張世陽，徐修才，焦莉莉，顧永昊，談敏

(安徽醫(yī)科大學附屬省立醫(yī)院，a 老年醫(yī)學科,b 中心實驗室,c 眼科，合肥 230001)

·基礎研究·

根皮苷對糖基化低密度脂蛋白誘導大鼠視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細胞表達乳脂肪球表皮生長因子8的影響

張世陽a，徐修才b，焦莉莉a，顧永昊c，談敏a

(安徽醫(yī)科大學附屬省立醫(yī)院，a 老年醫(yī)學科,b 中心實驗室,c 眼科，合肥 230001)

目的 研究根皮苷(PHL)對糖基化低密度脂蛋白(gly-LDL)誘導大鼠視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細胞(RMVEC)表達乳脂肪球表皮生長因子8(MFG-E8)的影響，探討PHL治療糖尿病視網(wǎng)膜病變(DR)的作用及其機制。方法 體外培養(yǎng)大鼠RMVEC，分別進行不同濃度的gly-LDL與聯(lián)合PHL+gly-LDL的處理。采用TUNEL方法觀察不同處理條件下大鼠RMVEC的細胞凋亡。利用蛋白質(zhì)免疫印跡方法(Western blotting)檢測大鼠RMVEC 表達MFG-E8的變化。結(jié)果 與對照組相比，gly-LDL誘導大鼠RMVEC發(fā)生明顯的細胞凋亡形態(tài)學變化，凋亡細胞的比例顯著增多達到36.52%(P<0.01)，預先經(jīng)PHL(800 μmmol/L)孵育后，細胞凋亡明顯減少至20.45%(P<0.01)；與對照組(蛋白表達灰度值0.290±0.008)比較，gly-LDL誘導組蛋白MFG-E8表達明顯降低，并呈現(xiàn)濃度依賴性(蛋白表達灰度值分別為0.215±0.009、0.165±0.002、0.117±0.014與0.092±0.004，P<0.01)；經(jīng)PHL預處理后，gly-LDL誘導的MFG-E8表達明顯升高，伴隨PHL給藥濃度的增加，MFG-E8的表達逐漸上調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義(蛋白表達灰度值分別為0.343±0.008、0.373±0.002與0.404±0.006，P<0.01)。結(jié)論 PHL可能通過顯著改善蛋白MFG-E8的表達，從而抑制gly-LDL誘導的大鼠RMVEC的細胞凋亡，實現(xiàn)對DR的保護作用。

糖尿病視網(wǎng)膜病變;根皮苷;脂蛋白類,LDL;表皮生長因子;大鼠,Sprague-Dawley

糖尿病視網(wǎng)膜病變(DR)是糖尿病最常見的微血管并發(fā)癥之一，也是成年人群中視力損害與致盲的主要病因。DR的發(fā)病機制非常復雜，有研究認為，糖尿病環(huán)境中長期的高血糖以及脂質(zhì)代謝異常導致低密度脂蛋白過度的糖基化，后者介導與促進血管內(nèi)皮細胞的凋亡與內(nèi)皮功能障礙是DR發(fā)生與發(fā)展的重要病理生理機制[1-3]。乳脂肪球表皮生長因子8(MFG-E8)最初認為是小鼠乳腺上皮細胞表面分泌的一種外周蛋白，晚近的研究發(fā)現(xiàn)MFG-E8參與了細胞凋亡、細胞外基質(zhì)重塑以及炎癥介導等多種生物學功能[4]。前期的蛋白質(zhì)組學研究表明[5]，蛋白MFG-E8在db/db糖尿病小鼠視網(wǎng)膜組織表達明顯下調(diào)，提示MFG-E8可能與DR密切相關(guān)。根皮苷(PHL)是一種來源于蘋果類植物的天然藥物，其治療DR的作用已有多項基礎研究結(jié)果證實[6-7]。本實驗研究PHL對于糖基化低密度脂蛋白(gly-LDL)誘導大鼠視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細胞(RMVEC)表達MFG-E8的影響，以探討PHL治療DR的作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物、試劑與藥品 雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠來源于常州卡文斯實驗動物有限公司，RPMI1640、M199培養(yǎng)基來源于美國Hyclone公司、TUNEL試劑盒購自瑞士Biotool公司、BCA蛋白定量試劑盒購自江蘇凱基公司、鼠MFG-E8抗體購自英國Abcom公司、兔抗大鼠因子Ⅷ多克隆抗體與兔抗大鼠CD31多克隆抗體購自美國Santa Cruz公司，PHL購自中國天津尖峰天然藥物研究開發(fā)有限公司(批號：1005004-19，純度98%)。

