張 琮 王嘉正 沈玉潔 周明霞 陳穎偉,2#

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院消化內(nèi)科1(200092) 上海市小兒消化與營(yíng)養(yǎng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室2

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自噬誘導(dǎo)劑pp242對(duì)腫瘤壞死因子-α所致腸屏障損傷的影響*

張 琮1王嘉正1沈玉潔1周明霞1陳穎偉1,2#

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院消化內(nèi)科1(200092) 上海市小兒消化與營(yíng)養(yǎng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室2

背景：腸屏障損傷和自噬異常均在炎癥性腸病的發(fā)病中起重要作用，但自噬是否參與腸屏障損傷的發(fā)生、發(fā)展目前尚無(wú)報(bào)道。目的：探討自噬誘導(dǎo)劑pp242對(duì)腫瘤壞死因子-α(TNF-α)所致腸屏障損傷的影響。方法：在Transwell小室中培養(yǎng)Caco-2細(xì)胞制備單層腸上皮屏障模型，并將其隨機(jī)分為對(duì)照組(不給予干預(yù))、TNF-α組(10 ng/mL TNF-α)、pp242組(1 μmol/L pp242)和TNF-α+pp242組(10 ng/mL TNF-α+1 μmol/L pp242)。以跨上皮細(xì)胞電阻(TEER)和FITC標(biāo)記葡聚糖通透性評(píng)估腸上皮屏障功能，蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白LC3B-Ⅱ和p62的表達(dá)情況。結(jié)果：與對(duì)照組相比，TNF-α組TEER顯著降低(P<0.05)，F(xiàn)ITC標(biāo)記葡聚糖通透性顯著升高(P<0.05)，LC3B-Ⅱ和p62蛋白表達(dá)均顯著上調(diào)(P<0.05)。與TNF-α組相比，TNF-α+pp242組TEER顯著升高(P<0.05)，LC3B-Ⅱ蛋白表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.05)，p62蛋白表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.05)。結(jié)論：自噬誘導(dǎo)劑pp242通過(guò)激活自噬流緩解TNF-α所致的腸上皮屏障損傷。

自噬； 腸黏膜屏障； 上皮細(xì)胞； 腫瘤壞死因子α； 炎癥性腸病

炎癥性腸病(inflammatory bowel disease, IBD)是一組病因未明的慢性腸道炎癥性疾病，主要包括潰瘍性結(jié)腸炎(UC)和克羅恩病(CD)，近年來(lái)其發(fā)病率逐漸增高[1]。隨著對(duì)IBD發(fā)病機(jī)制的深入探索，大量研究發(fā)現(xiàn)腸屏障功能受損以及自噬異?？赡茉谄浒l(fā)病中起重要作用[2-3]。自噬是真核細(xì)胞受到內(nèi)外界因素(饑餓、壓力、致病菌等)刺激后通過(guò)溶酶體途徑對(duì)胞內(nèi)受損蛋白、衰老細(xì)胞器等物質(zhì)降解的過(guò)程[4]，其狀態(tài)隨環(huán)境的改變而發(fā)生改變，但對(duì)于IBD腸道炎癥中自噬變化是否參與腸屏障損傷的發(fā)生、發(fā)展，目前尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)將腫瘤壞死因子-α(TNF-α)作用于腸上皮屏障模型體外模擬IBD腸道炎癥環(huán)境，并以自噬誘導(dǎo)劑pp242進(jìn)行干預(yù)，旨在探討自噬改變與IBD腸屏障損傷之間的關(guān)系。

材料與方法

一、細(xì)胞株和主要試劑

人結(jié)直腸腺癌細(xì)胞Caco-2細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)；胎牛血清、非必需氨基酸、青霉素/鏈霉素購(gòu)自Gibco公司；FITC標(biāo)記葡聚糖、兔抗LC3B多克隆抗體購(gòu)自Sigma公司；兔抗p62多克隆抗體購(gòu)自Santa Cruz公司；HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG購(gòu)自上海翊圣生物科技有限公司；Millicell電阻儀和ECL發(fā)光液購(gòu)自Merck Millipore公司；Transwell小室(孔徑為0.4 μm，有效膜面積為0.33 cm2)購(gòu)自Corning公司。

二、研究方法

1. 腸上皮屏障模型的建立：將狀態(tài)良好的Caco-2細(xì)胞以2×105/mL的密度接種于Transwell小室中，使用含10%胎牛血清、10 g/mL非必需氨基酸以及1%青霉素/鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液，在37 ℃、5% CO2的條件下培養(yǎng)。隔日換液，培養(yǎng)7 d后監(jiān)測(cè)跨上皮細(xì)胞電阻(transepithelial electrical resistance, TEER)，電阻穩(wěn)定后行下一步實(shí)驗(yàn)。

