張 妮 左 麗 王 克 袁 靜

(貴州醫(yī)科大學(xué)免疫學(xué)教研室,貴陽550025)

·基礎(chǔ)免疫學(xué)·

DENV-2感染的HUVECs與CD4+T細(xì)胞相互作用對炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生的影響①

張 妮 左 麗 王 克 袁 靜

(貴州醫(yī)科大學(xué)免疫學(xué)教研室,貴陽550025)

目的：研究原代人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(Primary human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)被登革Ⅱ型病毒(DENV-2)感染，與CD4+T細(xì)胞共培養(yǎng)后，對產(chǎn)生主要炎性細(xì)胞因子的相互影響。方法：密度梯度離心法提取濃縮白細(xì)胞中的PBMC，免疫磁珠法陰性分選CD4+T細(xì)胞，流式檢測細(xì)胞表面CD3,CD4分子的表達(dá)和CD4+T細(xì)胞的純度。HUVECs經(jīng)S1P1特異性受體激動劑CYM-5442預(yù)處理24 h，加入103TCID50的DENV-2感染后，與CD4+T細(xì)胞共培養(yǎng)，Real-time RT-PCR動態(tài)檢測DENV-2感染HUVECs后病毒NS1基因及IL-6、IL-8的mRNA和CD4+T細(xì)胞內(nèi)IL-4、IL-17、TNF-α、IFN-γ的mRNA相對表達(dá)量；雙抗體夾心ELISA法檢測培養(yǎng)上清IL-6、IL-8的表達(dá)。結(jié)果：流式檢測經(jīng)免疫磁珠陰選的CD4+T 細(xì)胞純度為(98.02±0.32)%。DENV-2感染HUVECs后病毒NS1基因相對表達(dá)逐漸增加，在24 h(3.03±0.26，P<0.001)達(dá)到峰值后下降，而感染DENV-2后與CD4+T細(xì)胞共培養(yǎng)組的NS1基因相對表達(dá)量低于感染組，且呈下降趨勢。感染后IL-6和IL-8表達(dá)均有上調(diào)，與CD4+T 細(xì)胞共培養(yǎng)后，IL-6和IL-8在各時間點表達(dá)均明顯升高(P<0.01)。CYM-5442預(yù)處理的共培養(yǎng)感染組中，IL-6在24 h(28.91±2.34，P<0.05)、 36 h(19.36±0.1，P<0.05)和72 h(13.84±0.82，P<0.05)顯著下降，IL-8表達(dá)顯著下降。與感染后的HUVECs共培養(yǎng)后CD4+T細(xì)胞的IL-4、IL-17、TNF-α、IFN-γ的mRNA表達(dá)均明顯升高。結(jié)論：DENV-2能感染原代HUVECs；與CD4+T細(xì)胞共培養(yǎng)后NS1的表達(dá)被抑制。CD4+T細(xì)胞不僅能增強被DENV-2感染的HUVECs的活化，同時也能被感染后的HUVECs活化。

登革病毒；人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞；CD4+T細(xì)胞；細(xì)胞因子；免疫調(diào)節(jié)

登革病毒(Dengue virus,DENV)是單股正鏈RNA病毒，屬于黃病毒科黃病毒屬，有四種血清型[1]，可引起蚊媒傳播性疾病。在過去五十年里，全球的發(fā)病率增加了30倍，每年有5千萬至1億例登革病毒感染發(fā)生，對全球大多數(shù)人的健康造成了嚴(yán)重的威脅[2]。我國的流行地區(qū)主要為東南沿海和臺灣，近年來發(fā)病率明顯上升[3,4]。登革病毒感染后大部分患者表現(xiàn)為自限性的登革熱(Dengue fever,DF)，少數(shù)患者發(fā)展成為嚴(yán)重的登革出血熱(Dengue hemorrhagic fever,DHF)和登革休克綜合征(Dengue shock syndrome,DSS)，主要的臨床表現(xiàn)有嚴(yán)重的血漿滲漏，血小板減少，出血甚至休克等[5]。這些癥狀的發(fā)生與血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能障礙和病理損傷有一定的關(guān)系[6]。