1.1.2 儀器 細胞培養(yǎng)箱(Thermo Scientific 8000)、倒置拍照顯微鏡(Leica DMI3000B)、電泳儀(Bio-Rad Mini Protean 3 Cell)、電轉(zhuǎn)儀(大連競邁PS-9)與酶標儀(Thermo MK3)。

1.2 方法

1.2.1 體外分離、培養(yǎng)與鑒定大鼠RMVEC 體外分離大鼠視網(wǎng)膜以及體外培養(yǎng)大鼠RMVEC方法同文獻[8]，利用倒置顯微鏡觀察原代RMVEC的細胞形態(tài)。

1.2.2 大鼠RMVEC的體外鑒定 將培養(yǎng)的RMVEC接種于放油載玻片的培養(yǎng)皿中，至細胞爬滿載玻片80%時棄培養(yǎng)液，取出培養(yǎng)皿，加入PBS 300 μL清洗2遍，加入150 μL 4% 多聚甲醛固定液，室溫固定30 min。加入150 μL 0.1% Triton x-100，室溫靜置15 min。再加入300 μL的PBS，靜置5 min。然后加入200 μL 5% BSA封閉液，置于37 ℃，5 % CO2培養(yǎng)箱1 h。分別加入50 μL兔抗大鼠CD31多克隆抗體(1∶50稀釋)和兔抗大鼠因子Ⅷ多克隆抗體(1∶50稀釋)，4 ℃過夜孵育。PBS洗滌后滴加FITC標記的羊抗兔二抗(1∶50稀釋)，37 ℃孵育1 h。PBS甘油封片后熒光顯微鏡下觀察。RMVEC純度=免疫陽性細胞數(shù)/細胞總數(shù)。

1.2.3 gly-LDL的制備 LDL的糖基化制備方法參考文獻[9]。制備的gly-LDL分裝EP管氮氣密封4 ℃避光保存。

1.2.4 細胞凋亡的檢測 RPMI1640完全培養(yǎng)基將PHL稀釋為800 μmol/L，將gly-LDL稀釋為100 μg/mL進行實驗。PHL提前與RMVEC預先孵育4 h，然后加入gly-LDL孵育48 h。實驗分3組：對照組、gly-LDL組以及gly-LDL聯(lián)合PHL組。TUNEL操作參考Biotool試劑盒說明書，軟件ImageJ計算各組RMVEC細胞凋亡率。

1.2.5 RMVEC細胞表達蛋白MFG-E8的檢測 分別進行兩個階段的獨立實驗檢測不同處理條件下細胞蛋白MFG-E8的表達。實驗分組一分為5組：空白對照組、gly-LDL 12.50、25.00、50.00與100.00 mg/L四個藥物濃度組。實驗分組二分為5組：空白對照組(CK)以及CK+gly-LDL、CK+gly-LDL+PHL 200 μmol/L、CK+gly-LDL+PHL 400 μmol/L與CK+gly-LDL+PHL 800 μmol/L(實驗分組二中各組gly-LDL濃度均為100 mg/L)。按照Western blotting常規(guī)操作，包括各組細胞總蛋白提取濃度測定、SDS-PAGE制備上樣電泳、轉(zhuǎn)膜、目標蛋白抗體孵育以及顯色等標準流程檢測各相應分組RMVEC細胞MFG-E8蛋白表達的變化。并利用各顯色條帶的灰度值進行半定量分析。

