安磊，郭鈺琪，王麗，孫曉艷，呂衍民，蘭紅云，姚成芳

(1濟(jì)南大學(xué) 山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，濟(jì)南 250062；2山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所)

玉屏風(fēng)散對(duì)低溫環(huán)境下小鼠肺臟固有淋巴樣細(xì)胞比例及功能的影響

安磊1,2，郭鈺琪2，王麗2，孫曉艷2，呂衍民2，蘭紅云1,2，姚成芳2

(1濟(jì)南大學(xué) 山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，濟(jì)南 250062；2山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所)

目的 觀察玉屏風(fēng)散對(duì)低溫環(huán)境下小鼠肺臟固有淋巴樣細(xì)胞(ILCs)比例及功能的影響。方法 將24只小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、低溫模型組和玉屏風(fēng)散組，對(duì)照組不做處理，低溫模型組和玉屏風(fēng)散組給予低溫處理(3 h/d，連續(xù)3 d)，且玉屏風(fēng)散組低溫處理前第7天開始給予玉屏風(fēng)散直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組小鼠肺臟組織淋巴細(xì)胞中ILCs及其亞群(ILC1、ILC2和ILC3)比例，采用RT-PCR法檢測(cè)小鼠肺臟組織中ILCs功能因子IFNγ、IL-13、IL-17A mRNA表達(dá)。結(jié)果 與對(duì)照組相比，低溫模型組小鼠肺臟組織淋巴細(xì)胞中ILCs、ILC1、ILC2、ILC3比例低(P均<0.05)，IFNγ、IL-13、IL-17A mRNA表達(dá)低(P均<0.01)。與低溫模型組相比，玉屏風(fēng)散組小鼠肺臟組織淋巴細(xì)胞中ILCs、ILC1、ILC2、ILC3比例高(P均<0.05)，IFNγ、IL-13、IL-17A mRNA表達(dá)高(P均<0.05)。結(jié)論 玉屏風(fēng)散可逆轉(zhuǎn)低溫環(huán)境對(duì)肺臟ILCs及其功能因子的抑制作用。

