周麗菁 龍婷婷 周 星 鮑依稀

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院檢驗科，重慶400010)

·中醫(yī)中藥與免疫·

刺五加多糖對Lewis荷瘤小鼠抗腫瘤免疫調(diào)節(jié)作用及機制的研究①

周麗菁 龍婷婷 周 星 鮑依稀

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院檢驗科，重慶400010)

目的：探討刺五加多糖(ASPS)對Lewis荷瘤小鼠TLR4信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的調(diào)控機制。方法：用C57BL/6建立Lewis實體型荷瘤小鼠模型，隨機分為生理鹽水組(NS組)、阿霉素組(ADM組)和ASPS低、中、高劑量組，灌胃給藥25 d后，稱重計算瘤重、抑瘤率、胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)。收集荷瘤小鼠眼球血，ELISA檢測外周血中細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-12p70的分泌情況。采用實時熒光定量PCR(Q-PCR)和Western blot法分別檢測荷瘤小鼠脾細(xì)胞中TLR4相關(guān)節(jié)點TLR4、MyD88、TRAM、TRAF6、NF-κB p65、AP-1基因和蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果：與NS組相比，ASPS中劑量組荷瘤小鼠的瘤重明顯降低，抑瘤率和免疫器官指數(shù)顯著升高(P<0.05)。與NS組相比，ASPS顯著促進荷瘤小鼠外周血TNF-α、IL-1β和IL-6的分泌(P<0.05)，對IL-12p70的產(chǎn)生無顯著影響(P>0.05)。ASPS顯著上調(diào)TLR4信號通路中TLR4、MyD88、TRAF6、NF-κB p65、AP-1基因和蛋白在荷瘤小鼠脾臟中的表達(dá)(P<0.05)，而對TRAM無顯著作用(P>0.05)。結(jié)論：TLR4信號通路可能是ASPS在Lewis荷瘤小鼠體內(nèi)發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)及抑制腫瘤作用的通路之一。

刺五加多糖；肺腺癌；免疫調(diào)節(jié)；TLR4信號通路

據(jù)2000年世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計報告，肺癌成為當(dāng)今世界對人類生命健康危害最大的惡性腫瘤。其中肺腺癌占據(jù)首位，且目前常用治療手段的療效不理想，5年生存率僅約10%左右[1,2]?？鼓[瘤化療藥物毒副作用大，長期使用容易產(chǎn)生耐藥，中藥因其療效好毒副作用少，在腫瘤的治療中體現(xiàn)了獨特的優(yōu)勢[3]。近年來，免疫類中藥多糖因其具有調(diào)節(jié)機體免疫功能、抗腫瘤活性顯著和毒副作用小等特點被廣泛應(yīng)用于臨床輔助治療[4]。刺五加為五加科五加屬植物刺五加[Acanthopanax Senticosus(Ruper.Et Maxim)Harms]是一味珍貴的中國傳統(tǒng)中藥，《本草綱目》將其列為“本經(jīng)上品”，具有益氣健脾、補腎安神、益經(jīng)壯骨等功效[5]。刺五加多糖(Acanthopanax Senticosus polysaccharides,ASPS)是中藥刺五加的免疫活性成分，是由葡萄糖、果糖、木糖、阿拉伯糖等成分組成，它分為水溶性多糖和堿溶性多糖兩大類[6]。ASPS具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗氧化和降低血糖等廣泛的生物活性作用以及低毒性等優(yōu)點，以其為主要成分的藥物已經(jīng)廣泛應(yīng)用于臨床[7]。

有研究表明，許多中藥多糖的免疫調(diào)節(jié)作用與Toll樣受體(Toll-like receptors,TLRs)信號通路有關(guān)[8-10]。其中TLR4在中藥多糖主導(dǎo)的免疫調(diào)節(jié)和細(xì)胞因子釋放等功能中發(fā)揮重要作用[11,12]。基于以上研究，本實驗擬采用刺五加多糖作用于Lewis實體型肺腺癌荷瘤小鼠的體內(nèi)實驗，觀察ASPS在荷瘤小鼠體內(nèi)免疫調(diào)節(jié)和抗腫瘤活性，同時探討其對TLR4信號通路的調(diào)節(jié)機制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1儀器與試劑 ASPS(購自西安源森生物科技有限公司)純度為80%，無菌生理鹽水溶解后4℃保存?zhèn)溆?。ELISA檢測試劑盒購自北京四正柏生物科技有限公司；組織總RNA提取試劑盒，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒RR047A以及SYBR Premix Ex TaqTMⅡ(TaKaRa公司)；熒光定量PCR儀(Bio-Rad CFX96)；兔抗小鼠TLR4、MyD88、NF-κB和AP-1抗體(Cell Signal Technology公司)；兔抗小鼠TRAM和TRAF-6抗體(Abcam公司)；辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗小鼠IgG(H+L)抗體、鼠抗β-actin抗體，羊抗兔IgG-HRP(博士德公司)等。

