劉 青, 牛 茹, 井松梅

(江蘇省徐州市中心醫(yī)院, 1. 婦科; 2．肛腸科; 3. 骨科, 江蘇 徐州, 221009)

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RNA干擾核糖核苷酸還原酶M2對耐藥卵巢癌細(xì)胞凋亡及侵襲性的影響

劉 青1, 牛 茹2, 井松梅3

(江蘇省徐州市中心醫(yī)院, 1. 婦科; 2．肛腸科; 3. 骨科, 江蘇 徐州, 221009)

目的 探討RNA干擾核糖核苷酸還原酶M2(RRM2)對耐藥卵巢癌細(xì)胞凋亡及侵襲性的影響。方法 將RRM2基因的特異性小干擾(siRNA)轉(zhuǎn)染SKOV3/DDP設(shè)為干擾組, SKOV3/DDP細(xì)胞、SKOV3/DDP-RRM2非特異性陰性細(xì)胞設(shè)為空白組、陰性組。檢測細(xì)胞增殖抑制率，計算RI、耐藥轉(zhuǎn)染率，熒光PCR技術(shù)檢測RRM2基因mRNA表達(dá)，并分析siRNA轉(zhuǎn)染對SKOV3/DDP耐藥指數(shù)、RRM2蛋白的影響，采用Transwell觀察SKOV3/DDP細(xì)胞侵襲能力。結(jié)果 空白組、陰性組及干擾組轉(zhuǎn)染率均>90%。DDP對SKOV3/DDP細(xì)胞屬低度耐藥，吉西他濱對SKOV3/DDP細(xì)胞仍較為敏感。DDP、吉西他濱對干擾組、陰性組、空白組的DDP對細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(IC50)值比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05), DDP、吉西他濱對干擾組細(xì)胞的IC50值顯著低于陰性組、空白組(P<0.05)。SKOV3/DDP細(xì)胞、SKOV3細(xì)胞RRM2蛋白的相對表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，且轉(zhuǎn)染Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組相對表達(dá)量均顯著低于陰性組、空白組，其中以轉(zhuǎn)染Ⅰ組細(xì)胞的RRM2蛋白相對表達(dá)量下降最顯著(P<0.05)。干擾組細(xì)胞凋亡率顯著高于空白組、陰性組，穿膜細(xì)胞數(shù)顯著低于空白組、陰性組(P<0.05)。結(jié)論 siRNA可有效抑制RRM2基因在卵巢癌中的增殖與侵襲性，增加耐藥細(xì)胞的藥物敏感性，尤其是促進(jìn)DDP誘導(dǎo)的耐藥細(xì)胞凋亡。

siRNA; 核糖核苷酸還原酶M2; 卵巢癌; 耐藥; 細(xì)胞凋亡

卵巢上皮性癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，其致死率在婦科腫瘤中居首位，發(fā)病率僅次于子宮頸癌和子宮體癌，近年來其臨床發(fā)病呈低齡化趨勢，卵巢癌患者的5年存活率較低，而及早診斷與治療對改善患者生存質(zhì)量及延長生存期至關(guān)重要[1-2]。在臨床實際中，由于卵巢癌患者早期無典型癥狀，確診時多數(shù)已至晚期，手術(shù)、放化療雖可取得一定的療效，但目前手術(shù)切除率仍較低，放化療毒副作用大，卵巢癌的生存率不容樂觀(5年僅為30%左右)[3-5]。目前卵巢癌的治療仍以減瘤術(shù)聯(lián)合鉑類為主的化療綜合方案，但患者經(jīng)初次治療后有60%以上的患者可復(fù)發(fā)。目前化學(xué)藥物抗腫瘤治療作用機(jī)制主要為誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[6]。卵巢癌細(xì)胞對放、化療的效果主要受其發(fā)生細(xì)胞死亡的傾向的影響，故認(rèn)為卵巢癌治療失敗的主要原因為癌細(xì)胞對藥物所致凋亡的抵抗性和獲得性耐藥。核糖核苷酸還原酶M2(RRM2)基因在眾多惡性腫瘤中過表達(dá)，作為細(xì)胞凋亡的主要調(diào)控基因之一，其活性高低與惡性腫瘤的生長和浸潤能力呈正相關(guān)，與腫瘤耐藥的形成亦有密切關(guān)系[7]。本研究探討通過RNA干擾(RNAi)RRM2對耐藥卵巢癌細(xì)胞凋亡及侵襲性的影響，現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