低溫；固有淋巴樣細(xì)胞；肺；玉屏風(fēng)散；中藥

低溫環(huán)境常常誘發(fā)或加重支氣管炎、哮喘等呼吸系統(tǒng)疾病[1,2]。肺臟是黏膜免疫的重要組成部分，其固有免疫系統(tǒng)在抵抗環(huán)境溫度刺激時(shí)發(fā)揮首要保護(hù)作用。近年來新發(fā)現(xiàn)的天然免疫細(xì)胞——固有淋巴樣細(xì)胞(ILCs)被認(rèn)為是黏膜組織固有免疫的重要組成部分，在抵抗病原入侵、維持黏膜穩(wěn)態(tài)、淋巴組織形成及組織修復(fù)中發(fā)揮重要作用[3]。ILCs由共同淋巴樣祖細(xì)胞(CLP)分化而來，根據(jù)細(xì)胞因子分泌模式不同，被分為ILC1、ILC2和ILC3亞群。ILC1以產(chǎn)生大量IFNγ等為特征，是機(jī)體抗病毒、抗腫瘤的關(guān)鍵細(xì)胞亞群；ILC2可產(chǎn)生IL-5及IL-13等細(xì)胞因子，主導(dǎo)黏膜體液免疫和過敏反應(yīng)；ILC3分泌IL-17A等細(xì)胞因子，主導(dǎo)并放大炎癥反應(yīng)[4,5]。ILCs對(duì)保持肺臟微環(huán)境的平衡與穩(wěn)定、維持肺臟固有免疫、抵御外界環(huán)境變化有著重要意義[6]，但其對(duì)外界低溫環(huán)境的敏感性及其細(xì)胞因子分泌變化模式尚無報(bào)道。中藥玉屏風(fēng)散由黃芪、白術(shù)、防風(fēng)組成，發(fā)揮扶正、固表、祛邪之功效，用于表虛不固、外感風(fēng)邪等證[7]，可增強(qiáng)機(jī)體防邪入侵的功能。但玉屏風(fēng)散靶向肺臟ILCs的作用尚不清楚。2016年10～12月，本研究觀察了玉屏風(fēng)散對(duì)低溫環(huán)境下小鼠肺臟ILCs比例及功能的影響，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、試劑及儀器 SPF級(jí)雌性C57BL/6小鼠24只，6～7周齡，體質(zhì)量(18.29±1.41)g，購(gòu)自濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司。玉屏風(fēng)散由本實(shí)驗(yàn)室采用水提醇沉法制得。流式抗體Rat anti mouse PerCP-CD45、PE-Cy7-CD3、FITC-CD335、APC-IFNγ、PE-IL-5、APC-Cy7-IL-17A，固定穿膜試劑盒，佛波酯，離子霉素，蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑，膠原酶Ⅳ，BD FACSVerse流式細(xì)胞儀，TRIzol、Oligo dT、dNTP、RNasin、2×Taq Master Mix(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)，IFNγ、IL-13及IL-17A引物(濟(jì)南博尚生物技術(shù)有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組與處理 將24只C57BL/6小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、低溫模型組、玉屏風(fēng)散組，各8只。對(duì)照組與低溫模型組小鼠自由飲水；玉屏風(fēng)散組飲用玉屏風(fēng)散制劑2.34 g/(kg·d)直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。各組小鼠均在室溫(25 ℃)飼養(yǎng)7 d。自玉屏風(fēng)散組給藥第8天開始，每日將玉屏風(fēng)散組和低溫模型組小鼠置于(10±1)℃低溫裝置內(nèi)，低溫處理3 h，連續(xù)處理3 d。低溫處理后，測(cè)得低溫模型組小鼠體質(zhì)量、肛溫較對(duì)照組低(P<0.05或<0.01)，表明成功建立小鼠低溫模型。于末次低溫處理后，處死各組動(dòng)物，使用冷PBS在體沖洗肺臟。

1.2.2 小鼠肺臟組織淋巴細(xì)胞中ILCs及其亞群比例檢測(cè) 采用流式細(xì)胞術(shù)。分離小鼠肺臟組織，剪碎，置于膠原酶Ⅳ消化液中，振蕩消化40 min，研磨過濾，PBS洗1遍。LSK淋巴細(xì)胞分離液分離單個(gè)核細(xì)胞，PBS洗2遍，RPMI1640和10% FBS RPMI1640培養(yǎng)液各洗1遍，計(jì)數(shù)細(xì)胞，用于流式細(xì)胞檢測(cè)。按照細(xì)胞數(shù)5×106/孔接種于24孔板，根據(jù)試劑盒說明書加入適當(dāng)濃度的佛波酯、離子霉素和蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑，刺激培養(yǎng)5 h后收集細(xì)胞。PBS洗2遍，每管加20 μL新鮮大鼠血清室溫避光孵育20 min，PBS洗1遍后加入流式抗體CD45、CD3、CD335，4 ℃避光孵育30 min。PBS洗2遍，按照固定穿膜試劑盒說明書進(jìn)行固定穿膜，加入胞內(nèi)流式抗體IFNγ、IL-5、IL-17A，4 ℃避光1 h。PBS洗2遍后，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)肺臟CD45+CD3-CD335+ILC及其亞群-ILC1(IFNγ+)、ILC2(IL-5+)和ILC3(IL-17A+)在淋巴細(xì)胞中所占比例。