登革病毒的致病機制有多種因素參與，涉及病毒和宿主之間復(fù)雜的相互影響[7,8]。宿主的免疫應(yīng)答被認(rèn)為是登革病毒感染的主要致病因素[9-11]。在DHF患者，活化T細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子和趨化因子可能會作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞導(dǎo)致血漿滲漏[12,13]。在急性登革熱患者中，T細(xì)胞被證明在抗登革病毒NS3和NS5蛋白中起主要作用[14]。雖然已有部分研究報道了T細(xì)胞和DENV感染之間的關(guān)系，但是T細(xì)胞在DENV感染和疾病發(fā)生中的作用至今仍不清楚[14-17]。

鞘氨醇激酶-1(Sphingosine kinase 1,SphK-1)產(chǎn)生具有生物活性的脂質(zhì)介質(zhì)磷酸鞘氨醇(S1P)從而調(diào)節(jié)TNF-α 激活NF-κB的反應(yīng)[18]。S1P作為細(xì)胞內(nèi)信號分子促進(jìn)細(xì)胞存活和免疫調(diào)節(jié)[19]。Sphk-1和S1P在維持內(nèi)皮細(xì)胞通透性和血管完整性中有重要作用[20,21]。

在本次研究中，我們選擇S1P1受體特異性激動劑CYM-5442作用于臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，建立CD4+T 細(xì)胞與HUVECs共培養(yǎng)體系，研究被DENV-2感染的HUVECs和CD4+T細(xì)胞之間的相互作用對炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生的影響。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞株 DENV-2標(biāo)準(zhǔn)株(NGC株)由本課題組常規(guī)增殖、保存于液氮。白紋伊蚊C6/36細(xì)胞株購于中科院昆明細(xì)胞庫。原代HUVECs購于美國Sciencell公司。

1.1.2濃縮白細(xì)胞 經(jīng)貴州省衛(wèi)生計生委員會和貴州醫(yī)科大學(xué)倫理委員會同意，采于黔南州中心血站。

1.1.3主要試劑及儀器 Human CD4+T Cell Enrichment Kit陰選試劑及磁力架(加拿大STEMCELL Technologies公司);ECM 培養(yǎng)基(含ECGS) (美國Sciencell公司)；淋巴細(xì)胞分離液和紅細(xì)胞裂解液(北京索萊寶)； Human IL-6 和IL-8 Platinum ELISA 試劑盒(eBioscience)；倒置熒光顯微鏡(Nikon)；Real-time system(Bio-Rad，CFX96)；多功能酶標(biāo)儀(Biotek Epoch)等。

1.1.4基因引物序列 各基因引物序列由上海生工合成(表1)。

1.2方法

1.2.1DENV-2的鑒定與毒力檢測 C6/36細(xì)胞增殖病毒，RT-PCR擴(kuò)增病毒NS1部分序列(413 bp)鑒定病毒，細(xì)胞病變法檢測病毒對C6/36細(xì)胞的TCID50滴度。

1.2.2原代HUVECs的培養(yǎng)與鑒定 ECM完全培養(yǎng)基(10% FBS,1% ECGS，1% 雙抗)復(fù)蘇HUVECs長至90%融合度后，棄上清，Hanks′洗滌后，加入0.25%胰蛋白酶(含0.02%EDTA)消化、傳代培養(yǎng)。免疫組化法觀察HUVECs細(xì)胞Ⅷ因子相關(guān)抗原，流式細(xì)胞術(shù)檢測原代HUVECs的CD31表面分子。

1.2.3CD4+T細(xì)胞的分離培養(yǎng)與鑒定 用 PBS對濃縮白細(xì)胞進(jìn)行稀釋后，用淋巴細(xì)胞分離液進(jìn)行密度梯度離心(20℃，2 000 r/min，20 min)，小心吸取PBMC，用含2% FBS的1640完全培養(yǎng)基洗3次，加入紅細(xì)胞裂解液，4℃處理15 min，離心，重懸細(xì)胞，計數(shù)。按細(xì)胞數(shù)約5×107cells/ml加入緩沖液(含2% FBS,1 mmol/L EDTA)重懸細(xì)胞至5 ml無菌流式上樣管中，按50 μl/ml細(xì)胞懸液的比例加入Human CD4+T Cell Enrichment Cocktail，混勻，室溫孵育10 min后，加入100 μl Magnetic Particles，室溫孵育5 min，加入緩沖液至2.5 ml，混勻后將上樣管放入磁力架中，室溫放置5 min，小心倒出細(xì)胞液，加入含10%FBS的1640全培養(yǎng)基洗2遍，重懸細(xì)胞，計數(shù)，待用。取1×105個細(xì)胞，用CD3、CD4雙染，室溫避光孵育20 min,PBS洗滌后重懸細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測CD4+T細(xì)胞的純度。