1.1.2實驗動物與腫瘤 SPF級C57BL/6小鼠50只，6～8周齡，體重(20±2)g，購自重慶醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，許可證號SYXK(渝)2012-0001；Lewis鼠源性肺腺癌細(xì)胞株(Lewis lung carcinoma cells,LLC)由第三軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院中心實驗室提供。

1.2方法

1.2.1Lewis實體型荷瘤小鼠模型構(gòu)建 從液氮中取出凍存的Lewis肺癌細(xì)胞株，復(fù)蘇后體外擴大培養(yǎng)。在無菌條件下，收集處于對數(shù)期生長的Lewis細(xì)胞，用滅菌生理鹽水稀釋成1×106個/ml細(xì)胞懸液，于每只小鼠的右側(cè)腋窩下接種0.2 ml[13]。以造模5～7 d后，接種處腫瘤平均直徑(MD)為5 mm為造模成功，成功率約為100%。

1.2.2模型動物分組及處理 將50只Lewis荷瘤小鼠隨機分成5組，每組10只，分為生理鹽水組(NS組)，阿霉素組(ADM組)，ASPS低劑量組[50 mg/(kg·d)]，ASPS中劑量組[200 mg/(kg·d)]和ASPS高劑量組[600 mg/(kg·d)]。接種Lewis細(xì)胞后次日各組開始按劑量灌胃，每只每天灌胃體積均為0.2 ml。ADM組以4 mg/(kg·d)連續(xù)腹腔注射3 d后灌喂生理鹽水，灌胃體積同上。給藥后每天觀察小鼠毛色、食欲、活動和排泄等一般狀況。連續(xù)給藥25 d后，稱量各組小鼠體重，眼球取血，頸椎脫臼處死小鼠，于無菌環(huán)境下完整剝離腫瘤、脾臟及胸腺進行稱重，液氮保存脾臟組織，分離的血清置于-20℃保存。計算胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)和抑瘤率。臟器指數(shù)(%)=臟器重量/體重×100%；抑瘤率(%)=(1-實驗組平均瘤重/對照組平均瘤重)×100%。根據(jù)以上指標(biāo)評估ASPS對肺癌小鼠的作用，并選擇最適藥物劑量。

1.2.3ELISA法檢測荷瘤小鼠外周血中細(xì)胞因子的分泌水平 收集荷瘤小鼠眼球全血，3 000 r/min離心10 min，吸取上層血清，用ELISA法檢測細(xì)胞因子的分泌水平，具體操作步驟參照ELISA試劑盒說明書進行操作。

1.2.4Q-PCR檢測TLR4信號通路關(guān)鍵節(jié)點基因表達(dá)水平

1.2.4.1脾臟組織總RNA的抽提及cDNA的合成 取約20 mg脾臟組織，液氮研磨至細(xì)粉末狀后加入含有50 DTT Solution的Buffer RL裂解液，用TaKaRa miniBEST總RNA提取試劑盒抽提小鼠脾臟組織總RNA。用紫外分光光度計(Beckman,DU730)檢測RNA的濃度及純度，用瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性。使用TaKaRa RR047A逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA于-20℃保存。

1.2.4.2Q-PCR各引物最佳退火溫度 實驗所用引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司設(shè)計合成(引物序列見表1)。采用溫度梯度法摸索每對引物的最佳退火溫度，整個Q-PCR采用10 μl反應(yīng)體系：5 μl SYBR Premix Ex TaqTMⅡ；1 μl引物(上下游引物濃度均為500 nmol/L)；1 μl的cDNA和3 μl的RNA-Free水。反應(yīng)條件為95℃ 30 s，95℃ 5 s，T ℃(各引物的退火溫度)30 s，共40次循環(huán)以及軟件自帶的溶解曲線檢測程序(用以觀察擴增產(chǎn)物的特異性和引物的有效性)。由于各引物在58℃都有較好的擴增效率，最終選定58℃為所有引物的退火溫度。

1.2.4.3引物擴增效率的檢測 將溫度梯度擴增的cDNA產(chǎn)物用RNA-Free水稀釋1 000倍后作為標(biāo)準(zhǔn)品，再按1∶10倍比稀釋6份不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品。采用雙復(fù)孔擴增后，由Bio-Rad CFX Manager software計算得出各引物的擴增效率，實驗重復(fù)性在0.990以上。