卵巢癌細(xì)胞株SKOV3產(chǎn)自北京北納生物科技有限公司，耐順鉑的卵巢癌細(xì)胞SKOV3/DDP采用間歇濃度梯度遞增法經(jīng)過9個月誘導(dǎo)成功，呈低度耐藥細(xì)胞(耐藥系數(shù)3.6); DMEM-F12細(xì)胞培養(yǎng)液、胰蛋白酶、陽離子脂質(zhì)體Lipofectamine TM2000均購自上海北諾生物科技有限公司; MTT購自美國PMSF: Serva公司，鼠抗人RRM2單克隆抗體購自美國novus公司; 順怕(DDP)購自山東齊魯制藥有限公司，磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)單克隆抗體、辣根過氧化酶標(biāo)記的山羊抗鼠多克隆抗體購自上海博耀生物科技有限公司。

1.2 研究方法

1.2.1 建立耐藥細(xì)胞系SKOV3/DDP: 采用含10%小牛血清的DMEM-F12培養(yǎng)基中培養(yǎng)SKOV3細(xì)胞，置于環(huán)境適宜的(37 ℃、5% CO2)孵箱中培養(yǎng)，觀察細(xì)胞生長情況。以間歇梯度遞增誘導(dǎo)法在6孔板中接種SKOV3細(xì)胞，培養(yǎng)24 h后于6孔板中加入不同終濃度DDP，培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，起始濃度選取能殺死50%細(xì)胞的細(xì)胞半數(shù)抑制濃度(IC50), 即0.5 μg/mL; 細(xì)胞穩(wěn)定生長進(jìn)入指數(shù)期后進(jìn)行胰蛋白酶等傳代2次，然后同一劑量藥物重復(fù)培養(yǎng); 穩(wěn)定后在0.8 μg/mL DDP藥物濃度的培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng); 遞增藥物濃度后再培養(yǎng)，共培養(yǎng)9個月。

1.2.2 MTT法檢測：上述培養(yǎng)于脫藥培養(yǎng)2個月后以MTT法檢測耐藥細(xì)胞在傳代、凍存后耐藥指數(shù)(RI)不變的情況下進(jìn)行實驗。SKOV3/DDP細(xì)胞的RI取對數(shù)生長期SKOV3細(xì)胞、SKOV3/DDP細(xì)胞分別配制單細(xì)胞懸液，并以1×104個/孔接種于96孔板中(終體積200 μL/孔); 于培養(yǎng)24 h后加入不同終質(zhì)量濃度的DDP與吉西他濱，設(shè)置5個復(fù)孔，孔板中加相同終體積的培養(yǎng)液; DDP與吉西他濱作用48 h后，每孔加入新配置的MTT溶液(5 mg/mL), 繼續(xù)培養(yǎng)4 h后去掉上清液; 繼續(xù)每孔加入DMSO(150 μL)后避光低速振蕩至結(jié)晶物溶解; 通過酶聯(lián)免疫檢測法測定各孔的吸光度(波長取570 mm)。細(xì)胞增殖抑制率(%)=[1-(實驗組孔吸光度-調(diào)零孔吸光度)/(空白對照孔吸光度-調(diào)零孔吸光度)]×100%。選用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS 19.0分析并計算DDP對細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(IC50), 并計算RI(RI<5時為低耐藥), RI=IC50(SKOV3/DDP)/IC50(SKOV3)。

1.2.3 脂質(zhì)體介導(dǎo)小干擾RNA(siRNA)轉(zhuǎn)染：根據(jù)RRM2基因序列和siRNA設(shè)計原則，設(shè)計RRM2基因的siRNA序列與非特異性陰性siRNA對照序列，見表1。轉(zhuǎn)染前24 h SKOV3/DDP細(xì)胞取對數(shù)生長期細(xì)胞以6×105個/孔接種于6孔板，待其生長至60%后以siRNA轉(zhuǎn)染，操作嚴(yán)格按照脂質(zhì)體試劑說明書進(jìn)行。

