包莉圓 - 鐘海雁,2 -,2 王蔚婕 - 蘭 芳 曹清明,2 -,2

(1. 中南林業(yè)科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，湖南 長沙 410004；2. 經(jīng)濟(jì)林培育與保護(hù)省部共建教育部重點實驗室，湖南 長沙 410004)

南山茶餅中乙醇提取物5個多酚化合物的分離純化

包莉圓1BAOLi-yuan1鐘海雁1,2ZHONGHai-yan1,2王蔚婕1WANGWei-jie1蘭 芳1LANFang1曹清明1,2CAOQing-ming1,2

(1. 中南林業(yè)科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，湖南 長沙 410004；2. 經(jīng)濟(jì)林培育與保護(hù)省部共建教育部重點實驗室，湖南 長沙 410004)

為綜合開發(fā)利用油茶資源，對南山茶餅乙醇提取物的組分進(jìn)行了制備和鑒定。將經(jīng)過乙酸乙酯萃取和硅膠柱層析分離純化收集的組分XVII、XXVII、XXVIII和XXXIV 4個組分進(jìn)行了HPLC制備，得到了純度分別為99.2%，95.4%，97.5%，99.1%，97.4%的5個化合物。用安捷倫高分辯率質(zhì)譜工作站Qualitative Analysis B.06.00分子式計算器對質(zhì)譜準(zhǔn)分子離子碎片進(jìn)行了化學(xué)式的計算，結(jié)合化合物的裂解規(guī)律和化合物物理化學(xué)性質(zhì)，鑒定為原兒茶酸和4個黃酮類化合物?；衔锏暮舜殴舱耔b定將在另外的文章中報道。

油茶；提取物；結(jié)構(gòu)鑒定；高效液相色譜；核磁；質(zhì)譜

黃酮類化合物具有抗氧化[1-3]、清除氧自由基[4-5]、保護(hù)心腦血管[6-7]、抗腫瘤[8-10]、抗菌[11-12]等藥理活性，且毒性較低，廣泛存在于自然界的多種植物和漿果中。近年來黃酮類化合物成為國內(nèi)外天然藥物、保健食品開發(fā)以及天然添加劑等領(lǐng)域的研究和開發(fā)熱點。

質(zhì)譜是鑒定有機化合物結(jié)構(gòu)的重要手段，它不僅能夠快速地測定大分子的分子量，還可根據(jù) [M+H]+、[M-H]-、[M+Na]+準(zhǔn)分子離子和電離碎片等質(zhì)譜信息，分析化合物的裂解規(guī)律，確定物質(zhì)的結(jié)構(gòu)，是目前使用范圍非常廣泛的一種結(jié)構(gòu)鑒定方法。江和源等[13]以茶籽餅粕為原料用LC-MS聯(lián)用技術(shù)分析研究黃酮苷結(jié)構(gòu)，根據(jù)[M+H]+[14-15]電離碎片信息確定了茶籽餅粕中的黃酮為山奈酚-3-O-鼠李糖和山奈酚-3-O-(6-O-D-葡萄糖基)-β-D-半乳糖苷。Ashihara等[16]采用HPLC-MS，根據(jù)出峰時間、紫外光譜和質(zhì)譜裂解規(guī)律研究了8周齡茶(茶樹)嫩葉、莖、主側(cè)根等部位，確定了14個酚類化合物的結(jié)構(gòu)。

茶油中不飽和脂肪酸的含量高達(dá)90%[17-18]，具有抗氧化[19-20]、護(hù)肝[21]和抗菌[22]活性，被譽為“東方橄欖油”。中國政府高度重視油茶產(chǎn)業(yè)，激發(fā)了人們對油茶籽[23-24]、油茶種質(zhì)資源[25-26]及茶油品質(zhì)[27]等方面的研究。

