吳小凡 馬 斌 侯訓(xùn)堯 洪 艷 申 超 劉雪平

(山東大學(xué)附屬省立醫(yī)院老年神經(jīng)科，濟(jì)南250021)

柿葉提取物對(duì)HEK293-APPswe轉(zhuǎn)基因細(xì)胞模型的抗氧化作用及對(duì)Nrf2/HO-1途徑的影響①

吳小凡 馬 斌②侯訓(xùn)堯 洪 艷 申 超 劉雪平

(山東大學(xué)附屬省立醫(yī)院老年神經(jīng)科，濟(jì)南250021)

目的：觀察柿葉提取物(PLE)對(duì)阿爾茨海默病細(xì)胞模型HEK293-APPswe(20E2)的抗氧化應(yīng)激的影響，并從核因子E2相關(guān)因子2(Nrf2)/血紅素加氧酶1(HO-1)信號(hào)通路研究其作用機(jī)制。方法：Western blot檢測(cè)APP蛋白表達(dá)水平，ELISA檢測(cè)各組細(xì)胞上清Aβ1-40的量，確定細(xì)胞模型是否建立成功。用CCK-8檢測(cè)不同濃度的柿葉提取物對(duì)細(xì)胞活性的影響，選定干預(yù)最佳濃度。設(shè)分組：SH-SY5Y為空白對(duì)照組(NC組)，20E2為模型組(20E2組)，用柿葉提取物干預(yù)為加藥組(20E2+PLE組)。DCFH-DA熒光探針檢測(cè)各組細(xì)胞內(nèi)ROS的變化，ELISA檢測(cè)各組細(xì)胞上清Aβ1-42的量，Western blot檢測(cè)胞核、胞漿Nrf2和全細(xì)胞HO-1蛋白的表達(dá)水平變化。結(jié)果：與模型組相比，加藥組ROS表達(dá)減少，細(xì)胞外Aβ1-42濃度降低，細(xì)胞核內(nèi)Nrf2表達(dá)增多， HO-1蛋白含量增加。結(jié)論：柿葉提取物能有效降低模型組氧化應(yīng)激的水平，可能是通過(guò)降低Aβ1-42的聚集，激活Nrf2/HO-1信號(hào)途徑，促進(jìn)Nrf2合成和核轉(zhuǎn)位，從而促進(jìn)下游抗氧化蛋白HO-1的表達(dá)來(lái)減弱氧化應(yīng)激的損傷。

柿葉；氧化應(yīng)激；神經(jīng)保護(hù)；Nrf2/HO-1

阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease,AD)是以進(jìn)行性認(rèn)知功能障礙和行為損害為主的中樞神經(jīng)退行性疾病，其主要病理特征是β 淀粉樣蛋白(β-amyloid，Aβ)沉積[1,2]。β淀粉樣前體蛋白(β-amyloid precursor protein，APP)先后經(jīng)α-分泌酶、β-分泌酶和γ-分泌酶降解，但是APP基因突變使得APP蛋白更易于被β-分泌酶、γ-分泌酶降解，從而產(chǎn)生更多的Aβ[3]。20E2細(xì)胞株是攜帶瑞典突變APP基因的HEK293細(xì)胞，相比正常神經(jīng)細(xì)胞可產(chǎn)生更多的Aβ1-40和Aβ1-42，被用作AD的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞模型[4]。SH-SY5Y是人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株，作為正常的神經(jīng)細(xì)胞對(duì)照。

