崔開穎，趙素芬，朱根海

(1海南省人民醫(yī)院，?？?70000；2河北醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院)

上皮性卵巢癌組織中miR-21-5p、miR-29-3p、miR-139-5p表達(dá)變化及意義

崔開穎1，趙素芬2，朱根海1

(1海南省人民醫(yī)院，海口570000；2河北醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院)

目的 觀察上皮性卵巢癌(EOC)組織中miR-21-5p、miR-29-3p和miR-139-5p的表達(dá)變化，并探討其臨床意義。方法 收集卵巢組織標(biāo)本182例，其中正常卵巢組織56例、良性上皮性腫瘤(BEOT)42例、EOC 84例。采用實時熒光定量PCR技術(shù)測定組織標(biāo)本中的miR-21-5p、miR-29-3p和miR-139-5p，并分析其與EOC患者臨床病理特征的關(guān)系。結(jié)果 與正常卵巢組織、BEOT組織相比，EOC組織中miR-21-5p和miR-29-3p相對表達(dá)量增加， miR-139-5p相對表達(dá)量降低(P均<0.05)；正常卵巢組織與BEOT組織比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。與中高度分化、Ⅰ～Ⅱ期和無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的EOC組織相比，低分化、Ⅲ～Ⅳ期和有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的EOC組織miR-21-5p和miR-29-3p高表達(dá)者多，miR-139-5p高表達(dá)者少(P均<0.05)。結(jié)論 EOC組織中miR-21-5p和miR-29-3p表達(dá)上調(diào)并可能發(fā)揮促癌作用，miR-139-5p表達(dá)下調(diào)并可能具有一定抑癌作用，三者均可作為EOC的預(yù)后指標(biāo)或者治療靶標(biāo)。

微小RNA-21-5p；微小RNA-29-3p；微小RNA-139-5p；上皮性卵巢癌

上皮性卵巢癌(EOC)在卵巢癌中最為多見，其病死率位居所有婦科腫瘤的首位[1]。目前，盡管卵巢癌發(fā)生和發(fā)展機(jī)制的相關(guān)研究取得較大進(jìn)展，然而，還有很多機(jī)制尚待闡明，新的治療理論、策略和方法尚需進(jìn)一步探索。微小RNAs(miRNAs)是一類長度約為21個核苷酸組成的RNA小分子，通過特異性靶向降解目標(biāo)mRNA分子或者抑制目標(biāo)蛋白翻譯過程而發(fā)揮廣泛的生物學(xué)作用[2]。miRNAs在腫瘤發(fā)生、發(fā)展、耐藥和預(yù)后中均具有重要作用，是腫瘤研究領(lǐng)域的熱點分子之一[3]。miR-21-5p、miR-29-3p和miR-139-5p均是人體細(xì)胞生長和增殖調(diào)節(jié)的重要miRNAs，目前關(guān)于這些miRNAs在EOC組織中的研究鮮見報道。本研究通過觀察miR-21-5p、miR-29-3p和miR-139-5p在EOC中的表達(dá)情況并探討其臨床意義，旨在為EOC的診斷和治療新策略開發(fā)提供一定理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2010年1月～2015年10月海南省人民醫(yī)院接受手術(shù)治療的182例婦科患者卵巢組織標(biāo)本，其中因良性宮體病變而切除附件的正常卵巢上皮組織標(biāo)本56例，良性上皮性卵巢腫瘤(BEOT)組織標(biāo)本42例，未經(jīng)放、化療而手術(shù)切除的EOC組織標(biāo)本84例。EOC患者年齡<50歲26例，≥50歲58例；病理類型：漿液性48例，黏液性20例，子宮內(nèi)膜樣8例，透明細(xì)胞癌8例；分化程度：低分化33例，中分化36，高分化15例；臨床分期：Ⅰ～Ⅱ期30例，Ⅲ～Ⅳ期54例；無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移27例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移57例。

