劉 敏， 陸偉躍， 潘 俊， 謝 操

(復旦大學 藥學院，上海 201203)

凝膠過濾層析法調節(jié)脂質體內外水相pH的探討

劉 敏， 陸偉躍， 潘 俊， 謝 操

(復旦大學 藥學院，上海 201203)

通過對脂質體內外水相pH梯度的制備方法的探討，采用凝膠過濾層析技術將脂質體外水相的pH4.0檸檬酸緩沖液替換成pH 7.2磷酸鹽緩沖液，在脂質體內外水相形成pH梯度。在藥脂比為1∶5、1∶10、1∶15和1∶20(質量比)時，阿霉素在pH梯度的驅動下從脂質體外水相穿越脂質雙分子膜進入內水相，包封率分別達到96.7%、98.7%、96.8%和95.1%，其中藥脂比1∶10時包封率達到最高。藥脂比1∶10制備的阿霉素脂質體在37 ℃，12 h內阿霉素泄漏均低于1.0%；48 h內藥物泄露率低于5.0%。通過該實驗，使學生們能夠觀測到如何采用凝膠過濾層析技術調節(jié)pH梯度，以及pH梯度在阿霉素脂質體主動載藥過程中的重要性，為脂質體遞釋系統(tǒng)的課堂理論教學奠定了良好的實驗基礎。

凝膠過濾層析； 脂質體； pH梯度

0 引 言

阿霉素是一種蒽環(huán)類抗生素，主要用于急性白血病、惡性淋巴瘤和乳腺癌等多種腫瘤的臨床治療。但因其心臟毒性、骨髓抑制、消化道毒性、免疫抑制及致突變等毒副作用，使其應用受到很大限制。自從1965年Bangham發(fā)現(xiàn)脂質體后，1971年Gregoriadis等首次報道將脂質體作為藥物載體。研究發(fā)現(xiàn)，脂質體可作為蒽環(huán)類抗腫瘤藥物的有效載體，其代表產品是阿霉素脂質體，可顯著降低阿霉素的毒副作用[1-3]。脂質體常用的載藥方法可分為被動載藥法和主動載藥法[4-11]。被動載藥法適于親脂性強的或親水性強的藥物，首先將藥物溶于水相或有機相中，然后按適當?shù)姆椒?成膜水化法、高壓均質法、逆向蒸發(fā)法和乙醇注入法等)制備得到含藥脂質體。主動載藥法適用于兩親性藥物，首先制備空白脂質體，脂質體內外水相形成pH梯度或離子梯度，再將藥物加入脂質體外水相，在pH梯度或離子梯度的驅動下，兩親性藥物自發(fā)地跨越脂質雙分子層由脂質體的外水相滲透進入內水相。與被動載藥法比較，主動載藥法具有包封率高、載藥量高，且穩(wěn)定性好的特點。

由于吡喃糖苷上的氨基的存在，使得阿霉素在酸性條件下的溶解度遠大于中性條件下的溶解度，制備內水相為酸性環(huán)境和外水相為中性環(huán)境的脂質體有利于阿霉素主動載藥。其次，阿霉素是一種兩親性藥物，在中性條件下阿霉素呈分子狀態(tài)，具有一定的親脂性，可在pH梯度驅動下穿透脂質體雙分子層進入脂質體內部。再者，在酸性條件下阿霉素呈離子狀態(tài)，具有一定的親水性，導致阿霉素的脂質雙分子膜膜滲透性減低，易于聚集在脂質體內水相。再者，阿霉素在酸性條件下具有較好的穩(wěn)定性。鑒于阿霉素以上的特點，我們擬制備空白脂質體，使其外水相為pH7.2磷酸鹽緩沖液，內水相為pH4.0檸檬酸溶液。在空白脂質體的外水相加入阿霉素，在一定溫度下，阿霉素可在pH梯度的驅動下進入脂質體內水相，完成阿霉素脂質體的主動載藥。

通常采用以下的方法在脂質體內外水相形成pH梯度：透析法、超濾離心法、凝膠過濾層析法和堿調節(jié)法[12-15]。前3種方法視脂質體外水相的檸檬酸為小分子物質，脂質體為大分子物質，可根據(jù)兩者分子大小的差異達到分離的目的。透析法，利用小分子溶質在可通過半透膜，而大分子溶質不能通過半透膜的性質，達到分離得目的；超濾法是一種加壓膜分離技術，即在一定的壓力下，使小分子溶質和溶劑穿過一定孔徑半透膜，大分子溶質不能透過，達到分離的目的。凝膠過濾層析法：又稱分子排阻層析法，是利用具有網狀結構的凝膠的分子篩作用，根據(jù)被分離物質的分子大小不同達到分離的目的。堿調解法，直接在脂質體的外水相加入堿溶液進行pH調節(jié)。比較以上4種方法，透析法耗時,超濾離心法的壓力可能影響脂質體的穩(wěn)定性,堿調節(jié)法中堿溶液的加入使得脂質體內外水相的滲透壓不同，導致脂質體穩(wěn)定性降低。與上述3種方法比較，凝膠過濾層析法具有操作簡便快速，對脂質體影響小。基于此，本文擬采用凝膠過濾層析法調節(jié)脂質體內外水相的pH梯度，主動載入阿霉素，考察不同阿霉素投料量的脂質體包封率，以及初步評價阿霉素脂質體的穩(wěn)定性。