相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，氧化應(yīng)激和自由基損害與阿爾茨海默病發(fā)病極其密切，抗氧化治療也受到越來(lái)越多的關(guān)注。近來(lái)發(fā)現(xiàn)，柿葉具有抗氧化、降血脂、降血糖、抗菌、止血等藥效[5]。柿葉提取物可能通過(guò)調(diào)節(jié)JNK/caspase-3信號(hào)通路來(lái)減緩Aβ1-42導(dǎo)致的神經(jīng)元凋亡[6]。臨床發(fā)現(xiàn)，柿葉提取物在改善后循環(huán)缺血的療效上優(yōu)于銀杏葉提取物[7]。柿葉提取物腦心清片可保護(hù)缺血再灌注引起的腦損傷，防止神經(jīng)元興奮性毒性作用。對(duì)H2O2誘導(dǎo)的NG108-15細(xì)胞損傷有顯著的抗氧化作用[8,9]。柿葉提取物已廣泛應(yīng)用于臨床防治多種腦血管疾病，然而其對(duì)神經(jīng)退行性疾病的作用機(jī)制尚不明確。本文研究柿葉提取物對(duì)AD抗氧化作用的影響，觀察對(duì)細(xì)胞外Aβ濃度的變化，對(duì)細(xì)胞內(nèi)ROS的影響，從核轉(zhuǎn)錄因子 E2相關(guān)因子2(Nuclear factor-erythroid 2related factor2,Nrf2)/血紅素加氧酶-1(Heme oxygenase-1,HO-1)途徑研究其可能的作用機(jī)制，旨在為今后AD藥物研發(fā)提供一定依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)細(xì)胞 SH-SY5Y (神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞)購(gòu)自上海細(xì)胞庫(kù)，20E2(穩(wěn)定轉(zhuǎn)染APP的HEK293細(xì)胞)由山東大學(xué)齊魯醫(yī)院孫秀蓮教授贈(zèng)予。

1.1.2主要藥品和試劑 DMEM高糖培養(yǎng)基、胰蛋白酶(美國(guó)HyClone)、胎牛血清FBS、遺傳霉素G418(美國(guó)Gibco)；Aβ1-40、Aβ1-42ELISA試劑盒、蛋白分子量Marker(美國(guó)Invitrogen公司)；無(wú)水乙醇(國(guó)產(chǎn)分析純)；CCK-8細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒(dojindo)；BCA蛋白定量分析試劑盒、細(xì)胞核蛋白與細(xì)胞漿蛋白抽提試劑盒(碧云天)；兔源APP(Anti-Amyloid Precursor Protein)多克隆抗體、兔源Nrf2抗體、兔源HO-1抗體、小鼠抗人 β-actin 抗體(美國(guó)Abcam)；DCHF-DA試劑盒(美國(guó) Sigma公司)；PVDF膜(美國(guó)Millipore公司)；柿葉提取物(PLE)來(lái)自山東大學(xué)藥學(xué)院分析測(cè)定中心實(shí)驗(yàn)室。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1藥物配置 柿葉提取物為柿葉經(jīng)乙醇回流提取，水沉淀除雜后正丁醇萃取，回收正丁醇，經(jīng)干燥而得。主要成分為原兒茶酸6.26%、蘆丁7.80%、金絲桃苷10.70%、山奈酚-3-O-β-D吡喃葡萄糖苷3.27%、山奈酚-3-O-β-D吡喃半乳糖苷9.55%、楊梅素1.06%、槲皮素10.2%、柚皮素0.18%和山奈酚4.3%。柿葉提取物用無(wú)水乙醇溶解，配制成為1 g/L的母液，-20℃保存，使用時(shí)用DMEM培養(yǎng)液稀釋成終濃度為3 μg/ml。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng)、分組及藥物處理 SH-SY5Y，20E2細(xì)胞在37℃，5%CO2條件下，培養(yǎng)在含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，每2～3天傳一代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)。將兩種細(xì)胞分為以下3組：SH-SY5Y為空白對(duì)照組(NC組)，換入無(wú)血清培養(yǎng)基；模型組：20E2，換入無(wú)血清培養(yǎng)基(20E2組)；給藥組：加入終濃度為3 μg/ml的柿葉提取物的DMEM無(wú)血清培養(yǎng)基(20E2+PLE組)，培養(yǎng)24 h后使用。

1.2.3細(xì)胞活性檢測(cè) 將SH-SY5Y、20E2細(xì)胞種到96孔板中，長(zhǎng)至80%后，換用含不同濃度梯度(0～24 μg/ml)柿葉提取物的DMEM培養(yǎng)基，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，24 h后，吸棄培養(yǎng)基，加入含10%CCK-8工作液的DMEM 100 μl，37℃孵育2 h，酶標(biāo)儀檢測(cè)在470 nm處的吸光度。

