續(xù) 琳

(山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院，山西 太原 030001)

·基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)·

SF3B1在急性髓系白血病中的表達(dá)

續(xù) 琳

(山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院，山西 太原 030001)

目的：探討SF3B1突變在急性髓系白血病中的發(fā)生情況。方法：利用HRMA和DNA直接測序分析65例急性髓系白血病的SF3B1的突變熱點。結(jié)果： 在AML中存在SF3B1雜合突變，通過DNA直接測序發(fā)現(xiàn)1例K666T，1例K700E突變,1例同時具有NPM1和DNMT3A 突變，1例具有DNMT3A和FLT3-ITD突變。結(jié)論：SF3B1突變在AML中罕見。

SF3B1；急性髓系白血病；基因突變

急性髓系白血病(Acute myeloidleukemia， AML)是一類源于造血干祖細(xì)胞的惡性克隆性疾病，因干祖細(xì)胞分化受阻或?qū)φ５姆只{(diào)節(jié)反應(yīng)異常，導(dǎo)致骨髓或外周血中不成熟細(xì)胞增多。近年，關(guān)于和白血病相關(guān)的基因突變被陸續(xù)發(fā)現(xiàn)，其中有部分基因突變被證實和疾病的進(jìn)展及預(yù)后相關(guān)[1]。有些被作為世界衛(wèi)生組織對白血病進(jìn)行分型的依據(jù)[2]。

轉(zhuǎn)錄本的選擇性剪接可以發(fā)生于不同的腫瘤中[3]，然而關(guān)于其在腫瘤中的致病機(jī)制卻不清楚。血液腫瘤細(xì)胞剪接體基因的體細(xì)胞突變近來被認(rèn)知[4]。RNA剪接因子3B第1亞單位(splicing factor 3B subunit 1，SF3B1)基因RNA 剪接過程中起著重要的作用，其主要由5個小核糖核蛋白(snRNP) 復(fù)合體組成，包括U1、U2、U3、U4、U5、U6等。其中，SF3B1編碼的蛋白是U2snRNP的一個組成部分。RNA的正常剪接是基于精準(zhǔn)識別外顯子-內(nèi)含子交界處的位點，然而當(dāng)剪接體組份突變時，會導(dǎo)致所翻譯蛋白質(zhì)的改變，從而導(dǎo)致剪接亞型變異和疾病的發(fā)生[5]。研究發(fā)現(xiàn)6.5%～28.1%的骨髓增生異常綜合征(myelodysplastic syndrome， MDS)和5%～15%的慢性淋巴細(xì)胞白血病(chronic lymphocytic leukemia，CLL)存在SF3B1的基因突變[4]，共有4個突變熱點，分別是密碼子E622，H662，K666和 K700。并且還發(fā)現(xiàn)，具有SF3B1突變的CLL預(yù)后不良[6]，而在MDS中的預(yù)后價值卻存在爭議[4]。而關(guān)于SF3B1在AML中的發(fā)生情況卻鮮有報道，故本文將利用HRMA法探索SF3B1在AML中發(fā)生情況。

1 資料和方法

1.1 一般資料

65例初診急性髓系白血病的骨髓標(biāo)本來源于山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院2016年5～12月的住院患者，男40例，女25例，中位年齡32歲。所有患者的診斷根據(jù)FAB和2008年世界衛(wèi)生組織的診斷指南確診[2]。

1.2 方法

使用蔗聚糖基質(zhì)的密度梯度離心法分離骨髓標(biāo)本的單個核細(xì)胞，使用DNA提取試劑盒提取骨髓標(biāo)本DNA，操作參照試劑盒說明書執(zhí)行。 在25μL體積存在下，用1×PCR緩沖，0.25 mmol / L的每個dNTP，2.5 mmol/L MgCl2，0.8μmol/L正向和反向引物，1 UTaq 酶(寶生物，大連)和50 ng基因組DNA。PCR反應(yīng)使用ABI7300PCR儀。見表1 。

表1 SF3B1 引物序列及反應(yīng)條件

PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到LightScanner(美國)進(jìn)行高分辨率溶解曲線分析法(High-resolution melting analysis，HRMA)分析，平板以0.10°C/s 的加熱速度從55°C 加熱到 95°C，利用儀器自帶的分析軟件，對溶解曲線進(jìn)行分析。FLT3-ITD、NPM1突變檢測按文獻(xiàn)中方法執(zhí)行[5]。

2 結(jié)果

樣品表現(xiàn)出光滑和對稱的熔融曲線表示野生型純合子SF3B1。3個樣本(4.6%)存在復(fù)雜的熔解曲線形狀的變化，表明為雜合性突變。核苷酸的變化分別為C1997A>C(AAG→ACG，K666T)，C1998G>C(AAG→AAC，K666N)，和C2098A>G(AAA→GAA，K700E)，分別為圖1。3例患者的臨床特點SF3B1突變?nèi)绫?所示。

表2 3例SF3B1突變患者的臨床及實驗室參數(shù)

注：M 男性，NA 沒有數(shù)據(jù)，RS 環(huán)形鐵粒幼紅細(xì)胞。

A: K666T (C1997A>C) 和K666N (C1998G>C)突變;