1 實驗設計

1.1 阿霉素脂質體制備

分別精密稱取氫化大豆磷脂、膽固醇和聚乙二醇2000-磷脂酰乙醇胺(摩爾比為1∶1∶0.04)溶于氯仿，減壓旋轉蒸發(fā)除去氯仿，得均勻脂質膜，真空干燥24 h。加入一定體積的0.2 mol/L pH 4.0枸櫞酸緩沖液，60 ℃水浴震蕩2 h，得脂質體混懸液。在60 ℃恒溫器上，使用微型擠出器依次將脂質體擠壓過400、200和100 nm核孔膜，得空白脂質體。以0.2 mol/L pH 7.2磷酸鹽緩沖液為洗脫劑，將空白脂質體洗脫通過Sephadex G-50葡聚糖凝膠柱(1×10 cm)交換外水相，流速1 mL/min，收集脂質體混懸液，其脂質終濃度為 20 mmol/L。分別按照藥脂比1∶5、1∶10、1∶15和1∶20(質量比)在上述脂質體混懸液加入阿霉素溶液，60 ℃水浴20 min，期間渦旋3次。以0.2 mol/L pH 7.2磷酸鹽緩沖液洗脫通過Sephadex G-50凝膠柱(1×10 cm)，流速1 mL/min，去除游離藥物，收集阿霉素脂質體，激光散射粒度儀測定粒徑及其分布。

1.2 包封率測定

精密稱取阿霉素標準品適量，以酸性異丙醇溶液為溶劑配置成1～50 mg/L系列濃度的標準溶液，以酸性異丙醇為空白對照，分別測定阿霉素最大吸收波長處(480 nm)的吸光度值，繪制標準曲線。精密量取阿霉素脂質體0.5 mL，加入酸性異丙醇溶液2.0 mL，渦旋1 min，測定480 nm處的吸光度值，根據(jù)標準曲線計算含量。按照以下公式計算包封率，

EE=C/C0

式中：C0表示總投藥量；C表示脂質體中藥物量。

1.3 穩(wěn)定性考察

將阿霉素脂質體放置于37 ℃恒溫振蕩器中，不同時間點各取0.5 mL阿霉素脂質體，首先采用激光散射粒度儀測定阿霉素脂質體的粒徑大小及分布，再以0.2 mol/L pH 7.2磷酸鹽緩沖液為洗脫劑通過Sephadex G-50凝膠柱(1×10 cm)去除游離藥物，流速1 mL/min，收集阿霉素脂質體，加入酸性異丙醇溶液，渦旋，測定480 nm處的吸光度值，根據(jù)標準曲線計算藥物含量。

2 實驗結果與討論

凝膠過濾層析法調節(jié)脂質體內外水相pH梯度，按照藥脂比1∶5、1∶10、1∶15和1∶20將阿霉素的主動載入脂質體內部，試驗結果如表1所示。隨著藥脂比的逐漸遞增，阿霉素脂質體的包封率分別為96.7%、98.7%、96.8%和95.1%，其中藥脂比1∶10時包封率達到最高(98.7%)。上述試驗結果說明，凝膠過濾層析法調節(jié)脂質體內外水相pH梯度，可有效實現(xiàn)阿霉素的主動載入。

表1 阿霉素脂質體的包封率

考察了采用藥脂比1∶10制備的阿霉素脂質體在37 ℃條件下的穩(wěn)定性，結果如表2所示。在37 ℃ 12 h內阿霉素泄漏均低于1.0%，48 h內藥物泄露率低于5%，且脂質體的粒徑分布均在119～130 nm，未有明顯變化。上述結果說明，采用凝膠過濾色譜法調節(jié)脂質體內外水相pH梯度，主動載藥制得的阿霉素脂質體具有良好的穩(wěn)定性。

表2 阿霉素脂質體穩(wěn)定性考察

3 結 語

凝膠過濾層析法是一種根據(jù)分子大小進行分離的層析技術，常用于多肽蛋白類物質的分離純化。本實驗利用凝膠過濾層析法將脂質體外水相的檸檬酸緩沖液替換成磷酸鹽緩沖液，形成脂質體內外水相的pH梯度。在pH梯度的驅動下，兩性物質阿霉素能夠有效地從脂質體外水相穿越脂質雙分子膜進入內水相，實現(xiàn)阿霉素的主動載藥。通過這個實驗示教，使得學生們能夠觀測到凝膠過濾層析如何調節(jié)pH梯度，以及pH梯度在阿霉素脂質體主動載藥過程中的重要性。凝膠過濾色譜技術不僅適用于阿霉素脂質體的制備，也將對其他納米遞藥系統(tǒng)的分離純化具有一定的使用價值。

[1] 李克敏，尹如鐵，謝 丹. 脂質體阿霉素在婦科腫瘤中的臨床應用[J]. 華西藥學雜志, 2013, 28(5): 545-47.

