王 欣 李宜炯 龐 超 張瑞華 楊艷紅 朱振龍 王政民

(河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院病理科，石家莊050031)

Smad1在胃腺癌組織中的表達及對胃腺癌細(xì)胞遷移能力的影響研究①

王 欣 李宜炯②龐 超 張瑞華 楊艷紅 朱振龍 王政民

(河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院病理科，石家莊050031)

目的：研究Smad1在胃腺癌組織中的表達及對胃腺癌細(xì)胞遷移能力的影響。方法：提取收集的胃腺癌組織及對應(yīng)的癌旁組織中的蛋白，Western blot檢測Smad1的表達水平。以胃腺癌細(xì)胞HGC-27為研究對象，細(xì)胞轉(zhuǎn)染過表達Smad1的載體(p-EGFP-C1/Smad1)和Smad1小干擾RNA(Smad1 siRNA)，同時轉(zhuǎn)染p-EGFP-C1和 siRNA control為對照。細(xì)胞劃痕實驗檢測細(xì)胞遷移能力。Western blot檢測細(xì)胞中MMP-9、MMP-2、p-Akt、Akt的表達水平。Akt信號通路抑制劑LY294002(20 μg/ml)作用于胃腺癌細(xì)胞HGC-27，MTT檢測細(xì)胞增殖情況，細(xì)胞劃痕實驗檢測細(xì)胞遷移能力。Western blot檢測MMP-9、MMP-2、p-Akt、Akt蛋白表達水平。結(jié)果：胃腺癌組織中Smad1的水平明顯低于癌旁組織(P<0.01)。p-EGFP-C1/Smad1組細(xì)胞存活率和遷移率均明顯低于p-EGFP-C1組(P<0.01)。Smad1 siRNA組細(xì)胞存活率和遷移率均明顯高于siRNA control組(P<0.01)。 p-EGFP-C1、p-EGFP-C1/Smad1、siRNA control、Smad1 siRNA組細(xì)胞中Akt蛋白表達水平?jīng)]有變化。p-EGFP-C1/Smad1組細(xì)胞MMP-9、MMP-2、p-Akt蛋白表達水平明顯低于p-EGFP-C1組(P<0.01)。Smad1 siRNA組細(xì)胞MMP-9、MMP-2、p-Akt蛋白表達水平明顯高于siRNA control(P<0.01)。胃腺癌細(xì)胞與Akt信號通路抑制劑作用后細(xì)胞增殖和遷移趨勢與p-EGFP-C1/Smad1組一致。結(jié)論：Smad1在胃腺癌組織中低表達。Smad1能夠抑制胃腺癌細(xì)胞增殖和遷移，作用機制與Akt信號通路有關(guān)。

胃腺癌；Akt信號通路；增殖；遷移

據(jù)統(tǒng)計，在世界范圍內(nèi)每年有超過100萬的新增胃癌患者，有超過80萬患者死于胃癌，其中中國的新增胃癌患者和死亡人數(shù)占三分之一[1]。在中國，胃癌的發(fā)病率和致死率在全部惡性腫瘤中位居第3位，男性的發(fā)病率高于女性，農(nóng)村高于城市[2]。胃癌中有95%屬于胃腺癌。胃腺癌嚴(yán)重威脅著人類的生命健康。

Smad是一種重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)因子[3]。Smad1是Smad受體活化類型，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長、分化、凋亡等過程，在機體免疫系統(tǒng)中也有重要作用[4,5]。近年來的研究表明，Smad1在結(jié)直腸癌、舌鱗癌、子宮內(nèi)膜癌等多種癌癥中表達下調(diào)[6,7]。本研究中運用Western blot檢測胃腺癌組織中Smad1的水平，并探討Smad1對胃腺癌細(xì)胞增殖和遷移能力的影響，以期為進一步研究胃腺癌的發(fā)病機制奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1組織及細(xì)胞 選取2011年10月～2013年2月在我院確診切除的胃腺癌患者胃腺癌組織及距離腫塊5 cm以上的癌旁組織各56例，平均年齡(62.14±10.47)歲，其中女性20例，男性36例。人胃腺癌細(xì)胞HGC-27由河北醫(yī)科大學(xué)病理教研室提供。