表1 RRM2基因的siRNA序列設(shè)計及非特異性陰性siRNA對照序列設(shè)計

1.2.4 檢測RRM2基因mRNA表達(dá)：于轉(zhuǎn)染后不同時期(24、48、72、96 h)分別提取對數(shù)生長期空白組(SKOV3/DDP細(xì)胞)、陰性組(SKOV3/DDP-RRM2非特異性陰性細(xì)胞)及干擾組(SKOV3/DDP-RRM2-RNAi細(xì)胞)的總RNA, 采用熒光PCR技術(shù)檢測RRM2基因mRNA表達(dá)，以驗證siRNA的干擾效果，引物序列見表2。PCR反應(yīng)條件下40個循環(huán)，采集熒光信號80 ℃ 30 s, 以△△Ct法[6]重復(fù)3次計算RRM2mRNA表達(dá)水平，取平均值。

表2 引物序列及擴(kuò)增基因片斷

1.2.5 卵巢癌細(xì)胞凋亡：對數(shù)生長期細(xì)胞按5×104個/孔接種于6孔板，于轉(zhuǎn)染siRNA 24 h后加入DDP+吉西他濱(濃度10 μg/mL), 采用細(xì)胞凋亡檢測試劑盒和流式細(xì)胞儀于聯(lián)合作用24、48、72、96 h后行細(xì)胞凋亡檢測。

1.2.6 Transwell觀察SKOV3細(xì)胞侵襲能力：于Transwell小室中孔徑為8 μm的聚碳酸酯微孔膜上模擬人工基底膜，轉(zhuǎn)染后6 h消化、離心重懸細(xì)胞，將細(xì)胞懸液接種含趨化因子與培養(yǎng)液的6孔板，然后在Transwell小室37 ℃、5%CO2環(huán)境下孵育24 h, 顯微鏡下觀察穿膜情況。

2 結(jié) 果

2.1 siRNA轉(zhuǎn)染對SKOV3/DDP耐藥指數(shù)的影響

RRM2siRNA轉(zhuǎn)染SKOV3/DDP細(xì)胞后4～6 h,空白組、陰性組及干擾組轉(zhuǎn)染率均>90%。靶向RRM2基因的RNAi使耐藥細(xì)胞對DDP的敏感度上調(diào), MTT檢測結(jié)果顯示, DDP對SKOV3/DDP細(xì)胞的耐藥系數(shù)為3.6，屬低度耐藥，吉西他濱對SKOV3/DDP細(xì)胞PI為1, 仍較為敏感。DDP、吉西他濱對干擾組、陰性組、空白組的IC50值比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05), DDP、吉西他濱對干擾組細(xì)胞的IC50值顯著低于陰性組、空白組(P<0.05)。見表3。

表3 DDP、吉西他濱對SKOV3/DDP細(xì)胞增殖抑制率的影響 μg/mL

與空白組比較, *P<0.05; 與陰性組比較, #P<0.05。

2.2 siRNA轉(zhuǎn)染對RRM2蛋白的影響

SKOV3/DDP細(xì)胞RRM2蛋白的相對表達(dá)量為(0.89±0.05), SKOV3細(xì)胞RRM2蛋白的相對表達(dá)量為(0.39±0.01), 差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=4.12,P<0.05)。轉(zhuǎn)染Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ 組相對表達(dá)量依次為(0.07±0.01)、(0.30±0.01)、(0.13±0.01), 均顯著低于陰性組、空白組相對表達(dá)量(0.72±0.03)、(0.56±0.04)，其中以轉(zhuǎn)染Ⅰ組細(xì)胞的RRM2蛋白相對表達(dá)量下降最顯著(F=8.08,P<0.05)。

2.3 siRNA轉(zhuǎn)染對SKOV3/DDP細(xì)胞凋亡及侵襲性的影響

干擾組細(xì)胞凋亡率顯著高于空白組、陰性組，穿膜細(xì)胞數(shù)顯著低于空白組、陰性組(P<0.05), 空白組、陰性組細(xì)胞凋亡及侵襲性比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表4。