表1 相關(guān)基因引物序列

1.2.4CD4+T細(xì)胞的活性檢測 96孔板內(nèi)加入100 μl分選出的CD4+T細(xì)胞，約1×105cells/孔，加入anti-CD3e(5 μg/ml)和anti-CD28(2 μg/ml)單克隆抗體各50 μl，PBS為對照，37℃，5%CO2孵育。12 h 后，流式細(xì)胞儀檢測活化后CD4+T細(xì)胞表面CD4、CD69分子表達(dá)。

1.2.5共培養(yǎng)體系的建立 取原代HUVECs接種于六孔板內(nèi)(3×105個/孔)，37℃、5% CO2培養(yǎng)過夜貼壁后，加入CYM-5442激動劑(終濃度為1 μmol/ml)，37℃，5%CO2預(yù)處理24 h，ECM全培養(yǎng)基為對照。PBS洗滌后，加入104TCID50 ml-1的DENV-2 感染HUVECs，無血清ECM培養(yǎng)基為對照，37℃、5%CO2孵育2 h后，棄上清，PBS洗2遍，加入磁珠分離的CD4+T細(xì)胞(3×106個/孔)于Transwell上室內(nèi)(孔徑0.4 μm)共培養(yǎng)(含2%FBS,1%ECGS,1%雙抗的維持液)，對照組加入維持液，37℃、5%CO2培養(yǎng)。

1.2.6Real-time RT-PCR 分別于4、8、12、24、36、48和72 h收集細(xì)胞，Trizol法提取各組細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA后，以β-actin為內(nèi)參，采用SYBR-Green染料法檢測DENV-2 NS1、IL-6、IL-8、IL-4、IL-17、TNF-α、IFN-γ基因的表達(dá)，用2-ΔΔCt法計算各目的基因的相對表達(dá)量。

1.2.7雙抗體夾心ELISA法檢測培養(yǎng)上清IL-6和

IL-8的動態(tài)變化 收集上述各時間點的細(xì)胞培養(yǎng)上清，加入至ELISA樣品孔中，50 μl/孔，同時設(shè)空白對照和等比稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品。加入Biotin-conjugate液50 μl/孔，室溫孵育2 h后棄去液體，Wash buffer洗3次，甩干，加入Streptavidin-HPR液100 μl/孔，室溫孵育1 h棄去液體，再洗3次，加入100 μl/孔 TMB底物顯色液避光孵育10 min后，迅速加入100 μl/孔終止液，多功能酶標(biāo)儀檢測450 nm波長下的吸光度。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理 用SPSS17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析，統(tǒng)計方法采用單因素方差分析和獨立樣本t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1DENV-2的鑒定與毒力檢測 DENV-2感染后細(xì)胞出現(xiàn)融合、腫脹、脫落及空泡等典型的細(xì)胞病變。RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，出現(xiàn)400 bp 左右產(chǎn)物，與預(yù)期的413 bp符合，證實為DENV-2(圖1)。根據(jù)Reed-Muench法計算病毒的滴度為10-6.6/0.1 ml。

2.2HUVECs的鑒定 免疫組化法檢測原代HUVECsⅧ因子相關(guān)抗原，與BHK細(xì)胞陰性對照(圖2A)相比，HUVECs胞漿內(nèi)可見明顯的棕黃色顆粒(圖2B)。流式細(xì)胞術(shù)檢測HUVECs膜表面CD31分子表達(dá)率為99.86%,證實為內(nèi)皮細(xì)胞(圖3)。

2.3CD4+T細(xì)胞的鑒定與活性檢測 經(jīng)免疫磁珠陰性分選前PBMC中CD4+T細(xì)胞比例為33%～40%，分選后的CD4+T cells純度為(98.02±0.32)%，純度較高(圖4為其中一次鑒定結(jié)果)。分選后的CD4+T細(xì)胞經(jīng) anti-CD3和anti-CD28單克隆抗體刺激后12 h后，CD69的表達(dá)由2.08% 增至75.24%(圖5)，活化明顯。

圖1 DENV-2的部分序列擴(kuò)增Fig.1 Partial sequence of NS1 amplification fragmentNote:1.Marker; 2.PCR production of DENV-2.

