周永年，戎建榮，栗子洋，王瑞雪

(山西大醫(yī)院，山西 太原 030032)

山西大醫(yī)院金黃色葡萄球菌SCCmec型別分析

周永年，戎建榮*，栗子洋，王瑞雪

(山西大醫(yī)院，山西 太原 030032)

目的：分析耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)的耐藥特點。方法：采用Vitek-2 compact和Micro2flexTM MALDI-TOF MS對實驗菌株進(jìn)行鑒定和藥物敏感試驗；采用紙片法和最低抑菌濃度(MIC)法對實驗菌株進(jìn)行MRSA初篩和確證試驗；采用基因擴(kuò)增法對MRSA進(jìn)行mecA 基因擴(kuò)增及SCCmec基因分型。結(jié)果：65株初篩陽性的MRSA菌株，經(jīng)PCR基因擴(kuò)增后全部攜帶mecA基因。5種型別SCCmec分型結(jié)果：SCCmecⅠ(產(chǎn)物大小 613bp )無陽性；SCCmecⅡ(產(chǎn)物大小398bp)陽性菌株7株：標(biāo)本號分別為20、27、29、31、33、52、53；SCCmec Ⅲ(產(chǎn)物大小280bp)陽性菌株16株：標(biāo)本號分別為1、2、7、8、10、12、19、23、26、30、32、34、38、41、47、54； SCCmec IVa(產(chǎn)物大小 776bp)陽性菌株1株：標(biāo)本號為20。SCCmec Ⅳb型(產(chǎn)物大小493bp)、SCCmec Ⅳc (產(chǎn)物大小200bp) 、 SCCmecⅣd (產(chǎn)物大小881bp )和 SCCmec V (產(chǎn)物大小 325bp) 擴(kuò)增后均無陽性菌株。結(jié)論：65株MRSA均表現(xiàn)為多重耐藥，其中對青霉素、苯唑西林和頭孢西丁全部耐藥；對萬古霉素和利奈唑胺全部敏感。65株MRSA 全部攜帶mecA 基因。SCCmec基因型以SCCmec Ⅲ型為主，其次是SCCmec Ⅱ型和SCCmec Ⅳa型。

耐甲氧西林金黃色葡萄球菌；基因擴(kuò)增；SCCmec基因型別

耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)是人類主要致病菌之一，MRSA菌株是由對甲氧西林敏感的葡萄球菌逐漸演變而來，其耐藥形成主要是原來的敏感菌株獲得了攜帶mecA基因染色體mec基因盒(SCCmec)的耐藥基因[1]。耐甲氧西林金黃色葡萄球菌克隆株可以根據(jù)SCCmec種類和基因型別分類[2]，對分離于醫(yī)院和社區(qū)的MRSA菌株進(jìn)行基因分型，可以為流行病學(xué)研究和合理使用抗生素提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 收集2012 ～2012 年從山西大醫(yī)院常規(guī)鑒定為金黃色葡萄球菌的菌株65株。所有菌株均分離于門診或住院患者各類臨床標(biāo)本，其中包括痰液、血液、膿液、腦脊液、引流液、分泌物等。所有實驗菌株為非重復(fù)性菌株，去除臨床信息不全后的35研究菌株，采用實驗室傳統(tǒng)方法進(jìn)行鑒定和MRSA初篩試驗。實驗確認(rèn)的MRSA再經(jīng)DNA提取和相應(yīng)MRSA基因擴(kuò)增檢測確證。質(zhì)控菌株金黃色葡萄球菌ATCC25923、ATCC29213均購自國家衛(wèi)計委臨床檢驗中心。

1.1.2 儀器和試劑 Vitek-2 compact 及配套的革蘭陽性鑒定卡(GP)購自法國Bio Merieux 公司， Micro2flexTM MALDI-TOF MS 儀購自：美國布魯克公司；聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerasechainreaction，PCR)儀購置伯樂公司；凝膠成像儀：伯樂公司；DNA 測序儀使用上海生物工程公司產(chǎn)品；顯微鏡；主要試劑：基因測序擴(kuò)增試劑盒購自上海生物工程公司；巧克力平板、羊血平板、伊紅美藍(lán)平板購自天津金章生物制品公司；革蘭染液，觸媒試劑； 血漿凝固酶試劑；頭孢西丁、苯唑西林藥敏紙片等購置于法國梅里埃生物有限公司。

1.2 方法

1.2.1 金黃色葡萄球菌鑒定和MRSA 篩選與確證試驗 采用M-H紙片擴(kuò)散法、MIC 法對金黃色葡萄球菌菌株進(jìn)行 MRSA 篩選和確證。質(zhì)控菌株為分別為金黃色葡萄球菌 ATCC29213和ATCC25923，作為陰性和陽性對照菌。