表4 siRNA轉(zhuǎn)染對SKOV3/DDP細(xì)胞凋亡及侵襲性的影響

與空白組比較, *P<0.05; 與陰性組比較, #P<0.05。

3 討 論

多數(shù)用于卵巢癌的化療藥物初用時較為敏感，但隨后卵巢癌細(xì)胞可能通過改變控制凋亡級聯(lián)的分子機(jī)制而產(chǎn)生耐藥，甚至增加治療后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移風(fēng)險[8]。對卵巢癌患者而言，癌細(xì)胞耐藥是影響臨床化療效果不滿意、復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移及死亡率居高不下的重要因素，而提高化療敏感性對促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡至關(guān)重要[9]。早期有研究[10]指出，調(diào)控凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中相關(guān)細(xì)胞內(nèi)的調(diào)控因子有機(jī)會使得腫瘤細(xì)胞對順鉑、吉西他濱等藥物的敏感性增加。

RRM2存在于多數(shù)真核細(xì)胞中，是蛋白質(zhì)翻譯后修飾酶，亦是促進(jìn)DNA合成與修復(fù)的關(guān)鍵限速酶，在生物學(xué)行為中，RRM2對DNA損傷修復(fù)與細(xì)胞凋亡有重要的影響，已有大量臨床薈萃分析[11-13]表明RRM2與癌腫生物學(xué)行為有直接相關(guān)性。尋慶英等[14]檢測到了RRM2在子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)部位和表達(dá)水平均可影響Ishikawa細(xì)胞增殖及侵襲能力，并以基因的mRMA證實其存在著高表達(dá)，并推測可通過阻斷RRM2的表達(dá)來抑制腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和治療效果。目前，RNA干擾技術(shù)是一項特異性抑制基因表達(dá)的成熟方法，又為被稱為基因沉默療法，與傳統(tǒng)的抑制基因功能的治療方案相比，尤其是一些短的雙鏈RNA即 siRNA具有快速、高效、特異地降解相關(guān)基因的mRNA等特點[15]。陳昌賢等[16]的研究亦基于microRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析預(yù)測卵巢癌多藥耐藥的相關(guān)基因。RNA以DNA的一條鏈為模板，具有實現(xiàn)遺傳信息在蛋白質(zhì)上表達(dá)作用，而指外源性或內(nèi)源性的雙鏈RNA與細(xì)胞內(nèi)含有互補(bǔ)序列的mRNA識別并結(jié)合后可在酶的作用下降解mRNA，從而產(chǎn)生干擾相應(yīng)基因表達(dá)、發(fā)揮基因敲除的功能，如卵巢癌SKOV3細(xì)胞侵襲能力和增殖能力可受siRNA干擾的影響，主要與siRNA可有效逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的耐藥性有關(guān)[17]。另一方面，卵巢癌細(xì)胞SKOV3增殖和遷移能力常常與耐藥有關(guān)，在相關(guān)基因?qū)嶒瀃18]中常見報道。本研究中，空白組、陰性組及干擾組轉(zhuǎn)染率均>90%。DDP對SKOV3/DDP細(xì)胞屬低度耐藥，吉西他濱對SKOV3/DDP細(xì)胞仍較為敏感，結(jié)合轉(zhuǎn)染Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ 組SKOV3/DDP細(xì)胞、SKOV3細(xì)胞RRM2蛋白的相對表達(dá)量，可分析卵巢癌SKOV3細(xì)胞RRM2蛋白呈過量表達(dá)，且其與患者耐藥具有密切的關(guān)系，同時選擇有效的基因沉默靶序列對研究該基因的生物學(xué)功能有重要影響。王兆永等[19]分析指出，RRM2蛋白呈過量表達(dá)可預(yù)測腫瘤耐藥性與治療效果不佳，與龍映妃等[20]關(guān)于卵巢癌SKOV3細(xì)胞RRM2表達(dá)的相關(guān)研究結(jié)論一致。

