysbindin- 1B+/+mice，while there was no apoptosis in wild-type mice. Open field test showed that，compared with the moving distance of wild-type mice [(3632±606)cm]，dysbindin- 1B+/+mice presented significantly lower moving distances [(2887±376)cm] (t=2.993，P=0.0122). Meanwhile，compared with the moving time of wild-type mice in the central area [(114.00±34.09)s]，dysbindin- 1B+/+mice presented lower moving time [(64.22±14.67)s] (t=4.649，P=0.0023). T maze test showed that when the interval between forced run and test run were 60 s and 180 s，respectively，the accuracy of dysbindin- 1B+/+was (70.40±15.17)% and (59.28±9.10)%，which was significantly lower than those of wild type mice (91.67±13.94)% (t=3.261，P=0.0258) and (83.33±14.89)% (t=3.687，P=0.0291)；when the interval was 15 s，there was no significant difference between these two groups [100%vs.(94.45±6.08)%;t=0.851，P=0.0756]. Conclusion Dysbindin- 1B+/+expression can cause the apoptosis of neurons，which may cause anxious behavior and impair the locomotor activity and spatial memory.

dysbindin- 1; apoptosis; locomotor activity; exploratory behavior; cognition impairment

國家重點基礎研究發(fā)展計劃項目(973計劃)(2013CB531301、2012CB517902) Supported by the National Basic Research Program of China (973 Program)(2013CB531301，2012CB517902)

許 琪 電話：010- 69156432，電子郵件：xuqi@pumc.edu.cn

R361；R749.3

A

1000- 503X(2017)03- 0307- 05

10.3881/j.issn.1000- 503X.2017.03.002

2016- 01- 29)