南山茶(CamelliasemiserrataChi.)又叫做廣寧紅花油茶、廣寧油茶、華南紅花油茶等，屬于山茶科(Theaceae)山茶屬(CamelliaL.)山茶亞屬的紅山茶組[28]。本研究擬以南山茶餅為原料，分析南山茶餅中乙醇提取物乙酸乙酯萃取部位的化學(xué)成分，利用安捷倫高分辯率質(zhì)譜工作站Qualitative Analysis B.06.00所帶的分子量計算器，根據(jù)離子碎片和準(zhǔn)分子離子精確推斷了化合物的分子式，結(jié)合所得的分子式和質(zhì)譜離子碎片，推斷了化合物的結(jié)構(gòu)，該研究方法尚未見報道。南山茶餅多酚化合物的制備和鑒定為研究油茶特征化合物的活性量效關(guān)系提供了試驗基礎(chǔ)。對于南山茶餅黃酮類化合物的深入研究，可以為油茶副產(chǎn)物的綜合利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

1.1.1 材料

油茶種子：廣西藤縣紅羽油茶發(fā)展有限公司，中南林業(yè)科技大學(xué)譚曉風(fēng)教授鑒定為南山茶種子(CamelliasemiserrataChi.)。

1.1.2 試劑

柱層析硅膠：200～300目，青島海洋化工廠分廠；

凝膠：Sephadex LH-20，美國GE Healthcare Bio-Science AB公司。

1.1.3 儀器

質(zhì)譜：UHPLC-QTOF/1290-6530型，安捷倫科技有限公司；

高效液相色譜儀(分析型)： 2695-2996型，配備Waters 2996 Photodiode Array Detector檢測器，美國Waters公司；

高效液相色譜儀(分析型)：LC3000型，配備Newstyle NU3000 Serials UV/VIS Detector檢測器，北京創(chuàng)新恒通科技有限公司；

分析用色譜柱：C18ME(4.6 mm×250 mm，5 μm)，華譜新創(chuàng)科技有限公司；

色譜柱：C18HCE (4.6 mm×250 mm，5 μm)：華譜新創(chuàng)科技有限公司；

色譜柱：Unitary C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，華譜新創(chuàng)科技有限公司；

高效液相色譜儀(半制備型)：LC3000型，北京創(chuàng)新恒通科技有限公司；

色譜柱(制備用)：C18HCE(20 mm×250 mm，10 μm)，華譜新創(chuàng)科技有限公司；

色譜柱(制備用)：C18ME(20 mm×250 mm，10 μm)，華譜新創(chuàng)科技有限公司；

氮吹儀：UGC-12WF型，北京優(yōu)晟聯(lián)合科技有限公司。

1.2 提取、分離和制備方法

1.2.1 茶餅的提取與粗分 冷榨法脫去南山茶種籽的油脂得到油茶餅，晾曬，粉碎，稱取1 kg。用60%乙醇按料液比1∶3 (g/mL)加熱回流提取3次，每次提取2 h，過濾后減壓濃縮至無醇，得油茶餅粗提液2 L，加入等體積的乙酸乙酯，分3次萃取，合并萃取液，減壓濃縮至溶液呈黏稠狀，最終得乙酸乙酯萃取液約150 mL。

1.2.2 乙酸乙酯萃取液的精細(xì)分離和純化 取乙酸乙酯萃取液100 mL于蒸發(fā)皿中，以少量多次的方式將200～300目硅膠(其堆密度約為1∶2.5) 40 g與樣品等體積拌樣，攪拌均勻后于50 ℃烘干，干法上樣，進(jìn)行硅膠柱層析。取500 g硅膠(200～300目)作為柱層析的填料，即柱體積(BV)為1.25 L。

通過硅膠板薄層色譜，確定洗脫劑二氯甲烷—甲醇體系的配比依次為20∶1，8∶1，5∶1，3∶1。以約1/4 BV為單位收集洗脫液，分別按順序編號為Fr.1、Fr.2、Fr.3……。將收集到的洗脫液進(jìn)行硅膠板薄層色譜檢測，根據(jù)檢測結(jié)果合并洗脫液。合并編號依次為I、II、III……，共40個組分，依次為I(Fr.1～2)；II(Fr.3～4)；……；XVII(Fr.36～39)；……；XXVII(Fr.66)；XXVIII(Fr.67～69)；……；XXXIV(Fr.90～97)……。將各組分分別減壓濃縮，冷凍干燥。