1.1.2主要儀器及試劑 p-EGFP-C1/Smad1、 p-EGFP-C1由本實驗室保存；DMEM培養(yǎng)基、青鏈霉素、胰蛋白酶均購自于美國Sigma；胎牛血清(FBS)購自杭州四季青生物科技有限公司；MMP-9、MMP-2、p-Akt、Akt、Smad1、β-actin單克隆抗體均購自上海酶聯(lián)生物研究所；CO2培養(yǎng)箱購自美國Thermo。

1.2方法

1.2.1Western blot檢測胃癌組織中的Smad1水平 收集56例胃腺癌組織和癌旁組織，剪碎后，加入到組織勻漿器中，加入組織裂解液，放在冰上裂解30 min后，14 000 r/min離心20 min，吸取蛋白上清液到EP管中。取蛋白樣品，加入Loading buffer混合后，放在100℃的孵育器中煮沸3 min。將變性蛋白樣品加入到上樣孔中，電泳初始電壓為80 V，觀察溴酚藍進入分離膠后，將電壓調(diào)整為120 V至電泳結(jié)束。取出蛋白凝膠，洗滌后，放在轉(zhuǎn)印緩沖液中浸泡10 min。取出PVDF膜，100 mA恒流將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉液封閉后，加入一抗(500倍稀釋)、二抗(1 000倍稀釋)依次反應(yīng)后，滴加顯色液，顯影定影后，以β-actin為內(nèi)參，分析目的蛋白表達率。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng) 取出保存在-80℃的胃腺癌細(xì)胞HGC-27，37℃完全融化后，1 000 r/min離心10 min，棄掉上清液，在細(xì)胞中加入含有10%胎牛血清的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液，充分混合，接種到細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，放在37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞密度超過85%時，棄掉細(xì)胞培養(yǎng)液，加入0.25%的胰蛋白酶消化液消化細(xì)胞，離心后，用細(xì)胞培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞，根據(jù)實驗要求接種到細(xì)胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。

1.2.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染 取培養(yǎng)至對數(shù)生長期的胃腺癌細(xì)胞，加入胰蛋白酶消化后，接種到6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)過夜，觀察細(xì)胞融合度達到75%時，更換細(xì)胞培養(yǎng)液為不含有胎牛血清的不完全培養(yǎng)液，放在37℃孵育1 h。用Lipofectamine 2000將過表達Smad1的載體(p-EGFP-C1/Smad1)和Smad1小干擾RNA(Smad1 siRNA)轉(zhuǎn)染至胃腺癌細(xì)胞中，同時轉(zhuǎn)染p-EGFP-C1和 siRNA control為對照。放在37℃培養(yǎng)48 h后，Trizol法提取細(xì)胞中的總蛋白，Western blot檢測細(xì)胞中Smad1水平。

1.2.4MTT檢測細(xì)胞增殖 轉(zhuǎn)染后的胃腺癌細(xì)胞，經(jīng)胰蛋白酶消化后，1 000 r/min離心10 min，棄掉上清液，用細(xì)胞培養(yǎng)液懸浮后，接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔中加入細(xì)胞個數(shù)為2×104個，放在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后。在細(xì)胞中加入濃度為5 mg/ml 的MTT溶液，放在CO2培養(yǎng)箱中孵育反應(yīng)4 h。同時設(shè)置空白組，空白組中不加細(xì)胞。為了提高實驗的準(zhǔn)確性，每組設(shè)置8個復(fù)孔。吸除上清液，加入DMSO溶液150 μl，放置于避光條件下反應(yīng)10 min，觀察結(jié)晶物完全溶解后，酶標(biāo)儀檢測每孔的吸光度。計算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率=(實驗組OD值-空白組OD值)-(對照組OD值-空白組OD值)。

1.2.5細(xì)胞劃痕實驗檢測細(xì)胞遷移 取轉(zhuǎn)染后的胃腺癌細(xì)胞，接種到細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，放在37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，觀察細(xì)胞完全貼壁后，棄上清液，用移液槍槍頭垂直的在長滿細(xì)胞的培養(yǎng)瓶壁上劃出一條細(xì)痕，加入PBS洗滌兩次將劃出的細(xì)胞洗掉。放在37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞劃痕寬度，計算細(xì)胞遷移率。細(xì)胞遷移率=細(xì)胞遷移距離/細(xì)胞劃痕寬度。