[2] 沈志祥. 脂質體阿霉素治療惡性淋巴瘤及多發(fā)性骨髓瘤的中國專家共識導讀[J]. 中國腫瘤臨床, 2014, 41(24): 1549.

[3] 賈晉斌, 韋青燕. 阿霉素脂質體的研究進展[J]. 中國腫瘤, 2011,20(5): 372-377.

[4] 趙 波, 范俁辰, 王學清,等. iRGD修飾的阿霉素主動靶向脂質體的細胞毒與抗腫瘤效果評價[J]. 藥學學報, 2013, 48(3): 417-422.

[5] 劉 敏, 潘 俊, 姚 明,等.多柔比星葉酸隱形脂質體對HeLa229荷瘤裸鼠的抑瘤作用[J]. 中國醫(yī)藥工業(yè)雜志, 2007,38(2): 97-101.

[6] 陸偉躍, 劉 敏, 潘 俊,等. 葉酸-脂質體制備及對HeLa細胞靶向作用[J]. 上海醫(yī)科大學學報, 2000, 27(1): 4-8.

[7] 張 磊, 潘 弘, 劉 敏,等. 阿霉素的不同鹽型對其脂質體體外藥物泄漏和體內長循環(huán)的影響[J]. 藥學學報, 2004, 39(12): 1018-1022.

[8] 程 冀, 季宇彬, 王向濤. 脂質體載藥方法的研究進展[J]. 中國醫(yī)藥技術經濟與管理, 2009, 3(9): 60-66.

[9] 苗彩云, 鄧樹海, 李艷輝. 主動載藥法制備兩親性藥物脂質體的研究進展[J].中國醫(yī)藥工業(yè)雜志, 2005, 36(7):433-437.

[10] 陳 濤, 王 昭, 韓歡牛,等. 離子梯度載藥法制備脂質體藥物的研究進展[J].世界最新醫(yī)學信息文摘, 2004, 8(3): 1204-1209.

[11] 張 蘭, 李彥輝, 王彩霞,等. 紫杉醇脂質體的制備及初步毒性、藥效學研究[J].中國藥學雜志, 2013,48(6): 446-449.

[12] 宋 陽，張小飛，周欣羽,等. 跨膜梯度法制備羥苯磺酸銨-鹽酸阿霉素脂質體[J]. 中國藥劑學雜志, 2009, 7(4): 260-265.

[13] 鄧意輝,于 彬,李煥秋,等. pH梯度法制備阿霉素脂質體[J]. 沈陽藥科大學學報, 1997, 14(4): 239-242.

[14] 李飛陽, 崔純瑩, 王玉記,等.阿霉素脂質體的制備及抗腫瘤活性研究[J]. 首都醫(yī)科大學學報, 2015, 36(2): 157-160.

[15] Yan Z, Wang F, Wen Z,etal.LyP-1-conjugated PEGylated liposomes: A carrier system for targeted therapy of 2 lymphatic metastatic tumor [J]. J Control Release, 2012, 157(1): 118-125.

Study on Adjusting pH Gradient Between the Internal and External Water Phase of Liposome Using Gel Filtration Chromatography

LIUMin,LUWeiyue,PANJun,XIECao

(School of Pharmacy, Fudan University, Shanghai 201203, China)

pH gradient method is commonly adopted for loading drug into liposome. Depending on pH gradient, drug in the external water phase of liposome could enter into the internal phase. The citric acid buffer (pH4.0) in external water phase of liposome was changed into phosphate buffer (pH7.2) by gel filtration chromatography technology. The pH gradient had found between the internal and external water phase of liposome. Doxorubicin (DOX) could enter through the lipid membrane into the internal phase driving by pH gradient. When the ratio of drug with lipid were 1∶5, 1∶10, 1∶15, and 1∶20 (w/w), the encapsulation rates were 96.7%, 98.7%, 96.8% and 98.7%, respectively. Among the above liposome, the encapsulation rate of the liposome with 1∶10 (drug: lipid) was the highest. The drug leakage rate of DOX liposome was less than 1.0% and 5.0% within 12 h or 48 h at 37 ℃. Through the experiment, the students could realize how to adjust pH gradient using gel filtration chromatography technology, as well as the pH gradient was very important for loading DOX into liposome. It would be built good basis for students studying the liposome delivery system.

gel filtration chromatography technology; liposome; pH gradient

2016-10-17

國家自然科學基金面上項目(81473148)

劉 敏(1969-)，女，天津人，博士，副教授，碩士生導師,現(xiàn)主要從事藥物靶向遞釋系統(tǒng)研究。

Tel: 13661677680; E-mail: liumin@shmu.edu.cn

R 94

A

1006-7167(2017)06-0018-03