2 結(jié)果

2.1 原代大鼠RMVEC的形態(tài)學特征 原代培養(yǎng)的RMVEC在24 h細胞貼壁生長，形狀為梭形、三角形或多角形。5 d左右形成細胞集落。10 d后細胞融合，呈現(xiàn)鋪路石樣生長,見圖1。

圖1 原代大鼠RMVEC的形態(tài)學特征(×100)

2.2 原代大鼠RMVEC的體外鑒定 免疫熒光細胞染色顯示，因子Ⅷ免疫熒光染色，細胞核周圍出現(xiàn)較強的黃綠色熒光反應。CD31因子免疫熒光染色，細胞呈現(xiàn)特異性黃綠色熒光。大部分活細胞為免疫陽性細胞，純度達到90%以上。見圖2。

2.3 gly-LDL對大鼠RMVEC細胞凋亡的作用以及PHL的影響 對照組RMVEC細胞凋亡率為1.24%，gly-LDL(100 mg/L)誘導48h的RMVEC細胞凋亡率達到36.52%，經(jīng)χ2檢驗，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，gly-LDL(100 mg/L)誘導組的細胞凋亡率顯著高于對照組。PHL(800 μmmol/L)預先孵育后RMVEC細胞凋亡率為20.45%，與gly-LDL(100 mg/L)誘導組細胞凋亡率比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，PHL (800 μmmol/L)預先孵育RMVEC可顯著降低細胞的凋亡。見圖3。

2.4 gly-LDL對大鼠RMVEC細胞表達MFG-E8的影響 與對照組比較，gly-LDL處理48 h可導致RMVEC細胞表達MFG-E8顯著下調(diào)，隨著gly-LDL濃度的增加，MFG-E8的表達逐漸下調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見圖4。

2.5 PHL對大鼠RMVEC表達MFG-E8的影響 與對照組(CC)比較，gly-LDL誘導明顯下調(diào)RMVEC細胞的MFG-E8表達(P<0.01)，PHL預先孵育48 h可以顯著上調(diào)gly-LDL誘導的RMVEC細胞MFG-E8表達，隨著PHL給藥濃度的增加，MFG-E8的表達逐漸上調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見圖5。

與對照組比較，aP<0.01；與gly-LDL組比較，bP<0.01

圖3 gly-LDL(100 mg/L)對大鼠RMVEC細胞凋亡的作用以及PHL(800 μmmol/L)的影響

與對照組比較，aP<0.01

A：柱狀圖；B：電泳圖

圖2 原代大鼠RMVEC的體外鑒定(免疫熒光細胞染色，×200)

CC組為對照組；CC+gly-LDL組為gly-LDL誘導組；PHL 200組為聯(lián)合PHL 200 μmmol/L組；PHL 400組為聯(lián)合PHL 400 μmmol/L組；PHL 800組為聯(lián)合PHL 800 μmmol/L組；與對照組比較，aP<0.01

圖5 PHL對大鼠RMVEC表達MFG-E8的影響

3 討論

DR是糖尿病在眼部的最重要并發(fā)癥，現(xiàn)已成為成年人群中視力漸進性損害與致盲的主要病因。隨著全球范圍內(nèi)糖尿病患病率的日益升高以及糖尿病病程的自然延長，DR給患者、家庭以及社會帶來更多的危害與負擔。研究[10]表明，嚴格的血糖控制能顯著減低DR進展的風險，但在臨床實踐中長期控制血糖達標并非易事，而可能發(fā)生低血糖事件帶來的危害更有可能抵消血糖良好控制的獲益。激光光凝治療DR效果確切，仍是中晚期階段DR治療的重要方法，但存在很多局限性與不良反應，如導致視力減退、視野損傷、暗適應和對比敏感度下降等，從而限制了其在臨床上的廣泛應用。因此，探討DR早期的病理生理機制并尋找有效安全的干預藥物具有重要的意義。