2.4Real-time RT-PCR動態(tài)檢測DENV-2 感染HUVECs后病毒NS1基因mRNA的相對表達(dá)量 DENV-2感染HUVECs后，其NS1 mRNA相對表達(dá)逐漸增加后遞減(圖6)，在24 h達(dá)到峰值，與4 h相比，增加了(3.03±0.26)倍(P<0.001)。HUVECs感染DENV-2后與CD4+T細(xì)胞共培養(yǎng)組的病毒NS1 mRNA相對表達(dá)量總體比感染組低，且呈下降趨勢。

圖2 免疫組化法鑒定HUVECsⅧ因子相關(guān)抗原(×100)Fig.2 Identification of factor Ⅷ related antigen in HUVECs by immunohistochemisty(×100)Note:A.BHK cells for negative control；B.HUVECs.

圖3 流式檢測HUVECs表面CD31分子Fig.3 Ratio of CD31 on HUVECs by FCMNote:M1-1.Isotype;M1-2.CD31 positive.

圖4 分選前后CD4+ T細(xì)胞的純度Fig.4 Purity of isolated CD4+ T cellsNote:A.PBMC before isolation; B.CD4+ T cells after isolation.

2.5Real-time RT-PCR動態(tài)檢測各實驗組HUVECs的IL-6和IL-8的mRNA相對表達(dá) 被DENV-2感染的HUVECs，加入CD4+T細(xì)胞共培養(yǎng)，IL-6和IL-8各時間點表達(dá)均明顯升高(P<0.01)。CYM-5442預(yù)處理的HUVECs被DENV-2感染后與CD4+T細(xì)胞共培養(yǎng)，IL-6在24 h(28.91±2.34，P<0.05)， 36 h(19.36±0.1，P<0.05)，72 h(13.84±0.82，P<0.05)顯著下降(圖7A)，IL-8表達(dá)也均有所降低，在8 h(9.91±1.24，P<0.05)，12 h(12.24±2.06，P<0.05)，24 h(4.9±0.61，P<0.05)，48 h(2.11±0.25，P<0.05)顯著下降(圖7B)。

2.6Real-time RT-PCR檢測共培養(yǎng)后CD4+T細(xì)胞IL-4、IL-17、TNF-α、IFN-γ的mRNA相對表達(dá)變化CD4+T細(xì)胞與HUVECs共培養(yǎng)后，IL-4 mRNA相對表達(dá)在24 h(4.22±0.26，P<0.001)，36 h(1.69±0.28，P<0.001)明顯升高。與之相比，與感染DENV-2后的HUVECs共培養(yǎng)組的IL-4表達(dá)均有升高，在24 h(7.17±1.2，P<0.01)達(dá)峰值后逐漸下降。CYM-5442處理過的HUVECs感染組在4、8、12、24 h(4.5±1.15，P<0.01)，36、72 h(0.61±0.3，P<0.01)均低于未處理組(圖8A)。

圖5 流式檢測CD4+ T細(xì)胞活化后CD4、CD69表達(dá)Fig.5 Expression of CD4 and CD69 on activated CD4+ T cellsNote:A.Normal CD4+ T cells control; B.Activated CD4+ T cells.

圖6 HUVECs感染DENV-2與共培養(yǎng)感染組的病毒NS1 mRNA相對表達(dá)量的動態(tài)變化Fig.6 Relative expression of NS1 in HUVECs infected with DENV-2 co-culture with or without CD4+ T cellsNote:Compared with 4 h of HUVECs infected group,***.P<0.001;compared wtih 4 h of infected-HUVECs co-cultured with CD4+ T cells group,###.P<0.001.