1.2.4細(xì)胞核蛋白，細(xì)胞漿蛋白分離 各組細(xì)胞處理24 h后，棄細(xì)胞培養(yǎng)培養(yǎng)液，PBS沖洗細(xì)胞1次，用細(xì)胞刮將細(xì)胞刮下，離心，棄上清，按試劑盒說(shuō)明步驟分別加入細(xì)胞核細(xì)胞漿抽提試劑，渦旋振蕩，離心后得到細(xì)胞核蛋白和細(xì)胞漿蛋白。

1.2.5Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá) 各組細(xì)胞處理24 h后，按說(shuō)明書(shū)分別進(jìn)行全細(xì)胞、胞核和胞漿蛋白的提取，以BCA蛋白質(zhì)定量法檢測(cè)蛋白濃度，加上樣緩沖液，100℃變性5 min。制膠(12%分離膠，5%濃縮膠)，上樣30 μg，SDS-PAGE電泳將蛋白分離，然后100 mA恒流將目的蛋白轉(zhuǎn)移到NC膜上，用(10%)的BSA溶液室溫封閉30 min，再分別與兔抗人APP抗體(1∶2 000)，兔抗人Nrf2抗體(1∶500)，兔抗人HO-1抗體(1∶1 000)，β-actin抗體(1∶1 000)，TBP(1∶1 000)于搖床上4℃過(guò)夜，TBST溶液洗膜3次，包被二抗，以β-actin、TBP為內(nèi)參，掃膜。以目的條帶的IOD值與β-actin、TBP條帶的IOD值的比值作為該蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.6活性氧ROS(Reactive oxygen species)水平檢測(cè) 各組細(xì)胞處理24 h后吸棄培養(yǎng)基，用PBS沖洗1次，加入終濃度為10 μmol/L的DCFH-DA，于37℃孵育30 min，孵育結(jié)束后PBS洗二次，在熒光顯微鏡下選激發(fā)波長(zhǎng)485 nm，發(fā)射波長(zhǎng)538 nm觀察細(xì)胞并拍照。

1.2.7ELISA法檢測(cè)細(xì)胞上清Aβ1-42水平 相同數(shù)量級(jí)的各組細(xì)胞分別處理24 h后，取培養(yǎng)液上清離心后，按ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)Aβ1-42，通過(guò)酶標(biāo)儀檢測(cè)樣品吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算Aβ1-42的量。

2 結(jié)果

2.1Western blot與ELISA法檢測(cè)APP、Aβ1-40蛋白表達(dá) 20E2細(xì)胞較對(duì)照組APP表達(dá)量明顯增加，Aβ1-40的量明顯增加，NC組(47.28±5.36)pg/ml， 20E2組細(xì)胞Aβ1-40含量(2 105.84±70.69)pg/ml，兩組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，圖1)。表明20E2符合阿爾茨海默病病理細(xì)胞模型。

2.2CCK-8檢測(cè)不同濃度的PLE對(duì)細(xì)胞活性的影響 結(jié)果顯示PLE在3～6 μg/ml可增加細(xì)胞活性(P<0.05)，超過(guò)6 μg/ml后有抑制細(xì)胞活性的作用，為了減少藥物毒性作用，最終選用有效濃度范圍內(nèi)的低濃度的3 μg/ml為干預(yù)濃度。

圖1 Western blot與ELISA法檢測(cè)APP、Aβ1-40蛋白表達(dá)Fig.1 Expression of APP，Aβ1-40 detected by Western blot and ELISANote:*.P<0.01 vs NC group.

圖2 不同濃度的PLE對(duì)細(xì)胞活性的影響Fig.2 Cell viability in different concentrations of PLE was assayed by CCK-8 methodNote:*.P<0.05 vs NC group；#.P<0.05 vs 20E2 group.