視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞、血管周細胞以及神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細胞等凋亡是DR早期的重要病理學基礎，氧化應激損傷在促進細胞凋亡作用中發(fā)揮著重要作用[11]。PHL是一種天然的多酚類化合物，其主要來源于蘋果類的植物種屬。人類認識PHL已有近百年的歷史，最初PHL用于治療發(fā)熱以及感染性疾病，隨后的研究發(fā)現(xiàn)，PHL及其衍生物作為鈉-葡萄糖協(xié)同轉(zhuǎn)運蛋白(SGLT)抑制劑作用于腎小管SGLT蛋白促進葡萄糖在腎臟的排泄，因此PHL具有調(diào)節(jié)血糖的效應以及被作為中介研究腎臟代謝功能。晚近的研究還發(fā)現(xiàn)[12-13]，PHL具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤、保肝以及類雌激素樣作用。相關(guān)報道與研究為PHL在DR上的應用奠定了實驗與理論基礎。目前已有多個基礎研究深入探討PHL對于DR的影響與作用。Wakisaka等[7]報道，體外培養(yǎng)的牛視網(wǎng)膜血管周細胞在高糖誘導后出現(xiàn)周細胞內(nèi)葡萄糖過量積聚、膠原蛋白水平升高、DNA合成減少以及周細胞胞體的腫脹等血管周細胞形態(tài)與功能學的異常，PHL的干預可以顯著改善高糖刺激下的周細胞損傷。我們前期的研究在體內(nèi)動物整體層面觀察了PHL對于糖尿病視網(wǎng)膜損害的影響，選擇C57BLKS/J db/db品系小鼠模擬并建立2型糖尿病DR動物模型并采用PHL干預治療，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PHL處理能夠明顯減少db/db小鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)元細胞的凋亡以及神經(jīng)膠質(zhì)細胞的增生[5]。本研究模擬糖尿病內(nèi)環(huán)境即利用gly-LDL刺激下體外培養(yǎng)的大鼠RMVEC導致細胞凋亡顯著增加，PHL預先干預明顯改善RMVEC的細胞凋亡，該實驗結(jié)果報道了PHL可以改善gly-LDL誘導的大鼠RMVEC細胞凋亡，實現(xiàn)PHL對于DR的早期保護作用。然而，PHL治療DR的作用分子機制研究尚未闡明。