每對引物經(jīng)上述操作步驟后，其擴增效率由Bio-Rad Manager software自動算出，如表1所示，其中包括：擴增效率(E%)和可重復(fù)性(R2)。

表1 Q-PCR使用的各引物序列及相關(guān)信息

1.2.4.4Q-PCR檢測基因相對表達(dá)量 采用β-actin和GAPDH作為內(nèi)參基因，按照上述反應(yīng)體系和條件，在58℃退火溫度下進行擴增，用Vandesompele雙內(nèi)參擴增效率法對目的基因的表達(dá)進行數(shù)據(jù)分析。

1.2.5Western blot法檢測TLR4信號通路關(guān)鍵節(jié)點蛋白的表達(dá) ①將脾臟組織置于研缽內(nèi)加入液氮充分研磨，加入裂解液(含蛋白酶抑制劑和磷酸化酶抑制劑)充分裂解后，12 000 r/min離心10 min，取上清，測蛋白濃度；②經(jīng)SDS-PAGE電泳并轉(zhuǎn)膜后，用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h；③加入相應(yīng)濃度的一抗，4℃過夜；④用TBST(TBS加0.1%的吐溫20)洗滌PVDF膜3次加入相應(yīng)二抗，37℃孵育1 h；⑤用TBST洗膜3次同上述步驟，用顯色劑(Millipore公司)曝光。采用Quantity One 軟件分析條帶相對表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1Lewis荷瘤小鼠一般狀況 于小鼠右側(cè)腋窩下接種Lewis細(xì)胞造模成功之后，每天給藥后觀察小鼠狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)小鼠精神狀態(tài)良好，活動、飲食、排泄物均未見異常，眼、耳、口、鼻處未見分泌物。

2.2ASPS對Lewis荷瘤小鼠瘤重及抑瘤率的影響 藥物處理25 d后，各組小鼠瘤體完整剝離稱重，結(jié)果如圖1所示。ADM組、ASPS低劑量組[50 mg/(kg·d)]、ASPS中劑量組[200 mg/(kg·d)]和ASPS高劑量組[600 mg/(kg·d)]相對于NS組的抑瘤率分別為：66.15%、11.42%、37.19%和25.53%。ASPS各個劑量灌胃組相對于NS組，瘤重均有下降趨勢。其中ASPS中劑量灌胃組相對于NS組腫瘤重量明顯減小，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。ADM組作為抗腫瘤作用陽性對照組，與NS組相比，小鼠腫瘤質(zhì)量(瘤重)明顯減小，抑瘤效果顯著(P< 0.01)。

2.3ASPS對Lewis荷瘤小鼠免疫器官臟器指數(shù)的影響 如圖2A、B所示，ASPS各個劑量灌胃組的胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)相對于NS組，均表現(xiàn)出上升趨勢；其中ASPS中劑量灌胃組[200 mg/(kg·d)]的胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)相對于NS組升高效果最為顯著(P< 0.05)?；贏SPS中劑量組[200 mg/(kg·d)]瘤重、抑瘤率、胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)的綜合情況，選擇ASPS中劑量組為ASPS對Lewis荷瘤小鼠的最適劑量，進行深入研究。

2.4ASPS對Lewis荷瘤小鼠外周血中細(xì)胞因子分泌的影響 經(jīng)過藥物處理25 d后，收集小鼠眼球血，ELISA方法檢測外周血中的細(xì)胞因子的分泌情況。結(jié)果顯示(如圖3所示)，ASPS中劑量組小鼠血清中TNF-α、IL-1β和IL-6的分泌量顯著高于NS組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而對IL-12p70(Interleukin-12p70，IL-12p70)的分泌無顯著影響(P>0.05)。

圖1 ASPS對Lewis實體型荷瘤小鼠腫瘤的影響Fig.1 Effect of ASPS on tumor weight of Lewis tumor-bearing miceNote:Compared with NS group,*.P<0.05,#.P<0.01.

圖2 ASPS對Lewis實體型荷瘤小鼠胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)的影響Fig.2 Effect of ASPS on immune organ indexes of Lewis tumor-bearing miceNote:Compared with NS group,*.P<0.05.

圖3 ELISA檢測NS組與ASPS中劑量組小鼠外周血中終端效應(yīng)因子的分泌量Fig.3 Terminal effect factors secretion in tumor-bearing mice peripheral blood of NS and ASPS group detected by ELISANote:Compared with NS group,*.P<0.05,**.P<0.01.