1.2.6Western blot檢測細(xì)胞中MMP-9、MMP-2、p-Akt、Akt水平 轉(zhuǎn)染后的胃腺癌細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，收集細(xì)胞，Trizol法提取細(xì)胞蛋白，Western blot檢測細(xì)胞中MMP-9、MMP-2、p-Akt、Akt水平。步驟同1.2.1。

1.2.7阻斷Akt信號通路對胃腺癌細(xì)胞增殖遷移影響 培養(yǎng)至對數(shù)生長期的胃腺癌細(xì)胞，與20 μg/ml的Akt信號通路抑制劑LY294002作用48 h后記為抑制劑組，同時設(shè)置對照組，對照組不加入抑制劑LY294002。MTT檢測細(xì)胞增殖情況，細(xì)胞劃痕實驗檢測細(xì)胞遷移能力。Western blot檢測MMP-9、MMP-2、p-Akt、Akt水平。同1.2.1、1.2.4、1.2.5。

2 結(jié)果

2.1胃腺癌組織中Smad1蛋白表達水平結(jié)果 Western blot檢測了56例胃腺癌組織和癌旁組織中Smad1蛋白水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，胃癌組織中Smad1蛋白相對表達水平約為(0.18±0.05)，而癌旁組織中Smad1蛋白相對表達水平約為(0.46±0.06)。Smad1蛋白在胃腺癌組織中的表達水平明顯低于癌旁組織，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01 )，見圖1。

2.2轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中Smad1蛋白表達水平結(jié)果 胃腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染p-EGFP-C1、p-EGFP-C1/Smad1、 siRNA control、Smad1 siRNA后，培養(yǎng)48 h，Western blot檢測細(xì)胞中Smad1蛋白表達水平。結(jié)果顯示，p-EGFP-C1/Smad1組細(xì)胞中Smad1的水平明顯高于p-EGFP-C1，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。Smad1 siRNA組細(xì)胞中Smad1的水平明顯低于siRNA control，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見圖2、表1。

圖1 Western blot檢測胃腺癌組織中Smad1蛋白表達結(jié)果Fig.1 Expression of Smad1 in gastric adenocarcinoma tissues by Western blot

圖2 Western blot檢測轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中Smad1蛋白水平結(jié)果圖Fig.2 Expression of Samd1 in gastric adenocarcinoma cells transfected by Western blotNote:1 .p-EGFP-C1；2.p-EGFP-C1/Smad1；3.siRNA control；4.Smad1 siRNA.

2.3Smad1對胃腺癌細(xì)胞增殖遷移影響結(jié)果 轉(zhuǎn)染p-EGFP-C1、p-EGFP-C1/Smad1、siRNA control、Smad1 siRNA后，MTT檢測48 h的細(xì)胞存活情況，細(xì)胞劃痕實驗檢測細(xì)胞遷移能力。結(jié)果顯示，p-EGFP-C1/Smad1組細(xì)胞存活率和遷移率明顯低于p-EGFP-C1組，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，Smad1 siRNA組細(xì)胞存活率和遷移率明顯高于siRNA control，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見表1。

2.4Smad1對胃腺癌細(xì)胞MMP-9、MMP-2、p-Akt、Akt表達影響 轉(zhuǎn)染p-EGFP-C1、p-EGFP-C1/Smad1、siRNA control、Smad1 siRNA后，Western blot檢測48 h細(xì)胞中MMP-9、MMP-2、p-Akt、Akt蛋白水平。結(jié)果顯示，p-EGFP-C1、p-EGFP-C1/Smad1、siRNA con-trol、Smad1 siRNA組細(xì)胞中Akt蛋白表達水平?jīng)]有變化。p-EGFP-C1/Smad1組細(xì)胞MMP-9、MMP-2、p-Akt蛋白表達水平明顯低于p-EGFP-C1組，差異顯著(P<0.01)。Smad1 siRNA組細(xì)胞MMP-9、MMP-2、p-Akt蛋白表達水平明顯高于siRNA control，差異顯著(P<0.01)。見圖3、表2。

表1 轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中Smad1蛋白表達率、細(xì)胞存活率和細(xì)胞遷移率

Note：1)P<0.01 vs p-EGFP-C1；2)P<0.01 vs siRNA control.