2. 細(xì)胞分組：將已構(gòu)建好的腸上皮屏障細(xì)胞模型隨機(jī)分為4組：對(duì)照組不給予干預(yù)；TNF-α組給予10 ng/mL TNF-α培養(yǎng)48 h；pp242組給予1 μmol/L pp242培養(yǎng)24 h；TNF-α+pp242組給予10 ng/mL TNF-α預(yù)處理24 h后再加入1 μmol/L pp242處理24 h。

3. TEER的測(cè)定：藥物處理細(xì)胞模型后除去小室內(nèi)的培養(yǎng)液，Hank平衡鹽溶液(HBSS)沖洗細(xì)胞2遍，吸凈后在上下層小室中加入HBSS并使內(nèi)外液面相齊平，待電阻調(diào)零后，將電阻儀長(zhǎng)短電極分別插入下層小室和上層小室中，讀數(shù)穩(wěn)定后取同一組3個(gè)小室的平均值。由于空白Transwell膜具有一定的電阻值，故標(biāo)準(zhǔn)TEER等于實(shí)際測(cè)得值減去空白對(duì)照值后再乘以Transwell小室的有效膜面積，電阻值單位為Ω·cm2。

4. FITC標(biāo)記葡聚糖通透性測(cè)定：HBSS沖洗細(xì)胞后吸凈殘液，于上層小室加入0.1 mL含1 mg/mL FITC標(biāo)記葡聚糖的HBSS，下層小室加入0.6 mL空白HBSS，37 ℃孵育2 h后收集下層小室液體，上熒光酶標(biāo)儀測(cè)定熒光強(qiáng)度(激發(fā)波長(zhǎng)為480 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為520 nm)，結(jié)果以各組通透量與對(duì)照組通透量的百分比表示。

5. 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)自噬流相關(guān)蛋白表達(dá)：將處理后的細(xì)胞樣本置于含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液中，冰上裂解15 min，離心后所取的上清液即為總蛋白。取等量的蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，隨后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，室溫封閉2 h，加入兔抗LC3B或p62一抗(工作濃度1∶1 000)4 ℃孵育過(guò)夜。次日用PBST洗膜3次，加入二抗(工作濃度1∶5 000)室溫孵育1 h，PBST洗膜3次。ECL發(fā)光液處理后，將膜放入凝膠成像儀中進(jìn)行曝光采圖，應(yīng)用NIH的Image J 1.49v軟件對(duì)蛋白條帶進(jìn)行定量分析。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、各組腸上皮屏障模型TEER的改變

4組間TEER相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=239.85，P<0.001)，以pp242組TEER最高。進(jìn)一步兩兩比較發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，TNF-α組(t=16.19，P<0.05)、TNF-α+pp242組(t=10.39，P<0.05)TEER顯著降低，pp242組顯著升高(t=8.47，P<0.05)，且TNF-α+pp242組TEER又顯著高于TNF-α組(t=5.80，P<0.05)(表1)。

二、各組腸上皮屏障模型FITC標(biāo)記葡聚糖通透性的改變

4組間FITC標(biāo)記葡聚糖通透性相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=319.42，P<0.001)，以TNF-α組最高。進(jìn)一步兩兩比較發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，TNF-α組、TNF-α+pp242組FITC標(biāo)記葡聚糖通透性顯著升高(t=23.40，P<0.05；t=22.21，P<0.05)，而對(duì)照組與pp242組(t=1.95，P>0.05)、TNF-α組與TNF-α+pp242組(t=1.18，P>0.05)之間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)。

三、自噬相關(guān)蛋白LC3B-Ⅱ和p62的改變

4組間LC3B-Ⅱ蛋白表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=40.89，P<0.001)，以TNF-α+pp242組最高。4組間p62蛋白表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=147.14，P<0.001)，以TNF-α組最高。進(jìn)一步兩兩比較發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，TNF-α組(t=6.62，P<0.05)、pp242組(t=8.21，P<0.05)、TNF-α+pp242組(t=10.53，P<0.05)LC3B-Ⅱ蛋白表達(dá)均顯著升高，且TNF-α+pp242組又顯著高于TNF-α組(t=3.91，P<0.05)。與對(duì)照組相比，TNF-α組p62蛋白顯著升高(t=7.61，P<0.05)，pp242組(t=11.64，P<0.05)、TNF-α+pp242組(t=7.95，P<0.05)顯著降低，且TNF-α+pp242組又顯著低于TNF-α組(t=15.56，P<0.05)(表1、圖1)。