2.3PLE對(duì)20E2細(xì)胞內(nèi)ROS變化的影響 采用DCFH-DA熒光探針檢測(cè)各組細(xì)胞ROS的表達(dá)，與NC組相比，20E2細(xì)胞內(nèi)ROS熒光信號(hào)明顯增強(qiáng)，氧化損傷明顯，PLE干預(yù)后，ROS熒光信號(hào)減弱(圖3)。

2.4PLE對(duì)細(xì)胞外Aβ1-42濃度的影響 用ELISA檢測(cè)相同數(shù)量級(jí)的各組細(xì)胞處理24 h后細(xì)胞外Aβ1-42濃度，與NC組相比，模型組細(xì)胞外Aβ1-42明顯增多，PLE干預(yù)后，加藥組較模型組細(xì)胞外 Aβ1-42明顯減少(圖4)。

2.5Western blot檢測(cè)Nrf2，HO-1蛋白表達(dá) 分別檢測(cè)胞漿Nrf2和胞核Nrf2，用PLE干預(yù)后，加藥組較模型組胞核Nrf2表達(dá)增加，全細(xì)胞蛋白HO-1表達(dá)增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖5)。

圖3 PLE對(duì)20E2內(nèi)ROS變化的影響(×100)Fig.3 Effect of PLE to ROS in HEK293-APPswe(×100)Note: A.NC group;B.20E2 group;C.20E2+PLE group.*.P<0.05 vs NC group.

圖4 PLE對(duì)細(xì)胞外Aβ1-42濃度的影響Fig.4 Effect of PLE to extracellular level of Aβ1-42Note:A.NC group;B.20E2 group;C.20E2+PLE group;*.P<0.05 vs NC group.

圖5 Western blot檢測(cè)Nrf2，HO-1蛋白表達(dá)Fig.5 Expression of Nrf2 and HO-1 protein detected by Western blotNote:1.NC group；2.20E2 group；3.20E2+PLE group.*.P<0.05 vs NC group；#.P<0.05 vs 20E2 group.

3 討論

研究表明，在AD的發(fā)生機(jī)制中，氧化應(yīng)激起重要作用，Aβ已被證實(shí)是引起氧化應(yīng)激的重要原因[10,11]。氧化應(yīng)激可能主導(dǎo) AD 的發(fā)生發(fā)展[12]，促進(jìn) Aβ聚集和微管相關(guān)蛋白 tau的磷酸化，加重 AD大腦中的氧化還原反應(yīng)的失衡，而過(guò)多的 Aβ 沉積及 tau蛋白的高度磷酸化則加速疾病進(jìn)程[13]。Aβ既是氧化應(yīng)激的來(lái)源又是結(jié)果，這種具有高度氧化還原活性的肽，能產(chǎn)生大量的活性氧(ROS)，ROS會(huì)引起細(xì)胞膜損傷，并最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡[14]。而ROS的攻擊是促進(jìn)Aβ惡性循環(huán)及腦內(nèi)擴(kuò)步的物質(zhì)之一，能加速AD的進(jìn)展[15]。所以，抗氧化應(yīng)激損傷治療在AD的治療中起重要作用[16]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，AD細(xì)胞模型中的ROS熒光強(qiáng)度比正常神經(jīng)細(xì)胞明顯增強(qiáng)，可能是由于Aβ聚集引發(fā)的細(xì)胞內(nèi)ROS增多。用柿葉提取物干預(yù)后能明顯降低AD細(xì)胞內(nèi)ROS的表達(dá)，細(xì)胞外Aβ1-42的濃度也有明顯下降，說(shuō)明柿葉提取物可能是Aβ和ROS 的共同清除劑，可有效降低Aβ的聚集，減輕由Aβ帶來(lái)的氧化應(yīng)激損傷，減輕細(xì)胞毒性。