1.2.3 小鼠肺臟組織IFNγ、IL-13、IL-17A mRNA表達(dá)檢測(cè) 分離肺臟小葉，剪碎后用1 mL TRIzol對(duì)其充分裂解5 min。加入200 μL氯仿劇烈震蕩，離心后取上清，加入等體積異丙醇混勻靜置后，離心棄上清，依次用75%乙醇和無水乙醇洗滌沉淀。最后用若干體積RNase-free水溶解RNA，經(jīng)ND-1000分光光度儀檢測(cè)RNA純度與含量后，調(diào)整各樣本RNA濃度至2 μg/11 μL。RT反應(yīng)：采用20 μL體系，以1 μL Oligo dT為RT反應(yīng)引物，與2 μg(11 μL)總RNA先進(jìn)行70 ℃、5 min預(yù)熱，冰浴降溫后加入4 μL 5×RT buffer、2 μL dNTP(10 mmol/L)、1 μL RNasin及1 μL M-MLV，進(jìn)行反應(yīng)。PCR反應(yīng)：采用25 μL體系，包括RT產(chǎn)物4 μL、上下游引物(10 μmol/L)各2 μL、2×Taq Master Mix 12.5 μL、RNase-free水6.5 μL。PCR產(chǎn)物用1.5%凝膠電泳后，使用Alpha凝膠成像系統(tǒng)顯影。以GAPDH為內(nèi)參，計(jì)算IFNγ、IL-13、IL-17A mRNA相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠肺臟組織淋巴細(xì)胞中ILCs及其亞群比例比較 見表1。

表1 各組小鼠肺臟組織淋巴細(xì)胞中ILCs及其亞群比例比較

注：與對(duì)照組相比，△P<0.05，*P<0.01；與低溫模型組相比，▲P<0.05，#P<0.01。

2.2 各組小鼠肺臟組織IFNγ、IL-13、IL-17A mRNA表達(dá)比較 見表2。

3 討論

ILCs多分布于肺臟，是肺組織防御感染、維持組織穩(wěn)定的重要細(xì)胞[8]。ILC1在胞內(nèi)病原體感染的免疫過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，如在弓形蟲感染的小鼠體內(nèi)是IFNγ和TNF的主要來源，并有招募炎性髓細(xì)胞控制感染的作用[9]。ILC2具有拮抗蠕蟲感染和促進(jìn)呼吸道炎癥反應(yīng)等作用[10]。ILC3可在小鼠胞外細(xì)菌或真菌感染過程中快速響應(yīng)，通過產(chǎn)生IL-17A、IL-22等細(xì)胞因子促進(jìn)趨化因子CXCL1、CXCL9等的表達(dá)，增強(qiáng)宿主的固有免疫能力[11,12]。因此，維持ILC亞群的組織含量與功能穩(wěn)定，對(duì)保持肺組織局部固有免疫功能具有重要意義。寒冷季節(jié)急、慢性呼吸系統(tǒng)疾病的入院率明顯升高[13]，說明低溫環(huán)境顯著影響肺臟免疫功能。本研究發(fā)現(xiàn)，低溫環(huán)境下小鼠肺組織ILCs及其ILC1、ILC2和ILC3亞群的比例顯著下降，ILC亞群特征性細(xì)胞因子IFNγ、IL-13及IL-17A的表達(dá)水平下降，與肺組織ILCs含量整體水平下降密切相關(guān)，說明低溫可降低肺臟固有免疫功能。低溫導(dǎo)致肺臟黏膜免疫穩(wěn)態(tài)被破壞，抗菌、抗病毒和抗炎等功能受到抑制，不僅直接影響肺組織的ILCs免疫穩(wěn)態(tài)，還可進(jìn)一步影響T細(xì)胞主導(dǎo)的適應(yīng)性免疫應(yīng)答能力，造成機(jī)體整體免疫力下降，是低溫狀態(tài)下肺臟感染性疾病和哮喘等疾病發(fā)生發(fā)展的重要原因。