B: K700E (C2098A>G) 突變; WT 野生型; 直線代表突變密碼子; 箭頭指示突變位點。

圖1 SF3B1的DNA測序結(jié)果

Fig1 Results of SF3B1DNA Direct Sequencing

3 討論

在本研究中， SF3B1突變在AML有非常低的發(fā)生。此外，在檢測SF3B1K666T時 HRMA的最大靈敏度可達(dá)5%，高于直接DNA測序(10%)。雖然有報道顯示，SF3B1突變與環(huán)形鐵粒幼細(xì)胞(RS)相關(guān)，在AML的突變率為(2.6%～5%)[4]，原發(fā)性血小板增多癥(3%)，原發(fā)性骨髓纖維化(4%～6.5%)[7]，慢性粒細(xì)胞白血病(4.5%～6.5%[4，7]，乳腺癌(1%)，腎腫瘤(3%)，多發(fā)性骨髓瘤(3%)，和腺樣體囊性癌(4%)[7]。

研究中發(fā)現(xiàn)有突變的3例患者均為正常核型，1例有NPM1和DNMT3A突變，1例FLT3-ITD和DNMT3A突變。這與達(dá)姆等[8]報道的SF3B1基因突變與DNMT3A突變有關(guān)系(35%患者有SF3B1突變伴隨DNMT3A突變)，相一致。最近，在大樣本研究中發(fā)現(xiàn)，16%(44 / 275)的AML患者有SF3B1突變[9]。在RS≥15%患者有約31%的患者有SF3B1突變，在48.9%正常核型病例中有≥15%的鐵粒幼細(xì)胞。此外還發(fā)現(xiàn)，SF3B1突變與年齡、M2和M4、FLT3-ITD,RUNX1等基因相關(guān)[9]。

因隨訪數(shù)據(jù)不足，SF3B1基因突變對AML預(yù)后的影響，在本研究中無法明確。目前有關(guān)SF3B1基因突變對預(yù)后的影響的有關(guān)報道相互矛盾[10]。

綜上所述， SF3B1在AML患者突變頻率很低。而SF3B1突變和其他基因突變的關(guān)系及在預(yù)后評價中的價值卻有待進(jìn)一步研究。

[1] 孫妍珺.急性髓細(xì)胞白血病DNMT3A基因突變的臨床研究[D]．蘇州：蘇州大學(xué)，2016.

[2] 馬 軍，趙東陸.WHO 2016(修訂版)急性髓系白血病分型解讀[J]．臨床血液學(xué)雜志，2017,30(3)：169-171.

[3] 徐敏杰，竇同海，徐佳熹.癌癥相關(guān)基因選擇性剪接進(jìn)化數(shù)據(jù)庫的構(gòu)建[J]．復(fù)旦學(xué)報(自然科學(xué)版)，2016，55(5)：649-659.

[4] Maciejewski JP, Padgett RA. Defects in Spliceosomal Machinery: a new pathway of leukaemogenesis[J]. Br J Haematol,2012,158：165-173.

[5] Yokoi A，Kotake Y，Takahashi K，et al． Biological Validation that SF3b is a Target of the Antitumor Macrolide Pladienolide[J]．FEBS J，2011，278(24): 4870-4880．

[6] Rossi D, Bruscaggin A, Spina V, et al. Mutations of the SF3B1 Splicing Factor in Chronic Lymphocytic Leukemia: association with progression and fludarabine-refractoriness[J]. Blood，2011，118：6904-6908.

[7] Papaemmanuil E, Cazzola M, Boultwood J, et al.Somatic SF3B1 Mutation in Myelodysplasia with Ring Sideroblasts[J]. N Engl J Med，2011，365:1384-1395.

[8] Damm F, Kosmider O, Gelsi-Boyer V, et al. Mutations Affecting mRNA Splicing Define Distinct Clinical Phenotypes and Correlate with Patient Outcome in myelodysplastic syndromes[J].Blood，2012，119：3211-3218.

[9] Jeromin S, Bacher U, Bayer K, et al. SF3B1 Mutations Aredetectable in 48.9% of Acute Myeloid Leukemia with Normal Karyotype (AML-NK)and ≥15% Ring Sideroblasts are Closely Related to FLT3-ITD and RUNX1 Mutations[J].Blood，2012，120:406.

[10] Malcovati L, Papaemmanuil E, Bowen DT, et al. Clinical Significance of SF3B1 Mutations in Myelodysplastic Syndromes Andmyelodysplastic/myeloproliferative Neoplasms[J].Blood,2011,118：6239-6246.

本文編輯：王知平

統(tǒng)計學(xué)符號的書寫

Expression of SF3B1in Acute Myeloid Leukemia

XU Lin

(TheSecondHospitalofShanxiMedicalUniversity,Taiyuan030001,ShanxiProvince,China)

Objective: To investigate the occurrence of SF3B1mutation in acute myeloid leukemia.Methods:SF3B1mutation hot spots of 65 cases of acute myeloid leukemia were analysed using high resolution melting analysis (HRMA) and DNA direct sequencing.Results:In the AML, the SF3B1heterozygotic mutation was found. By sequencing the DNA directly, 1 case K666T, 1 case of the K700E mutation, 1 case with NPM1and DNMT3A mutation, and 1 with DNMT3A and FLT3-ITD mutation were also founded. Conclusions:SF3B1mutation is rarely found in AML.

SF3B1; acute myeloid leukemia; genetic mutations

續(xù) 琳，女，工程師，從事醫(yī)療設(shè)備工作

R733.3

A

1671-0126(2017)03-0001-03