1 Da=0.992 1 u

討 論

IBD在臨床上主要表現(xiàn)為反復(fù)發(fā)作的腹痛、腹瀉和黏液血便，并可出現(xiàn)肛瘺、腸梗阻、腸穿孔等嚴(yán)重并發(fā)癥，給患者帶來(lái)了巨大的心理和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。迄今IBD的發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，通常認(rèn)為其發(fā)病與遺傳易感人群受到外界環(huán)境刺激后出現(xiàn)持續(xù)異常的免疫反應(yīng)相關(guān)[5]。大量臨床實(shí)踐表明，氨基水楊酸類(lèi)、糖皮質(zhì)激素、生物制劑等藥物對(duì)IBD病情的緩解有一定作用，但均不能完全治愈慢性炎癥[6]。因此，完善IBD的發(fā)病機(jī)制，積極尋找能干預(yù)和逆轉(zhuǎn)IBD進(jìn)程的靶點(diǎn)具有重要的臨床意義。

越來(lái)越多證據(jù)表明，腸上皮屏障受損是IBD發(fā)生、發(fā)展中的重要環(huán)節(jié)[7-8]。腸上皮屏障主要包括機(jī)械屏障、生物屏障、化學(xué)屏障和免疫屏障，在維持腸道穩(wěn)態(tài)中起重要作用。IBD腸屏障功能受損導(dǎo)致腸上皮通透性增加，使抗原物質(zhì)進(jìn)入黏膜固有層引起免疫反應(yīng)，免疫反應(yīng)產(chǎn)生的大量致炎因子反過(guò)來(lái)作用于腸上皮，進(jìn)一步增加腸道通透性，導(dǎo)致惡性循環(huán)，引起持續(xù)過(guò)度的免疫反應(yīng)[9]。因此，探索阻斷腸屏障損傷的途徑，恢復(fù)正常的腸上皮功能，可能為IBD提供新的治療策略。

自噬是維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的重要代謝過(guò)程。細(xì)胞受到內(nèi)外界因素的刺激后，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或高爾基體脫落的雙層膜包裹胞內(nèi)變性蛋白和衰老細(xì)胞器等物質(zhì)形成自噬小體，自噬小體與溶酶體融合后形成自噬溶酶體降解包裹的內(nèi)容物，降解后形成的小分子物質(zhì)被細(xì)胞重新利用，完成細(xì)胞的新陳代謝以及細(xì)胞器再生[4]。近十年的全基因組關(guān)聯(lián)分析(GWAS)研究[10-11]結(jié)果證實(shí)，IBD患者的多個(gè)自噬相關(guān)基因(如IRGM、ATG16L1等)發(fā)生了多態(tài)性改變。進(jìn)一步的自噬基因功能研究表明，自噬在腸道胞內(nèi)菌的清除過(guò)程中起關(guān)鍵作用；自噬缺陷會(huì)導(dǎo)致持續(xù)性胞內(nèi)菌感染，引起Paneth細(xì)胞形態(tài)學(xué)異常和分泌功能的改變，誘發(fā)持續(xù)性腸道炎癥[12-13]。Saito等[14]發(fā)現(xiàn)，TNF-α與自噬抑制劑可協(xié)同作用于腸上皮細(xì)胞，使細(xì)胞黏附能力下降，損傷上皮屏障功能，提示腸上皮屏障功能可能受自噬的調(diào)控。

表1 各組腸上皮屏障TEER、FITC標(biāo)記葡聚糖通透性和自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的變化±s)