圖3 Western blot檢測轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中MMP-9、MMP-2、p-Akt、Akt表達結(jié)果Fig.3 Expression of MMP-9,MMP-2,p-Akt and Akt in gastric adenocarcinoma cells transfected by Western blotNote:1.p-EGFP-C1；2.p-EGFP-C1/Smad1；3.siRNA control；4.Smad1 siRNA.

表2 轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中MMP-9、MMP-2、p-Akt、Akt蛋白表達率

Note：1)P<0.01 vs p-EGFP-C1；2)P<0.01 vs siRNA control.

表4 阻斷Akt信號通路后細(xì)胞中MMP-9、MMP-2、p-Akt、Akt蛋白表達率

Note：1)P<0.01 vs matched group.

2.5阻斷Akt信號通路對胃腺癌細(xì)胞增殖遷移影響結(jié)果 胃腺癌細(xì)胞與20 μg/ml的Akt信號通路抑制劑LY294002作用48 h后，MTT檢測細(xì)胞存活率，細(xì)胞劃痕實驗檢測細(xì)胞遷移率，Western blot檢測細(xì)胞中MMP-9、MMP-2、p-Akt、Akt表達水平。結(jié)果顯示，抑制劑組細(xì)胞存活率和遷移率明顯低于對照組，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。抑制劑組細(xì)胞中MMP-9、MMP-2、p-Akt水平明顯低于對照組，差異顯著(P<0.01)。見圖4、表3、4。

3 討論

Smads蛋白家族含有9個成員，其分子量大約為42～60 kD。Smad由高度保守的氨基酸、羧基端及含有脯氨酸的中間連接區(qū)組成[8]。Smad1由465個氨基酸組成，參與轉(zhuǎn)化生長因子-β信號通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)，對組織胚胎發(fā)育、機體免疫系統(tǒng)、組織修復(fù)及細(xì)胞生長等都具有重要作用[9,10]。 Smad1在糖尿病、癌癥等疾病的發(fā)生發(fā)展過程中也具有調(diào)控功能[11]。有研究表明，Smad1在肺癌、結(jié)直腸癌、垂體腺瘤等腫瘤中表達異常[12]。過表達Smad1后的小鼠垂體瘤細(xì)胞增殖能力明顯減弱，細(xì)胞周期阻滯在S期[13]。3，4-二氯異香豆素能夠通過上調(diào)BGC-823細(xì)胞中的Smad1水平發(fā)揮抗腫瘤的作用[14]。

表3 阻斷Akt信號通路后細(xì)胞存活率

Note：1)P<0.01 vs matched group.

圖4 Western blot檢測阻斷Akt信號通路后細(xì)胞中MMP-9、MMP-2、p-Akt、Akt表達結(jié)果Fig.4 Expression of MMP-9,MMP-2,p-Akt and Akt in gastric adenocarcinoma cells after Akt signaling pathway blocked by Western blotNote:1.Matched group；2.Control group.

絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(Akt)信號通路廣泛存在于生命機體中，在細(xì)胞生長、增殖等過程中發(fā)揮重要作用[15]。有研究表明，Akt信號通路在乳腺癌、肝癌、結(jié)直腸癌等多種癌癥中異?；罨?，而磷酸化的Akt(p-Akt)具有促進癌細(xì)胞增殖的作用[16,17]。用不同濃度的Akt信號通路抑制劑LY294002處理舌鱗癌細(xì)胞后，舌鱗癌細(xì)胞增殖和遷移受到抑制[18]?；|(zhì)金屬蛋白酶能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)，在腫瘤的轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用。MMP-2和MMP-9是基質(zhì)金屬蛋白酶的重要成員，在癌癥組織中過度表達[19]。