將合并后的每個組分均以少量甲醇溶解，進(jìn)行高效液相色譜檢測。其色譜條件：色譜儀：Waters 2695-2996型高效液相色譜儀；檢測器為：Waters 2996 Photodiode Array Detector；色譜柱：Unitary C18，4.6 mm×250 mm，5 μm；流動相A為甲醇，流動相B為0.1%甲酸—水。流動相洗脫條件見表1。

表1 HPLC色譜條件Table 1 HPLC chromatographic condition

對表 1的條件下得到的液相色譜圖進(jìn)行分析，確定組分XVII(Fr.36～39)、XXVII(Fr.66)、XXVIII(Fr.67～69)和XXXIV(Fr.90～97)并進(jìn)行進(jìn)一步的分離純化。

(1) XVII(Fr.36～39)純化：經(jīng)過分析Fr.36～39在表 1條件下的色譜圖，可知該組分中化合物較多，而且極性很接近，所以采用凝膠(Sephadex LH-20)柱層析的方法進(jìn)行再次純化。凝膠柱層析以二氯甲烷∶甲烷(8∶1)為洗脫劑，進(jìn)行恒定梯度洗脫。柱體積BV為120 mL。以約1/10 BV為一個單位收集洗脫液，分別按收集順序編號1、2、3、4……。對收集到的洗脫液用硅膠薄層層析色譜(TLC)檢測，根據(jù)TLC檢測結(jié)果合并洗脫液，結(jié)果為：7～11；12～17；18～21；22～79。

對其中的7～11組分(記為：XVII-I)進(jìn)行液相檢測，液相分析條件為：LC3000型高效液相色譜儀，色譜柱為C18HCE柱，4.6 mm×250 mm，10 μm；洗脫條件為35%甲醇—0.2%乙酸水；進(jìn)樣量50 μL。其液相半制備條件為LC3000型高效液相色譜儀，C18HCE柱，20 mm×250 mm，10 μm；洗脫條件35%甲醇—0.2%乙酸水；進(jìn)樣量1 mL。接收其主峰，并以同樣的方法多針制備，減壓濃縮、冷凍干燥。測定其質(zhì)量和純度。

(2) XXVII(Fr.66)純化：經(jīng)過分析Fr.66在表 1條件下的色譜圖，可知該組分中化合物較少，且主峰較突出。因此直接對其進(jìn)行液相半制備。其液相分析時色譜條件為：LC3000型高效液相色譜儀；C18HCE色譜柱，4.6 mm×250 mm，10 μm；洗脫劑45%甲醇—水；進(jìn)樣量30 μL。

Fr.66液相半制備條件為：LC3000型高效液相色譜儀；C18HCE色譜柱，20 mm×250 mm，10 μm；洗脫劑45%甲醇—水；進(jìn)樣量1 mL。收集其中的2號峰(記為XXVII-2)，濃縮后測定純度并稱重。測定結(jié)果顯示XXVII-2的純度約為60%，無法進(jìn)行核磁解析，再次進(jìn)行半制備。再次半制備的色譜條件相同，但是流動相為37%甲醇—水。接收流出液，濃縮干燥，測定純度并稱重。

(3) XXVIII(Fr.67～69)純化：Fr.67～69液相分析時的色譜條件為LC3000型高效液相色譜儀；C18ME色譜柱，4.6 mm×250 mm，10 μm；洗脫劑25%乙腈—水；進(jìn)樣量50 μL。其半制備條件為LC3000型高效液相色譜儀； C18ME色譜柱, 20 mm×250 mm，10 μm，洗脫劑25%乙腈—水；進(jìn)樣量0.3 mL。收集其中的主峰(標(biāo)記為XXVIII-2)，并減壓濃縮，進(jìn)行純度測定。經(jīng)測定結(jié)果顯示該峰純度僅為80%，需要再次進(jìn)行液相分析和半制備，其條件同F(xiàn)r.67～69。接收流出液，濃縮干燥，測定純度并稱重。