表2 各組小鼠肺臟組織IFNγ、IL-13、IL-17A mRNA表達(dá)比較

注：與對(duì)照組相比，*P<0.01；與低溫模型組相比，▲P<0.05，#P<0.01。

玉屏風(fēng)散出自《丹溪心法》，為中醫(yī)扶正固表之明方[14]。玉屏風(fēng)散可以通過調(diào)控Th1/Th2平衡有效防治流行性感冒和治療慢性支氣管炎等呼吸系統(tǒng)疾病。另有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床研究證明，玉屏風(fēng)散可上調(diào)免疫球蛋白含量和血清IgA值，對(duì)呼吸道感染有防治作用[15]。以往研究多集中于玉屏風(fēng)散對(duì)機(jī)體整體免疫的作用機(jī)理，對(duì)肺臟局部免疫微環(huán)境的藥理研究較少。玉屏風(fēng)散對(duì)肺臟的保護(hù)效應(yīng)與組方中藥的功效密不可分。黃芪能夠提高胸腺和脾臟內(nèi)T細(xì)胞數(shù)目，提升干擾素分泌能力和免疫球蛋白水平[16]。白術(shù)可上調(diào)Th細(xì)胞數(shù)、糾正T細(xì)胞亞群紊亂，可改善機(jī)體代謝狀態(tài)、增強(qiáng)免疫功能、抵抗應(yīng)激反應(yīng)等[17]。防風(fēng)具有抗炎、解痙的作用，常用于治療發(fā)熱、風(fēng)濕、頭痛和驚厥等病癥。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，低溫模型組較對(duì)照組小鼠肺臟組織淋巴細(xì)胞中ILCs、ILC1、ILC2、ILC3比例低，IFNγ、IL-13、IL-17A mRNA表達(dá)低；玉屏風(fēng)散組較低溫模型組小鼠肺臟組織淋巴細(xì)胞中ILCs、ILC1、ILC2、ILC3比例高，IFNγ、IL-13、IL-17A mRNA表達(dá)高。可見，玉屏風(fēng)散可逆轉(zhuǎn)低溫環(huán)境對(duì)肺臟ILCs及其功能因子的抑制作用，這為低溫狀態(tài)下呼吸系統(tǒng)疾病的防治提供了新的理論依據(jù)。

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Influence of Yupingfeng powder on proportion and function of lung-resident innate lymphoid cells in mice under hypothermia

ANLei1,GUOYuqi,WANGLi,SUNXiaoyan,LYVYanmin,LANHongyun,YAOChengfang

(1JinanUniversity,ShandongAcademyofMedicalSciences,Jinan250062,China)

Objective To observe the influence of Yupingfeng powder on the proportion and function of lung-resident innate lymphoid cell subsets (ILCs) in mice under hypothermia.Methods Twenty-four C57BL/6 mice were randomly divided into three groups: the control group, the hypothermia model group, and the group of Yupingfeng powder (YPF group). The mice in the control group were not given any treatment. The mice from hypothermia model group and YPF group were both exposed to a cold condition (10℃±1℃ ) in a cryogenic vessel, 3 h/d, for 3 days. The mice of the YPF group were given YPF on day 7 before cold exposure until the end of the experiment. ILCs, and its three subsets (ILC1, ILC2, and ILC3) in lung lymphocytes were detected by flow cytometry. The expression of IFNγ, IL-13, and IL-17A was detected by RT-PCR. Results Compared with the control group, the proportions of ILCs, ILC1, ILC2, and ILC3 were lower in the hypothermia model group (allP<0.05) as well as the mRNA expression of IFNγ, IL-13, and IL-17A (allP<0.01). Compared with the hypothermia model group, the proportions of ILCs, ILC1, ILC2, and ILC3 were higher in the YPF group (allP<0.05), as well as the mRNA expression of IFNγ, IL-13, and IL-17A (allP<0.05). Conclusions Yupingfeng powder may reverse the inhibitory effect of hypothermia on ILCs and the functional factors in lung tissues.

hypothermia; innate lymphoid cells; lung; Yupingfeng powder; traditional Chinese drugs

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81573728)；山東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(ZR2015HM007)。

安磊(1990-)，男，在讀碩士研究生，主要從事中醫(yī)藥免疫的研究。E-mail： fufu126@sina.com

姚成芳(1966-)，女，博士后，研究員，碩士生導(dǎo)師，主要從事中醫(yī)藥免疫的研究。E-mail： yaocf9941@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.22.004

R392

A

1002-266X(2017)22-0012-03

2017-02-03)