*與對(duì)照組比較，P<0.05；#與TNF-α組比較，P<0.05

本研究將TNF-α作用于腸上皮屏障體外模型以模擬IBD腸屏障損傷，并使用自噬誘導(dǎo)劑pp242進(jìn)行干預(yù)，以TEER和FITC標(biāo)記葡聚糖通透性分別作為評(píng)估腸上皮屏障完整性和腸上皮對(duì)大分子通透性的指標(biāo)，結(jié)果顯示pp242可顯著緩解TNF-α所致的TEER降低，但不能緩解TNF-α所致的FITC標(biāo)記葡聚糖通透性增加。初步說(shuō)明pp242誘導(dǎo)自噬可部分改善TNF-α所致的腸上皮屏障損傷。進(jìn)一步檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的變化發(fā)現(xiàn)，TNF-α處理后LC3B-Ⅱ蛋白表達(dá)明顯升高，說(shuō)明自噬小體聚集增加。自噬是一個(gè)動(dòng)態(tài)連續(xù)的過(guò)程，主要包括誘導(dǎo)、成核、延長(zhǎng)、融合和降解5個(gè)步驟，當(dāng)自噬的誘導(dǎo)過(guò)程增加或自噬的降解過(guò)程受抑制時(shí)，均可使細(xì)胞內(nèi)自噬小體增加，即表現(xiàn)為L(zhǎng)C3B-Ⅱ表達(dá)升高。p62為自噬成熟的標(biāo)志蛋白，主要通過(guò)自噬過(guò)程降解。本研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α作用后p62蛋白表達(dá)明顯升高，說(shuō)明上述LC3B-Ⅱ表達(dá)升高是自噬降解過(guò)程受抑制所致。而pp242處理后，LC3B-Ⅱ蛋白表達(dá)進(jìn)一步上升，但p62蛋白表達(dá)顯著降低。p62是一種主要通過(guò)自噬過(guò)程進(jìn)行降解的蛋白，其表達(dá)降低提示pp242作用可使自噬降解能力恢復(fù)；pp242是一種自噬誘導(dǎo)劑，可促進(jìn)LC3B-Ⅱ水平上升，故TNF-α+pp242組LC3B-Ⅱ水平進(jìn)一步升高提示自噬流的恢復(fù)。結(jié)合上述腸屏障功能實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，提示pp242可能通過(guò)解除TNF-α對(duì)自噬過(guò)程的抑制來(lái)促進(jìn)自噬流的通暢從而改善腸屏障功能損傷。

綜上所述，TNF-α誘導(dǎo)的腸上皮屏障損傷模型中存在自噬流的抑制，而自噬誘導(dǎo)劑pp242通過(guò)激活自噬并恢復(fù)自噬流的通暢，從而改善腸上皮屏障功能。本研究為尋找IBD可能的治療靶點(diǎn)提供了新思路，但研究結(jié)論仍需進(jìn)一步探討證實(shí)。

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(2016-12-16收稿；2017-04-05修回)

Effect of Autophagy Inducer pp242 on Intestinal Barrier Dysfunction Induced by Tumor Necrosis Factor-α

ZHANGCong1,WANGJiazheng1,SHENYujie1,ZHOUMingxia1,CHENYingwei1,2.

1DepartmentofGastroenterology,XinhuaHospitalAffiliatedtoShanghaiJiaotongUniversitySchoolofMedicine,Shanghai(200092);2ShanghaiKeyLaboratoryofPediatricGastroenterologyandNutrition,Shanghai

Correspondence to: CHEN Yingwei, Email: way_01chen@hotmail.com

Background: Intestinal barrier dysfunction and autophagy abnormality play important roles in the mechanism of inflammatory bowel disease, however, whether autophagy has effect on intestinal barrier dysfunction has not been reported. Aims: To explore the effect of autophagy inducer pp242 on intestinal barrier dysfunction induced by tumor necrosis factor-α (TNF-α). Methods: Model of intestinal epithelial monolayer barrier was established with Caco-2 cells in Transwell chambers, and then randomly divided into four groups: control group (without any intervention), TNF-α group (10 ng/mL TNF-α), pp242 group (1 μmol/L pp242), TNF-α+pp242 group (10 ng/mL TNF-α+1 μmol/L pp242). The intestinal barrier function was evaluated by transepithelial electrical resistance (TEER) and flux of FITC-dextran. The protein expressions of autophagy related protein LC3B-Ⅱ and p62 were detected by Western blotting. Results: Compared with control group, TEER was significantly decreased (P<0.05), flux of FITC-dextran, protein expressions of LC3B-Ⅱ and p62 were significantly increased in TNF-α group (P<0.05). Compared with TNF-α group, TEER was significantly increased (P<0.05), protein expression of LC3B-Ⅱ was significantly increased (P<0.05) while protein expression of p62 was significantly decreased in TNF-α+pp242 group (P<0.05). Conclusions: Autophagy inducer pp242 relieves TNF-α-induced intestinal epithelial barrier dysfunction via activating autophagy flux.

Autophagy; Intestinal Mucosal Barrier; Epithelial Cells; Tumor Necrosis Factor-alpha; Inflammatory Bowel Disease

10.3969/j.issn.1008-7125.2017.06.004

*本課題由國(guó)家自然科學(xué)基金(81370485)資助

#本文通信作者，Email: way_01chen@hotmail.com