(4) XXXIV(Fr.90～97)純化：Fr.90～97液相分析時的色譜條件為LC3000型高效液相色譜儀；C18HCE色譜柱，4.6 mm×250 mm，10 μm；洗脫劑25%乙腈—水；進(jìn)樣量30 μL。其半制備條件為LC3000型高效液相色譜儀；C18HCE色譜柱，20 mm×250 mm，10 μm；洗脫劑25%乙腈—水；進(jìn)樣量3 mL。收集其中的主峰，濃縮后進(jìn)行純度測定，凍干測定質(zhì)量。濃縮干燥，測定純度并稱重。

1.2.3 結(jié)構(gòu)鑒定 對樣品成分進(jìn)行質(zhì)譜分析，色譜條件同每個組分的半制備，質(zhì)譜條件為：電噴霧離子源正離子檢測，氮氣為干燥氣，干燥氣溫度300 ℃，流速6 L/min，霧化器壓力0.345 MPa，鞘氣溫度400 ℃，鞘氣流速12 L/min，毛細(xì)管電壓4 000 V，噴嘴電壓0 V，參比離子流速10 μL/min，正模式參比離子121.085 5、922.092 2，采集范圍100～1 000，掃描速度2 scan/s。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理 質(zhì)譜工作站軟件：Agilent Mass Hunter Workstation Software，Version B.06.00，Build 6.0.633.0。色譜工作站軟件：Agilent 1200 Chemstations。利用安捷倫質(zhì)譜工作站自帶質(zhì)譜分子式計算器對碎片離子峰進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 HPLC制備高純度化合物

2.1.1 XVII(Fr.36～39)中化合物的制備 圖 1是Fr.36～39組分I(記為XVII-I)的液相色譜制備圖，分別接收1～3號峰，并對得到的3段接收液進(jìn)行純度檢驗。

圖1 Fr.(36～39)-I液相色譜制備圖Figure 1 Fr. (36～39)-I Chromatogram of HPLC preparation

由圖1可知，1號和3號色譜峰的峰形都不夠尖銳，純度要求低于結(jié)構(gòu)鑒定水平；2號峰為單一色譜峰且峰形尖銳，由色譜峰面積計算純度在95%以上。制備得到13 mg化合物1。以40%甲醇—0.2%乙酸水液相檢測其純度為99.2%，滿足做結(jié)構(gòu)解析的要求。

2.1.2 XXVII(Fr.66)中化合物的制備 分別接收圖2中1號和2號峰，濃縮，1號峰經(jīng)檢測為混合物；2號峰(XXVII-2)經(jīng)檢測純度約為60%，進(jìn)行再次制備。半制備色譜圖見圖3。

圖2 Fr.66液相色譜制備Figure 2 Fr.66 Chromatogram of HPLC preparation

圖3中，1號和2號色譜峰的峰形尖銳，由色譜峰面積計算純度在90%以上。但是1號峰的質(zhì)量太少；2號峰經(jīng)制備得到11.8 mg化合物2，以40%甲醇—水液相檢測其純度為95.4%，滿足做結(jié)構(gòu)解析的要求。

圖3 Fr.(66)-2液相色譜制備Figure 3 Fr. (66)-2 Chromatogram of HPLC preparation

2.1.3 XXVIII(Fr.67～69)中化合物的制備 接收圖4中標(biāo)志出來的2峰，合并接收液、凍干、稱重、測定純度。其中1號峰得到物質(zhì)少且純度很差，所以暫時不進(jìn)一步純化；2號峰(XXVIII-2)的質(zhì)量較大，但是純度較差，再次進(jìn)行HPLC分析并半制備。半制備色譜圖見圖5。