2.5ASPS對Lewis荷瘤小鼠脾細(xì)胞中TLR4信號通路基因表達(dá)水平的影響 如圖4所示，ASPS中劑量組[200 mg/(kg·d)]與NS組相比，荷瘤小鼠脾臟組織TLR4、TRAF6、MyD88、NF-κB的mRNA表達(dá)水平均明顯增高(P<0.05)，AP-1mRNA表達(dá)水平增高最為顯著(P<0.01)，而TRAM在兩組中表達(dá)無明顯差異(P>0.05)。相對于NS組，ASPS中劑量組中TLR4上調(diào)1.79倍，TRAF6上調(diào)1.55倍，MyD88上調(diào)1.59倍，NF-κB上調(diào)1.73倍，AP-1上調(diào)2.53倍。

2.6ASPS對Lewis荷瘤小鼠脾細(xì)胞中TLR4信號通路關(guān)鍵節(jié)點基因表達(dá)水平的影響 Western blot檢測結(jié)果顯示(圖5)，ASPS中劑量灌胃組小鼠與NS對照組相比，小鼠脾臟TLR4、TRAF6、MyD88、NF-κB p65、AP-1的蛋白表達(dá)水平顯著增高(P< 0.05)，而TRAM的蛋白表達(dá)量在兩組間無顯著差異(P>0.05)。

圖4 Q-PCR檢測荷瘤小鼠脾細(xì)胞中TLR4信號通路關(guān)鍵節(jié)點基因相對表達(dá)量Fig.4 Relative key nodes gene expression in splenocytes of NS group and ASPS group detected by Q-PCRNote:Compared with NS group,*.P<0.05.

圖5 Western blot檢測荷瘤小鼠脾細(xì)胞中TLR4信號通路關(guān)鍵節(jié)點蛋白相對表達(dá)及光密度分析結(jié)果Fig.5 Relative protein expression of key nodes in splenocytes of NS and ASPS group detected by Western blotNote:A.The bands of Western blot;B.Quantification of Western blot for the key-node proteins as fold-changes relative to β-actin.Compared with NS group,*.P<0.05.

3 討論

許多實驗證實，ASPS在多種腫瘤輔助放化療及抑制腫瘤增殖和轉(zhuǎn)移中都有一定療效。研究顯示，ASPS通過上調(diào)Bax、p53，下調(diào)Bcl-2促進人肺癌細(xì)胞株H446細(xì)胞凋亡，對H446增殖有顯著的抑制作用，并且呈現(xiàn)劑量依賴性[14]。另有實驗證實，ASPS對小鼠腹水型肉瘤S180細(xì)胞和慢性骨髓型白血病K562均有顯著的抑制作用[15]。本研究中，在Lewis荷瘤小鼠中同樣觀察到ASPS對實體型荷瘤小鼠瘤重的抑制作用，ASPS各個劑量組荷瘤小鼠的瘤重均低于NS組，其中ASPS中劑量組[200 mg/(kg·d)]瘤重降低最顯著，抑瘤率達(dá)37.19%。

ASPS可以激活NK(自然殺傷細(xì)胞)和巨噬細(xì)胞，并對T、B細(xì)胞產(chǎn)生重要調(diào)節(jié)作用，增強機體免疫功能[16]。研究顯示，ASPS能夠促進豚鼠腹腔巨噬細(xì)胞系統(tǒng)的吞噬功能，增加正常小鼠及荷瘤小鼠巨噬細(xì)胞數(shù)量[17]。在本研究中，Lewis荷瘤小鼠經(jīng)不同濃度ASPS灌胃處理25 d后發(fā)現(xiàn)，胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)相對于NS組均有不同程度的升高，其中ASPS中劑量組[200 mg/(kg·d)]升高最為顯著。此外，經(jīng)過ASPS灌胃處理的荷瘤小鼠，外周血中TNF-α、IL-1β和IL-6的分泌量顯著升高；ASPS雖然對IL-12p70有刺激分泌的作用，但是效果不顯著，無統(tǒng)計學(xué)差異。IL-6可以激活B細(xì)胞、T細(xì)胞和干細(xì)胞增殖，促進B細(xì)胞分泌抗體，促進CTL的分化[18]。IL-12p70則是典型的T細(xì)胞激活劑，促進T細(xì)胞增殖和功能成熟[19]。TNF-α主要由單核巨噬細(xì)胞分泌，對腫瘤細(xì)胞有直接的殺傷作用[20]。