MFG-E8蛋白即乳脂肪球上皮細胞生長因子，是乳凝集素家族的重要成員。研究發(fā)現(xiàn)MFG-E8參與了細胞遷移、細胞增殖、細胞凋亡、細胞信號轉(zhuǎn)導、細胞外基質(zhì)重塑以及炎癥介質(zhì)等多種生物學功能，并可能在衰老、糖尿病等動脈粥樣硬化性相關(guān)疾病中扮演著重要角色。前期基于iTRAQ的蛋白質(zhì)組定量研究視網(wǎng)膜差異蛋白組發(fā)現(xiàn)，db/db糖尿病小鼠視網(wǎng)膜組織表達蛋白MFG-E8較健康對照組明顯下調(diào)，PHL干預后該蛋白顯著回調(diào)，提示MFG-E8的代謝失調(diào)可能與DR的發(fā)生有著密切關(guān)系[5]。本研究在離體培養(yǎng)大鼠RMVEC細胞層面研究gly-LDL刺激下MFG-E8蛋白表達的變化，結(jié)果顯示RMVEC細胞在不同濃度的gly-LDL誘導均導致表達MFG-E8的下調(diào)，MFG-E8的下調(diào)程度且與gly-LDL的濃度呈現(xiàn)劑量依賴性，給予RMVEC預處理PHL可明顯改善gly-LDL誘導的MFG-E8表達下調(diào)，并且隨著PHL濃度的升高，該蛋白MFG-E8的表達呈現(xiàn)劑量一致的恢復。MFG-E8介導的PHL保護糖尿病視網(wǎng)膜損傷的詳細作用機制并不清楚。在真實世界的慢性阻塞性肺疾病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡以及類風濕關(guān)節(jié)炎等患者血清中MFG-E8水平明顯降低，且與患者的病變嚴重程度成正相關(guān)，MFG-8可能通過炎癥介導參與了炎癥相關(guān)性疾病的發(fā)生與進展[14-16]。MFG-E8作為連接巨噬細胞與凋亡細胞的橋梁分子在細胞凋亡的過程中發(fā)揮著獨特而重要的作用。Ait-Oufella等[17]研究發(fā)現(xiàn)，缺乏MFG-E8基因表達的小鼠其體內(nèi)凋亡細胞被吞噬明顯減少，導致凋亡細胞呈現(xiàn)碎片化的堆積，促進了小鼠血管病變的發(fā)生與發(fā)展。凋亡是DR的發(fā)生的病理生理學基礎，氧化應急損傷以及炎癥在DR的進展中也發(fā)揮著舉足輕重的作用，MFG-E8是否通過凋亡、炎癥介導或其他機制參與DR的發(fā)展以及介導PHL對于DR的保護作用，后續(xù)研究將基于RNA干擾技術(shù)沉默目的基因深入探討。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)gly-LDL誘導大鼠RMVEC后，能夠?qū)е录毎牡蛲鲆约凹毎磉_MFG-E8蛋白的下調(diào)，PHL的預處理至少可能通過改善細胞MFG-E8表達的失調(diào)抑制RMVEC細胞的凋亡實現(xiàn)對于DR的保護作用。

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Effects of phlorizin on the expression of MFG-E8 in rats retinal microvascular endothelial cells in response to glycated low density lipoproteins

ZhangShiyang*,XuXiucai,JiaoLili,GuYonghao,TanMin

(*DepartmentofGeriatrics,AnhuiProvincialHospital,AnhuiMedicalUniversity,Hefei230001,China)

Correspondingauthor:XuXiucai,Email:xuxiucai1972@163.com

Objective To study the effects of phlorizin on the expression of MFG-E8 in rats retinal microvascular endothelial cells (RMVEC) in response to glycated low density lipoproteins (gly-LDL).Methods The primary RMVEC in rats were cultured and identified in vitro.The apoptosis of RMVEC induced gly-LDL was estimated using TUNEL.The expressions of MFG-E8 in RMVEC in the absence or presence of phlorizin were determined by Western blotting.Results Gly-LDL caused an obvious apoptosis of RMVEC compared with the control group (36.52% VS. 1.24%,P<0.01),while pretreatment with phlorizin attenuated gly-LDL mediated cells apoptosis significantly (20.45% VS. 36.52%，P<0.01).Moreover,stimulation of RMVEC with different concentrations of gly-LDL(0,12.50,25.00,50.00,100.00 μg/mL) resulted in a significant decrease in the expression of MFG-E8 (P<0.01),while the pretreatment of RMVEC with different concentrations of phlorizin (200,400,800 μmmol/L) significantly restored the gly-LDL induced decreased MFG-E8 levels in a dose dependent manner for 48h (P<0.01).Conclusions Phlorizin could inhibit RMVEC apoptosis in response to gly-LDL,possibly by the up-regulation of the protein MFG-E8 expression.

Diabetic retinopathy;Phlorhizin;Lipoproteins,LDL;Epidermal growth factor;Rats,sprague-dawley

安徽省自然科學基金(1408085MH208)

張世陽，副主任醫(yī)師，Email:shiyangzhang73@163.com

徐修才，副主任技師，Email:xuxiucai1972@163.com

R587.26

A

10.3969/J.issn.1672-6790.2017.04.029

2016-11-16)