本研究中，用Western blot法檢測了胃腺癌組織中Smad1的水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Smad1在胃腺癌組織中表達下調(diào)。進一步通過體外實驗研究Smad1對胃腺癌細(xì)胞增殖遷移的影響。通過細(xì)胞轉(zhuǎn)染分別過表達和抑制了胃腺癌細(xì)胞中Smad1的水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，過表達Smad1的細(xì)胞存活率和細(xì)胞遷移能力均明顯降低。這提示，Smad1在胃腺癌細(xì)胞生長過程中發(fā)揮抑癌基因的作用。過表達Smad1的胃腺癌細(xì)胞中MMP-2、MMP-9的表達也明顯減弱，這說明Smad1可能是通過調(diào)控MMP-2和MMP-9影響胃腺癌細(xì)胞遷移能力的。結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，過表達Smad1的細(xì)胞中p-Akt水平降低。本研究進一步用Akt信號通路抑制劑作用于胃腺癌細(xì)胞，細(xì)胞存活率和遷移率降低。這提示，Smad1能夠抑制Akt信號通路的激活影響胃腺癌細(xì)胞的增殖和遷移。

綜上所述，Smad1在胃腺癌組織中表達下調(diào)。Smad1能夠抑制胃腺癌細(xì)胞的增殖和遷移發(fā)揮抑癌基因的作用，作用機制與Akt信號通路有關(guān)。本研究結(jié)果為進一步研究Smad1在胃腺癌發(fā)病機制中作用奠定了基礎(chǔ)，為治療胃腺癌提供了新方向。

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[收稿2016-10-19 修回2016-11-29]

(編輯 許四平)

StudyonexpressionofSmad1ingastricadenocarcinomaanditseffectonmigrationabilityofgastriccancercells

WANGXin,LIYi-Jiong,PANGChao,ZHANGRui-Hua,YANGYan-Hong,ZHUZhen-Long,WANGZheng-Min.DepartmentofPathology,theFirstHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050031,China

Objective:To investigate the expression of Smad1 in gastric carcinoma and the influence on the migration ability of gastric cancer cells.Methods:Collected the protein from the gastric cancer tissues and corresponding adjacent tissues,the expression level of Smad1 was detected by Western blot.In HGC-27 gastric cancer cells as the research object,the carrier cells transfected with overexpression of Smad1 (p-EGFP-C1/Smad1) and Smad1 small interfering RNA (Smad1 siRNA),while transfection of p-EGFP-C1 and siRNA control as control.MTT to detect cell proliferation.Cell migration ability was detected with cell scratch test.The expression levels of MMP-9,MMP-2,p-Akt and Akt in cells were detected by Western blot.Akt signal pathway inhibitor LY294002 (20 μg/ml) in gastric adenocarcinoma cells,MTT for cell proliferation,cell scratch assay for cell migration.The expression levels of MMP-9,MMP-2,p-Akt,Akt were detected by Western blot.Results:Smad1 in gastric carcinoma was significantly lower than the adjacent tissues (P<0.01).The cell survival rate and migration rate of p-EGFP-C1/Smad1 group were significantly lower than that of p-EGFP-C1 group (P<0.01).The cell survival rate and migration rate of Smad1 siRNA group were significantly higher than those in the siRNA control group (P<0.01).The expression levels of Akt protein in P-EGFP-C1,p-EGFP-C1/Smad1,Smad1 siRNA,siRNA control cells did not change.The expression levels of MMP-9,MMP-2 and p-Akt in p-EGFP-C1/Smad1 group were significantly lower than that in p-EGFP-C1 group (P<0.01).The expression levels of MMP-9,MMP-2 and p-Akt in Smad1 siRNA group were significantly higher than that in control siRNA (P<0.01).The cell proliferation and migration trends in gastric cancer cells effected by Akt signaling pathway inhibitor consistent with the p-EGFP-C1/Smad1 group.Conclusion:Low expression of Smad1 in gastric cancer tissue.Smad1 can inhibit the proliferation and migration of gastric cancer cells,the mechanism of action is related to the Akt signaling pathway.

Gastric adenocarcinoma;Akt signal pathway;Proliferation;Migration

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.06.008

①本文為河北省衛(wèi)計委青年科技課題(20150642)項目。

②通訊作者，河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院骨科，石家莊 050031，E-mail:185985103@qq.com。

王 欣(1982年-)，女，碩士，主治醫(yī)師，主要從事臨床腫瘤病理的研究，E-mail:wangxin1850@163.com。

R735.2

A

1000-484X(2017)06-0844-05