1.2.2 金黃色葡萄球菌初步鑒定和MRSA初篩試驗 試驗程序根據(jù)美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化委員會 (NCCLS) 推薦的鑒定和藥敏方法進(jìn)行。

1.2.3 MRSA表型確證試驗 用苯唑西林E-test MIC試紙條測定待測菌株的MIC，如 MIC ≥ 4μg/mL即判為 MRSA。

1.2.4 MRSA基因擴(kuò)增 mecA基因和SCCmec基因型別擴(kuò)增；引物由山西賽奧生物科技有限公司合成，mecA基因擴(kuò)增電泳圖(2% agarose electrophoresis)所用引物序列、產(chǎn)物大小、反應(yīng)體系、擴(kuò)增條件及凝膠成像，見表1。

表1 實驗所用部分引物序列及擴(kuò)增產(chǎn)物大小

1.2.5 PCR反應(yīng)體系 25μL反應(yīng)體系包括DNA模扳1.5μL； F- Primer (10μM)1.0μL； Primer-R(10μM) 1.0μL；2.5mM dNTPs2.0μL；GC enhance 1.5μL；10×Buffer 2.5μL；TaqDNA(5U/μl)0.4μL。加ddH2O 15.1μL補充至總反應(yīng)體系為25μL。

1.2.6 PCR反應(yīng)條件 94℃ 預(yù)變性5min，94℃ 變性 30 s，53℃退火 30 s，72℃ 延伸 30 s， 變性、退火 、延伸35個循環(huán)周期，72℃再延伸10 min，4℃保存。

1.2.7 電泳及成像 擴(kuò)增產(chǎn)物電泳上樣之前，用0.5×TBE電泳緩沖液充分浸泡凝膠，然后再將子量大小為1 000 bp的分子量標(biāo)記(DNA Marker)加到上樣孔中，將10μL P產(chǎn)物與2μL Loading Buffer充分混勻后，上樣到含EB的1%瓊脂糖凝膠的上樣孔中，將上樣產(chǎn)物端凝膠置于電源負(fù)極，接通電源，穩(wěn)壓60V，電泳60 min。電泳結(jié)束后，于凝膠成像系統(tǒng)下成像并保存記錄圖像。

2 結(jié)果

2.1 金黃色葡萄球菌鑒定結(jié)果

MicroflexTM MALDI-TOF MS對金黃色葡萄球菌的鑒定率為 100%；Vitek-2 Compact對葡萄球菌的鑒定率為97.14%。66株實驗菌株中，65株鑒定為金黃色葡萄球菌，一株鑒定為溶血葡萄球菌。

2.2 MRSA表型初篩和確證結(jié)果

采用苯唑西林(OX)和頭孢西丁(FOX)紙片擴(kuò)散法檢測MRSA初篩試驗，65株實驗菌株全部陽性；采用苯唑西林E-test MIC試紙條檢測實驗菌株的MIC，確證MRSA，65株實驗菌株全部陽性。

2.3 MRSA分離菌株藥物敏感試驗結(jié)果(見表2)

表2 65株MRSA對常用抗菌藥物的藥物敏感試驗結(jié)果

2.4 MRSA分離菌株mecA 基因擴(kuò)增結(jié)果

65株實驗菌株mecA 基因擴(kuò)增全部陽性，采用引物為mA1, 擴(kuò)增基因為mecA, 擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小為 286bp, 條帶長度與預(yù)期片段產(chǎn)度一致，其序列位于基因庫中AB033763的32433-32453bp。擴(kuò)增產(chǎn)物見圖1。

圖1 MRSA分離菌株mecA 基因擴(kuò)增結(jié)果

注：mecA基因擴(kuò)增電泳圖(1% agarose electrophoresis)Lane M: 2kb DNA Maker; Lame1-65: mecA gene-positive amplification products, size 286bp。M: 1kb DNA Maker; Lame1-51: mecA products size 286bp。 擴(kuò)增陽性標(biāo)本：1-65號標(biāo)本

2.5 SCCmec TypeI、SCCmec TypeII和SCCmec TypeIII型SCCmec基因分型結(jié)果(見圖2～4)

圖2 mecA分型中SCCmec Type I、SCCmec TypeII、SCCmec TypeIII型基因分型結(jié)果

注： I型 產(chǎn)物大小 613bp 擴(kuò)增陽性：無陽性； II型 產(chǎn)物大小398bp 擴(kuò)增陽性：20、27、29、31、3352、53；III型 產(chǎn)物大小280bp擴(kuò)增陽性:1、2、7、8、10、12、19、23、26、30、32、34、38、41、47、54。

圖3 mecA分型中SCCmec Type IV型基因分型結(jié)果

基因型： IVa型 產(chǎn)物大小 776bp 擴(kuò)增陽性：20；IVb型 產(chǎn)物大小493bp 擴(kuò)增陽性：無陽性；IVc型 產(chǎn)物大小200bp擴(kuò)增陽性: 無陽性; IVd型 產(chǎn)物大小881bp 擴(kuò)增陽性：無陽性。