Nrf2/HO-1被認(rèn)為是機(jī)體最重要的內(nèi)源性抗氧化信號(hào)通路[17]。氧化應(yīng)激情況下， Nrf2由細(xì)胞漿轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)，與抗氧化反應(yīng)原件結(jié)合[18]，參與下游II相代謝酶基因的轉(zhuǎn)錄，其中就包含血紅素加氧酶-1(Heme oxygenase-1,HO-1)[19]。HO-1具有抗氧化損傷和保護(hù)神經(jīng)元的作用[20]，HO-1蛋白量在AD患者腦內(nèi)含量明顯升高，與神經(jīng)元纖維纏結(jié)共同存在。并且，HO-1表達(dá)增加并不促進(jìn)Aβ的生成[21]。因此，我們認(rèn)為上調(diào)HO-1對(duì)AD有保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)中，AD模型20E2過(guò)量表達(dá)Aβ1-40，胞核中的Nrf2蛋白含量增加， HO-1蛋白表達(dá)增強(qiáng)，表明AD細(xì)胞模型氧化應(yīng)激增強(qiáng)，激活Nrf2/HO-1途徑，這是機(jī)體的保護(hù)反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與模型組相比，柿葉提取物能使AD模型細(xì)胞中胞漿Nrf2蛋白含量降低而胞核Nrf2蛋白含量升高，可能是由于柿葉提取物促進(jìn)了Nrf2核轉(zhuǎn)位率，從而使HO-1表達(dá)增加，增加細(xì)胞抗氧化的能力。

綜上所述，柿葉提取物能降低細(xì)胞外Aβ的濃度，減弱ROS對(duì)細(xì)胞的損傷，減緩氧化應(yīng)激在AD中的作用，其機(jī)制可能是通過(guò)上調(diào)Nrf2/HO-1通路活性來(lái)發(fā)揮抗氧化作用，來(lái)減緩AD的進(jìn)程，而柿葉提取物是否還通過(guò)其他路徑來(lái)發(fā)揮作用，有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

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[收稿2016-11-22]

(編輯 張曉舟)

AntioxidanteffectofpersimmonleafextracttoHEK293-APPswetransgeniccellsandeffecttoNrf2/HO-1pathway

WUXiao-Fan,MABin，HOUXun-Yao，HONGYan，SHENChao，LIUXue-Ping.DepartmentofSenileNeurology,ShandongProvincialHospitalAffiliatedtoShandongUniversity,Ji′nan250021,China

Objective:To investigate the effect of persimmon leaf extract (PLE) on HEK293-APPswe transgenic cells(20E2).Methods:To determine whether the 20E2 cells model was successfully established,the level of Aβ1-40in SH-SY5Y was detected and 20E2 cells(HEK293 cells stably expressing Swedish mutant APP)cultured in vivo by ELISA kit,and the expression of APP protein level was detected by Western blot.Cell viability was assayed by CCK-8 method and then selected the best concentration.Set groups:SH-SY5Y as normal control group (NC group),20E2 as model group (20E2 group),treating with PLE as treating group (20E2+PLE group).Reactive oxygen species (ROS) levels of each group were detected with DCFH-DA fluorescent probe.The extracellular level of Aβ1-42were detected by ELISA kit.Cytoplasmic Nrf2,Nuclear Nrf2,Whole-cell HO-1 were detected by Western blot.Results:Compared with model group,the expressions of ROS,Aβ1-42were down-regulated and the Nuclear Nrf2 and Whole-cell HO-1 were up-regulated in 20E2+PLE group.Conclusion:PLE can reduce the level of oxidative stress of model group effectively,it possibly reduce the aggregation of Aβ1-42and prevent oxidizing via activating Nrf2/HO-1 pathway .

Persimmon leaf extract(PLE);Oxidative stress;Neuroprotection;Nrf2/HO-1

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.06.010

①本文受國(guó)家自然科學(xué)基金(81371225)和山東省科技發(fā)展計(jì)劃(2014GSF118056)項(xiàng)目資助。

②山東大學(xué)藥學(xué)院，濟(jì)南250012。

吳小凡(1991年-)，女，在讀碩士，主要從事神經(jīng)退行性變方面研究，E-mail:wuxiaofan123@126.com。

及指導(dǎo)教師：劉雪平(1962年-),女，博士，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事神經(jīng)退行性變研究，E-mail:lxp6203@163.com。

R741.05

A

1000-484X(2017)06-0854-05