本研究中, SKOV3/DDP細(xì)胞、SKOV3細(xì)胞RRM2蛋白的相對表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05), 且轉(zhuǎn)染Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ 組相對表達(dá)量均顯著低于陰性組、空白組，其中以轉(zhuǎn)染Ⅰ組細(xì)胞的RRM2蛋白相對表達(dá)量下降最顯著(P<0.05)。表明轉(zhuǎn)染RRM2的siRNA轉(zhuǎn)染后可能通過降解靶標(biāo)基因而封閉RRM2基因表達(dá)，并阻斷其活性，從而在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平分別起到抑制RRM2蛋白表達(dá)的作用。DDP、吉西他濱對干擾組、陰性組、空白組的DDP對細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(IC50)值比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05), DDP、吉西他濱對干擾組細(xì)胞的IC50值顯著低于陰性組、空白組(P<0.05)。提示轉(zhuǎn)染RRM2-RNAi可逆轉(zhuǎn)SKOV3/DDP的DDP耐藥性，使細(xì)胞對DDP的敏感性顯著增加，亦說明RRM2在卵巢癌化療耐藥中有負(fù)面作用，因此可作為改善DDP耐藥的治療分子靶點之一。張夢等[21]的實驗亦證實了這一觀點。因此，通過siRNA技術(shù)阻斷RRM2基因在卵巢癌化療DDP耐藥細(xì)胞SKOV3/DDP中的表達(dá)程度，結(jié)果顯示干擾組細(xì)胞凋亡率顯著高于空白組、陰性組，穿膜細(xì)胞數(shù)顯著低于空白組、陰性組(P<0.05)。表明siRNA可有效抑制RRM2基因在卵巢癌中的增殖率與侵襲性，增加其凋亡率，尤其是促進(jìn)DDP誘導(dǎo)的耐藥細(xì)胞凋亡，故有望應(yīng)用于卵巢癌化療并改善耐藥、降低復(fù)發(fā)的一線治療方案。

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Influence of RNA-interfered ribonucleotide reductase M2 on apoptosis and invasion of ovarian cancer cells with drug resistant

LIU Qing1, NIU Ru2, JING Songmei3

(1.DepartmentofGynecology; 2.DepartmentofAnorectalDisease; 3.DepartmentofOrthopedics,XuzhouCentralHospital,Xuzhou,Jiangsu, 221009)

Objective To investigate the influence of RNA-interfered ribonucleotide reductase M2 (RRM2) on apoptosis and invasion of ovarian cancer cells with drug resistant. Methods The specific small interfering (siRNA) transfected SKOV3/DDP of RRM2 gene were designed as the interference group. SKOV3/DDP cells, SKOV3/DDP-RRM2 non-specific negative cells were designed as the blank group and negative group. The cell proliferation inhibition rate was detected, RI and drug resistant transfection rate were calculated, the expression of RRM2 mRNA was detected by fluorescence PCR. The effect of siRNA transfection on SKOV3/DDP resistance index and RRM2 protein was analyzed, and the invasion ability of SKOV3/DDP cells was observed with Transwell. Results The transfection rate of the blank group, negative group and interference group was 90%. The drug resistance of DDPto SKOV3/DDP cells was low and gemcitabine was sensitive to SKOV3/DDP cells. DDP and gemcitabine of the DDP on cell half inhibitory concentration (IC50) values showed significant differences among three groups (P<0.05). IC50values of DDP and gemcitabine on cells in the interference group were significantly lower than the negative group and blank group (P<0.05).The relative expression of SKOV3/DDP cells and SKOV3 cells RRM2 protein showed significantdifferences (P<0.05), and the relative expression was significantly lower in transfection group I, transfection group II and transfection group III than the negative group and blank group (P<0.05). The decrease of relative expression of RRM2 protein was the greatest in the transfection group I (P<0.05). The apoptosis rate was significantly higher in the interference group than the blank group and the negative group, transmembrane cells were fewer than the blank group and the negative group (P<0.05). Conclusion siRNA can effectively inhibit the proliferation and invasion of RRM2 gene in ovarian cancer. It can increase the drug sensitivity of drug resistant cells, especially cells promoting the apoptosis of drug resistant cells induced by DDP.

siRNA; ribonucleotide reductase M2; ovarian cancer; drug resistance; apoptosis

2017-03-16

江蘇省徐州中心醫(yī)院創(chuàng)團(tuán)隊科技項目 (XZS201626)

井松梅

R 737.31

A

1672-2353(2017)13-067-05

10.7619/jcmp.201713018