圖4 mecA分型中SCCmec Type V型基因分型結(jié)果

3 討論

本研究顯示MRSA對β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物耐藥的同時，對氨基糖苷類、林可霉素、氯霉素、大環(huán)內(nèi)酯類及喹諾酮類等抗菌藥物的敏感性也呈明顯下降趨勢。由于耐藥率不斷增加、耐藥譜迅速擴(kuò)大，準(zhǔn)確鑒定金黃色葡萄球菌、對其耐藥基因MRSA 進(jìn)行檢測具有非常重要的意義。

金黃色葡萄球菌為臨床常見的病原菌，具有較強(qiáng)的致病力，可以引起皮膚軟組織感染、血流感染及全身各臟器感染。據(jù)國內(nèi)外報道，金黃色葡萄球菌引起的感染中，MRSA 占到約40%～80%[3]。我國多個醫(yī)院監(jiān)測結(jié)果顯示MRSA的臨床分離率呈上升趨勢，檢出率52%～68%，甚至高達(dá)84.4%[4]。MRSA治療難度大，病死率高，已成為醫(yī)院感染中的嚴(yán)重問題。

甲氧西林耐藥的金葡菌都攜帶有mecA基因，但其耐藥程度卻不一致，MecA基因位于一個可移動的元件上，被稱為金黃色葡萄球菌染色體基因盒SCCmec。通過多位點序列分型，已經(jīng)確定了8個SCCmec基因型[3]。醫(yī)院獲得性感染耐甲氧西林金葡菌(HA-MRSA)通常是耐藥菌株攜帶SCCmecⅠ、Ⅱ、Ⅲ型，而社區(qū)獲得性耐甲氧西林金葡萄菌(CA-MRSA)感染通常是Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ型。

本研究數(shù)據(jù)顯示，65株初篩陽性的MRSA菌株經(jīng)PCR基因擴(kuò)增后全部攜帶mecA基因。5種型別SCCmec分型結(jié)果以SCCmec Ⅲ型為主(產(chǎn)物大小280bp)，陽性菌株16株。其次為SCCmecⅡ型(產(chǎn)物大小398bp)，陽性菌株7株。SCCmec Iva型(產(chǎn)物大小 776bp)陽性菌株1株。 SCCmecⅠ型、SCCmecⅣb型(產(chǎn)物大小493bp)、SCCmec Ⅳc (產(chǎn)物大小200bp) 、SCCmecⅣd (產(chǎn)物大小881bp )和 SCCmec V (產(chǎn)物大小 325bp) 擴(kuò)增后均無陽性菌株。確證為MRSA，但無SCCmec分型擴(kuò)增產(chǎn)物的菌株，推測可能為高產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶有關(guān)，有待進(jìn)一步研究證實。

研究耐藥基因的表達(dá)水平與抗菌藥物之間的關(guān)系，有利于從分子生物學(xué)水平闡明細(xì)菌耐藥機(jī)制。對于MRSA感染發(fā)展新的抗菌藥物主要障礙是需要明確新的分子靶點。同時，現(xiàn)存的有效對抗MRSA的抗菌藥物類別提供了一系列的對于大多數(shù)MRSA感染的治療方式。金黃色葡萄球菌可能會產(chǎn)生對于耐藥基因的所有抗菌藥物的耐藥性。因此，其鑒定與研究可以為感染診斷和有效治療方法提供科學(xué)依據(jù)。

[1] Y. Katayama,T. Ito,K. Hiramatsu. A New Class of Genetic Element,Staphylococcus Cassette Chromosome Mec(SCCmec), Encodes Methicillin Resistance in Staphylococcus Aureus[J].Antimicroblal Agents and Chemotherapy,2000，44：1549-1555.

[2] Shore. A., A. S. Rossney, C. T. Keane, et al. Coleman.Seven novel variants of the staphylococcal chromosomal cassette mec in methicillin-resistant Staphylococcus aureus isolates from Ireland.Antimicrob[J].Agents Chemother,2005，49:2070-2083.

[3] Bouchei HW, Corey GR. Epidemiology of methicillin-resistant Staphylococcus aureus[J].Clin Infect Dis, 2008, 46: 344-349.

[4] Consolidating and Exploring Antibiotic Resistance Gene Data ResourcesJ[J].Clin. Microbiol，2016，54(4):851-859.

本文編輯：王知平

山西省科技廳基礎(chǔ)研究項目 (2013011060-1 )

周永年，男，副主任技師，從事臨床檢驗工作

戎建榮，男，主任技師，碩士生導(dǎo)師，E-mail：13593181596@163.com

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1671-0126(2017)03-0019-04