1.2 miR-21-5p、miR-29-3p和miR-139-5p檢測方法 采用實時熒光定量PCR法。紫外分光光度計購自美國Thermo公司，實時熒光定量儀購自美國BioRad公司，TRIzol試劑購自美國Invitrogen公司，miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自德國QIAGEN公司，實時熒光定量試劑盒購自日本TaKaRa公司，其他化學(xué)試劑均購自北京科昊生物工程有限公司。miR-21-5p引物：5′-UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA-3′；miR-29-3p引物：5′-UAGCACCAUUUGAAAUCGGUUA-3′；miR-139-5p引物：5′-UCUACAGUGCACGUGUCUCCAGU-3′；下游通用引物和內(nèi)參U6引物均由試劑盒提供。操作步驟：①RNA提取：取液氮中卵巢組織，用研磨器研碎；加入適量TRIzol，室溫靜置10 min。加入適量氯仿并混勻，低溫12 000 r/min離心10 min，吸取上層透明液體；加入適量異丙醇，混勻并低溫12 000 r/min離心10 min；乙醇洗滌，低溫12 000 r/min離心5 min；室溫干燥，加入無RNA酶水溶解，紫外分光光度計定量并-80 ℃保存。②miRNA cDNA反轉(zhuǎn)錄及熒光實時定量：取RNA并嚴(yán)格按照QIAGEN公司miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，配制20 μL反應(yīng)體系。反應(yīng)條件：37 ℃反轉(zhuǎn)錄60 min，95 ℃滅活5 min。取反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物配制20 μL反應(yīng)體系，置于熒光定量儀中進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性15 min；94 ℃變性15 s，55 ℃退火30 s，70 ℃延伸30 s，40個循環(huán)。miR-21-5p、miR-29-3p和miR-139-5p相對表達(dá)量以2-Δct計算。以正常卵巢組織miR-21-5p、miR-29-3p和miR-139-5p相對量平均值為界定標(biāo)準(zhǔn)，高于平均值為高表達(dá)，低于平均值為低表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1 不同卵巢組織中miR-21-5p、miR-29-3p和miR-139-5p相對表達(dá)量比較 與正常卵巢組織、BEOT組織相比，EOC組織中miR-21-5p和miR-29-3p相對表達(dá)量增加， miR-139-5p相對表量降低(P均<0.05)。正常卵巢組織與BEOT組織比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見表1。

表1 不同卵巢組織中miR-21-5p、miR-29-3p和miR-139-5p相對表達(dá)量比較

注：與正常卵巢組織比較，*P<0.05；與BEOT組織比較，#P<0.05。

2.2 miR-21-5p、miR-29-3p和miR-139-5p表達(dá)與EOC患者臨床病理特征的關(guān)系 不同年齡和病理組織類型EOC組織miR-21-5p、miR-29-3p和miR-139-5p高表達(dá)者比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義；與中高度分化、Ⅰ～Ⅱ期和無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的EOC組織相比，低分化、Ⅲ～Ⅳ期和有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的EOC組織miR-21-5p和miR-29-3p高表達(dá)者多，miR-139-5p高表達(dá)者少(P均<0.05)。見表2。

表2 miR-21-5p、miR-29-3p和miR-139-5p表達(dá)與EOC患者臨床病理特征的關(guān)系(例)

3 討論

EOC是惡性程度較高的婦科腫瘤，其發(fā)病機(jī)制和臨床治療新策略一直是基礎(chǔ)和臨床研究的熱點問題之一[4，5]。miRNAs廣泛參與細(xì)胞發(fā)育、分化及衰老等幾乎所有生命活動的調(diào)節(jié)[6]，目前是腫瘤研究的熱點之一[7]。

miR-21-5p已經(jīng)被證實在乳腺癌、胃癌和肝癌等多種癌組織中高表達(dá)，被認(rèn)為在腫瘤發(fā)生發(fā)展中扮演著癌基因的角色[8]。miR-21-5p促進(jìn)腫瘤發(fā)展的機(jī)制，主要認(rèn)為與靶向下調(diào)重要的腫瘤抑制分子PTEN相關(guān)。婁艷輝等[9]研究發(fā)現(xiàn)，EOC組織較正常卵巢組織存在miR-21-5p表達(dá)上調(diào)現(xiàn)象，推測其與患者不良預(yù)后密切相關(guān)，能否作為EOC的治療靶標(biāo)和預(yù)后指標(biāo)尚需進(jìn)一步大樣本研究。本研究結(jié)果表明，EOC組織中miR-21-5p相對表達(dá)量高于BEOT組織和正常卵巢組織，與相關(guān)文獻(xiàn)報道一致；并且，相比于中高度分化、Ⅰ～Ⅱ期和無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的EOC組織，低分化、Ⅲ～Ⅳ期和有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的EOC組織miR-21-5p高表達(dá)者增加，提示其與EOC的分化程度和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。

miR-29-3p在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用爭議較大。Zhu等[10]報道，非小細(xì)胞肺癌患者組織和血清中miR-29c表達(dá)水平較正常人顯著升高，推測其扮演著重要的促癌角色；然而，褚慶華等[11]在食管鱗狀細(xì)胞癌研究中發(fā)現(xiàn)，miR-29c可以通過靶向T淋巴瘤侵襲轉(zhuǎn)移誘導(dǎo)因子1而抑制腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移。然而，關(guān)于miR-29-3p在EOC中的表達(dá)和作用卻鮮見報道。本研究結(jié)果顯示，EOC組織中miR-29-3p相對表達(dá)量高于BEOT組織和正常卵巢組織，并且在低分化、高分期和有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的EOC組織中高表達(dá)者顯著增多。表明miR-29-3p在EOC組織中可能通過某種機(jī)制發(fā)揮促進(jìn)腫瘤發(fā)生和發(fā)展的作用，但具體機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