Toll樣受體(Toll-like receptors,TLRs)是一類天然免疫模式識別受體，屬于Ⅰ型跨膜糖蛋白，在病原微生物免疫和誘導(dǎo)快速防御反應(yīng)激活固有免疫系統(tǒng)中具有重要作用[21]。TLR4主要表達(dá)在免疫細(xì)胞表面，在介導(dǎo)固有免疫系統(tǒng)以及中藥多糖主導(dǎo)的免疫力提升和細(xì)胞因子釋放中發(fā)揮重要作用[11,12]。TLR4信號通路分為MyD88依賴途徑和MyD88非依賴途徑，TRAM 為MyD88非依賴途徑特異性節(jié)點，TRAF-6是兩條途徑的交叉點，繼而激活NF-κB和MAPK途徑，調(diào)控相關(guān)節(jié)點和細(xì)胞因子的表達(dá)[22]。本研究為了進一步探索ASPS發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)抗腫瘤作用的潛在機制，我們提取各組Lewis荷瘤小鼠脾臟組織的總RNA和蛋白運用Q-PCR和Western blot技術(shù)檢測TLR4信號通路關(guān)鍵節(jié)點基因和蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，經(jīng)過ASPS中劑量[200 mg/(kg·d)]灌胃的荷瘤小鼠脾細(xì)胞中TLR4、MyD88、TRAF6、NF-κB p65、AP-1的基因和蛋白的表達(dá)量相對于NS組都有明顯上升；而TRAM基因和蛋白表達(dá)水平與NS組相比均未見顯著變化。提示，ASPS可能促進Lewis荷瘤小鼠脾細(xì)胞中TLR4信號通路相關(guān)節(jié)點的表達(dá)，TLR4信號通路可能參與ASPS在Lewis荷瘤小鼠體內(nèi)免疫調(diào)節(jié)抗腫瘤作用。但具體是MyD88依賴途徑還是MyD88非依賴途徑，亦或是兩條途徑共同參與ASPS在荷瘤小鼠體內(nèi)免疫調(diào)節(jié)抗腫瘤作用，仍需更加嚴(yán)謹(jǐn)深入的研究去探索其具體機制。

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[收稿2016-11-01 修回2017-01-09]

(編輯 倪 鵬)

ImmunomodulatoryeffectsofAcanthopanaxSenticosuspolysaccharidesonlewistumor-bearingmicethroughTLR4signalingpathway

ZHOULi-Jing,LONGTing-Ting,ZHOUXing,BAOYi-Xi.DepartmentofClinicalLaboratory,theSecondAffiliatedHospitalofChongqingMedicalUniversity,Chongqing400010,China

Objective:To investigate the effects of Acanthopanax Senticosus polysaccharides (ASPS) on TLR4 signaling pathway in Lewis tumor-bearing mice,and to explore the immunomodulatory mechanism of ASPS.Methods:Lewis lung carcinoma cells and C57BL/6 mice were used to establish the animal model for solid tumor.The tumor-bearing mice were divided into five groups:normal saline (NS) group,Adriamycin (ADM) group,ASPS low-dose group,ASPS middle-dose group and ASPS high-dose group.After 25 d treatment,the weight of tumor,tumor inhibition rate and immune organ index were measured.ELISA were applied to detected the cytokines in peripheral blood of tumor-bearing mice.Quantitative real-time PCR (Q-PCR) and Western blot were selectively used to detect the gene and protein expression of TLR4 signaling pathway in splenocytes.Results:The tumor inhibition rate,immune organ index and the secretion of TNF-α,IL-1β and IL-6 were increased by ASPS,compared with NS group (P<0.05).The gene and protein expression of TLR4,MyD88,TRAF6,NF-κB p65 and AP-1 were also induced by ASPS (P<0.05).Meanwhile,ASPS had no obvious effects on the secretion of IL-12p70 and the expression of TRAM (P>0.05).Conclusion:TLR4 signaling pathway may be involved in the immunomodulatory effects of ASPS on Lewis tumor-bearing mice.

Acanthopanax Senticosus polysaccharides;Adenocarcinoma of lung;Immunomodulatory;TLR4 signaling pathway

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.06.009

①本文受國家自然科學(xué)基金(81274144，81473388)資助。

周麗菁(1991年-)，女，碩士，初級檢驗師，主要從事中藥免疫和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)方面的研究，E-mail:LijingZhou1126@163.com。

及指導(dǎo)教師：鮑依稀(1967年-)，女，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事中藥免疫機制方面的研究，E-mail:yixibao@163.com。

R285.5R392.5

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1000-484X(2017)06-0849-06