圖4 Fr.67～69液相色譜制備Figure 4 Fr.67～69 Chromatogram of HPLC preparation

由色譜峰面積計算，圖5中1號峰、3號峰的純度在90%以上。1號峰經(jīng)制備得到5 mg化合物3；2號峰經(jīng)制備得到的質(zhì)量很??；3號峰經(jīng)制備得到8 mg化合物4。以25%乙腈—0.1%甲酸水液相檢測化合物3的純度為97.5%，滿足做結(jié)構(gòu)解析的要求。經(jīng)計算可得，化合物3的提取得率為10 mg/kg。以25%乙腈—0.1%甲酸水液相檢測化合物4的純度為99.1%，滿足做結(jié)構(gòu)解析的要求。經(jīng)計算可得，化合物4的提取得率為16 mg/kg。

圖5 Fr.(67～69)-2液相色譜制備圖Figure 5 Fr. (67～69)-2 Chromatogram of HPLC preparation

2.1.4 XXXIV(Fr.90～97)中化合物的制備 由圖6可知，1號色譜峰峰形很寬，含有多種雜質(zhì)，純度要求低于結(jié)構(gòu)鑒定水平。2號色譜峰為單一峰且峰形尖銳，根據(jù)峰面積計算其純度在90%以上。2號峰制備得到16 mg化合物5，以25%乙腈—水液相檢測其純度為97.4%，滿足做結(jié)構(gòu)解析的要求。

圖6 Fr.90～97液相色譜制備Figure 6 Fr. 90～97 Chromatogram of HPLC preparation

2.2 單體化合物的結(jié)構(gòu)鑒定

2.2.1 化合物1的結(jié)構(gòu)解析 褐色晶體，易溶于甲醇、乙醇和丙酮，難溶于水和氯仿。質(zhì)譜圖見圖7，質(zhì)譜數(shù)據(jù)m/z155.034 3 [M+H]+，由安捷倫分子式計算器推測其分子式為C7H6O4。

初步推測該化合物為原兒茶酸，該化合物從南山茶果皮[29]、西南山茶葉[30]、金花茶花[31]、普通油茶的根[32]中都有提取得到。

2.2.2 化合物2的結(jié)構(gòu)解析 黃色晶體，易溶于甲醇、乙醇和丙酮，難溶于水和氯仿，與鹽酸鎂粉顯陽性反應(yīng)，與三氧化鋁試劑呈黃綠色熒光，與Molish呈陽性反應(yīng)，提示化合物為黃酮苷類。質(zhì)譜圖見圖 8，質(zhì)譜數(shù)據(jù)m/z433.112 8 [M+H]+，由安捷倫分子式計算器推測其分子式為C21H20O10。

圖7 化合物1的質(zhì)譜圖Figure 7 Mass spectrum of compounds 1

圖8 化合物2的質(zhì)譜圖Figure 8 Mass spectrum of compounds 2

推斷該化合物可能為以山奈酚為母核帶一分子鼠李糖的黃酮類化合物，這類化合物在山茶屬植物的種子或者花中報道過，包括糖的連接在山奈酚的3位[33-35]或8位[31, 36]的化合物。該化合物也可能為以芹菜素為母核帶一分子葡萄糖基或者半乳糖基的黃酮類化合物，以芹菜素為母核的化合物在綠茶[37-40]和白茶[41]中報道過。

2.2.3 化合物3的結(jié)構(gòu)解析 淺黃色晶體，易溶于甲醇、乙醇和丙酮，難溶于水和氯仿，與鹽酸鎂粉顯陽性反應(yīng)，三氧化鋁反應(yīng)呈黃綠色熒光，與Molish呈陽性反應(yīng)，提示化合物為黃酮苷類。