研究發(fā)現(xiàn)，miR-139-5p在各種腫瘤中作用同樣具有較大差別。Li等[12]報道，miR-139-5p在結(jié)腸癌、頭頸部腫瘤和結(jié)腸組織癌中較相應(yīng)正常組織表達(dá)下調(diào)，具有一定抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要作用。廖信芳等[13]報道，miR-139-5p在結(jié)直腸癌組織中較正常結(jié)直腸組織表達(dá)下調(diào)，并發(fā)現(xiàn)其可能通過靶向Notch1蛋白而發(fā)揮抑癌作用。然而，Bao等[14]發(fā)現(xiàn)miR-139-5p在胃癌組織中表達(dá)上調(diào)發(fā)揮促癌作用。然而，到目前為止，尚未見miR-139-5p在EOC組織中表達(dá)狀況的研究。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，EOC組織中miR-139-5p相對表達(dá)量均低于BEOT組織和正常卵巢組織，且EOC組織中不同分化程度、臨床分期及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移病理特征的miR-139-5p表達(dá)水平均存在顯著差異。表明miR-139-5p可能在EOC中發(fā)揮抑癌作用，然而相關(guān)機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

綜上所述，EOC組織中miR-21-5p和miR-29-3p表達(dá)上調(diào)并可能發(fā)揮促癌作用，miR-139-5p表達(dá)下調(diào)并可能具有一定抑癌作用，三者均可能作為較為理想的預(yù)后指標(biāo)或者治療靶標(biāo)應(yīng)用于臨床，值得進(jìn)一步研究。

[1] 盧淮武,王東雁,劉昀昀,等.半乳糖凝集素-3與β-Catenin在上皮性卵巢癌中的表達(dá)和臨床指標(biāo)及預(yù)后關(guān)系[J].中山大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)科學(xué)版),2015,36(6):883-888.

[2] 柴連琴,王樂,苗迎春,等.miRNA對完全變態(tài)昆蟲發(fā)育的調(diào)控作用研究進(jìn)展[J].河南農(nóng)業(yè)科學(xué),2015,44(8):13-16.

[3] 呂麗霞,薛靜.miRNA 作為腫瘤治療靶點的研究進(jìn)展[J].山東醫(yī)藥,2014,54(40):105-108.

[4] 劉佳宇,趙妍蕊,張麗娜,等.上皮源性卵巢癌中4種miRNAs的表達(dá)及其臨床意義[J].天津醫(yī)藥,2015,43(9):996-1000.

[5] 路慧珺,唐均英,彭巧,等.貝伐單抗在卵巢癌治療中的進(jìn)展[J].重慶醫(yī)學(xué),2014,43(32):4382-4384.

[6] 曹勝男,寧志豐,劉復(fù)興,等.miRNA在腫瘤干細(xì)胞中的研究進(jìn)展[J].山東醫(yī)藥,2014,54(36):102-104.

[7] 黃辰,劉利英,倪磊,等.腫瘤miRNAs調(diào)控機(jī)制的研究進(jìn)展與展望[J].西安交通大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版),2015,36(4):429-434.

[8] 王卉,劉水逸,吳唐維,等.miR-21在乳腺癌中的表達(dá)及其對乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移的影響[J].中華檢驗醫(yī)學(xué)雜志,2015,38(3):186-190.

[9] 婁艷輝,楊興升,王福玲,等.miR-21在上皮性卵巢癌組織中的表達(dá)及臨床意義[J].南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報,2010,30(3):608-610.

[10] Zhu W, He J, Chen D, et al. Expression of miR-29c，miR-93，and miR-429 as potential biomarkers for detection of early stagenon-small lung cancer[J]． PLoS One， 2014，9(2)：e87780.

[11] 褚慶華,張婕,孫奮勇,等.miR-29c通過 Tiam1抑制人食管鱗狀細(xì)胞癌侵襲和轉(zhuǎn)移的研究[J].檢驗醫(yī)學(xué),2015,30(6):635-640.

[12] Li RY, Chen LC, Zhang HY, et al. miR-139-5p inhibits Mcl-1 expression and potentiates TMZ-induced apoptosis in glioma[J]. CNS Neurosci Ther, 2013,19(7):477-483.

[13] 廖信芳,李正榮,楊清水,等.microRNA-139-5p及其靶基因Notch1在結(jié)直腸癌中的作用[J].中國普通外科雜志,2014,23(10):1373-1378.

[14] Bao W, Fu HJ, Xie QS, et al. HER2 interacts with CD44 to upregulate CXCR4 via epigenetic silencing of microRNA-139 in gastric cancer cells[J]. Gastroenterology, 2011,141(6):2076-2087.

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.22.025

R711

B

1002-266X(2017)22-0065-03

2017-01-23)