質(zhì)譜圖見圖9，質(zhì)譜數(shù)據(jù)m/z783.237 2 [M+H]+，質(zhì)子碎片m/z637.178 9 [(M+H)-146]+，449.104 9 [(M+H)-146-146]+，由安捷倫分子式計算器推測其分子式為C33H40O19。推測其結(jié)構(gòu)中含有1個山奈酚母核、2組鼠李糖基、1組葡萄糖基以及1組乙?；?/p>

圖9 化合物3的質(zhì)譜圖Figure 9 Mass spectrum of compounds 3

2.2.4 化合物4的結(jié)構(gòu)解析 黃色晶體，易溶于甲醇、乙醇和丙酮，難溶于氯仿和水，與鹽酸鎂粉顯陽性反應(yīng)，三氧化鋁反應(yīng)呈黃綠色熒光，與Molish呈陽性反應(yīng)，提示化合物為黃酮苷類。

質(zhì)譜圖見圖 10，質(zhì)譜數(shù)據(jù)m/z825.245 3 [M+H]+，由安捷倫分子式計算器推測其分子式為C37H44O21，質(zhì)子碎片m/z679.187 3 [(M+H)-146]+，287.055 0 [(M+H)-146-42-42-162]+，根據(jù)離子碎片并結(jié)合核磁相關(guān)數(shù)據(jù)推測其含有山奈酚母核以及1個葡萄糖基和2個鼠李糖基以及2個乙?；?。

圖10 化合物4的質(zhì)譜圖Figure 10 Mass spectrum of compounds 4

2.2.5 化合物5的結(jié)構(gòu)解析 青黑色晶體，易溶于甲醇、乙醇和丙酮，難溶于氯仿和水，與鹽酸鎂粉顯陽性反應(yīng)，三氧化鋁反應(yīng)呈黃綠色熒光，與Molish呈陽性反應(yīng)，提示化合物為黃酮苷類。

質(zhì)譜圖見圖 11，質(zhì)譜數(shù)據(jù)m/z741.233 5 [M+H]+，由安捷倫分子式計算器推測其分子式為C35H42O20，質(zhì)子碎片m/z595.173 9 [(M+H)-146]+，449.113 9 [(M+H)-146-146]+，287.051 5 [(M+H)-146-146-162]+，該化合物為含有1個山奈酚母核、2個鼠李糖基和1個葡萄糖基的黃酮類化合物。

圖11 化合物5的質(zhì)譜圖Figure 11 Mass spectrum of compounds 5

3 結(jié)論

試驗中，南山茶餅提取物在乙酸乙酯萃取和硅膠柱層析分離、純化的基礎(chǔ)上，用液相色譜對4個組分進(jìn)行了制備，得到了5個純度為90%以上的化合物。通過高清晰質(zhì)譜的分子式計算器推斷了分子式，初步鑒定為原兒茶酸和4個黃酮類化合物。對于其絕對結(jié)構(gòu)的確定將通過核磁鑒定進(jìn)一步研究。

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Isolation, purification and identification of extracts from seed ofCamelliasemiserrataChi.

(1.FacultyofFoodScienceandEngineering,CentralSouthUniversityofForestryandTechnology,Changsha,Hunan410004,China; 2.KeyLaboratoryofCultivationandProtectionforNon-WoodForestTrees〔CentralSouthUniversityofForestryandTechnology〕,MinistryofEducation,Changsha,Hunan410004,China)

To comprehensively develop and utilizeCamelliaresources, fractions of ethanol extract ofCamelliasemiserrataChi. cake were separated and identified. Five purified compounds with purity of 99.2%, 95.4%, 97.5%, 99.1% and 97.4%, respectively, were achieved. By using affiliated molecular formula of generator by Agilent high-resolution mass spectrometry workstation Qualitative Analysis B.06.00, formula of MS fragmentation of molecular ions were calculated, combining with fragmentation patterns of compounds and physical and chemical properties, the compounds were identified as protocatechuic acid and four kinds of flavonoids.

Camellia; extract; Structure identification; HPLC; NMR; Mass spectrometry

10.13652/j.issn.1003-5788.2017.04.026