圖7 HUVECs被DENV-2感染后與CD4+ T細(xì)胞共培養(yǎng)，其IL-6和IL-8的相對表達(dá)變化Fig.7 Relative expression of IL-6 and IL-8 in HUVECs infected by DENV-2,co-cultured with or without CD4+ T cellsNote:Infected group vs CYM-5442 pretreated infected-group,***.P<0.001;infected group vs.infected group co-culture with CD4+ T cells,#.P<0.05,##.P<0.01,###.P<0.001;co-culture-infected group vs.CYM-5442 pretreated co-culture-infected-group,△.P<0.05,△△.P<0.01,△△△.P<0.001.

圖8 CD4+ T細(xì)胞表達(dá)IL-4，IL-17，TNF-α,IFN-γ的動態(tài)變化Fig.8 Relative expression of IL-4,IL-17,TNF-α and IFN-γ in CD4+ T cellsNote:Co-cultured group vs.CD4+ T cells group,*.P<0.05,**.P<0.01,***.P<0.001;comparing to co-culture group with or without infection,#.P<0.05,##.P<0.01,###.P<0.001;pretreated co-culture infected-group vs.co-culture infected-group；△.P<0.05,△△.P<0.01,△△△.P<0.001.

圖9 雙抗體夾心ELISA法檢測各實驗組培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子IL-6和IL-8分析的動態(tài)變化Fig.9 Secretion of IL-6 and IL-8 in supernatant of each group

IL-17和IFN-γ的表達(dá)整體都隨時間的延長而呈逐漸增加的趨勢。與未感染的共培養(yǎng)組相比，感染DENV-2后的共培養(yǎng)組中CD4+T細(xì)胞IL-17的表達(dá)在12 h(1.27±0.16，P<0.01)，36 h(9.85±1.53，P<0.001)，48 h(8.31±0.81，P<0.01)，72 h(14.09±3.02，P<0.05)顯著增加，IFN-γ在8 h(0.78±0.1，P<0.001)，12 h(0.9±0.05，P<0.001)，36 h(7.47±1.04，P<0.001)，48 h(12.21±0.43，P<0.01)，72 h(20.4±0.95，P<0.05)顯著增加。而經(jīng)CYM-5442處理后的共培養(yǎng)感染組IL-17和IFN-γ分別從12 h和36 h后表達(dá)均下調(diào)(圖8B、D)。

CD4+T細(xì)胞和HUVECs共培養(yǎng)后，在24 h(2.76±0.27，P<0.001)， 36 h(4.20±0.14，P<0.001)和48 h(1.40±0.11，P<0.05)時TNF-α的表達(dá)明顯增加。與感染DENV-2的HUVECs共培養(yǎng)后，表達(dá)也均有上調(diào)，隨著時間變化上升至36 h后逐漸下降。與CYM-5442處理后的HUVECs共培養(yǎng)感染組的TNF-α與未處理組相比從8 h起TNF-α表達(dá)均有下降(圖8C)。

2.7雙抗體夾心ELISA法檢測細(xì)胞因子IL-6和IL-8的動態(tài)變化 HUVECs被DENV-2感染后IL-6分泌增加，被DENV-2感染的HUVECs與CD4+T細(xì)胞共培養(yǎng)后，培養(yǎng)上清中IL-6和IL-8的水平明顯高于未共培養(yǎng)組，且逐漸增加(圖9)。

3 討論

DENV感染后能引起登革出血熱(Dengue hemorrhagic fever，DHF)和登革休克綜合征(Dengue shock syndrome，DSS)，導(dǎo)致血管屏障功能改變，表現(xiàn)為水腫、出血、休克和病毒血癥等，目前尚無有效的抗病毒藥物和疫苗[1]。DENV感染的內(nèi)皮細(xì)胞在DHF/DSS病人和小鼠感染DENV的疾病模型中都有報道，DENV感染的內(nèi)皮細(xì)胞通過增加病毒血癥、分泌細(xì)胞因子、活化補體，或者轉(zhuǎn)化內(nèi)皮細(xì)胞為細(xì)胞免疫和體液免疫反應(yīng)的靶點等病理變化對發(fā)病機制起重要作用[7]。而這種作用并不是單純依靠內(nèi)皮細(xì)胞形成，而是在其他免疫細(xì)胞的共同作用下完成的。DENV引起的疾病的嚴(yán)重性和致命性被認(rèn)為是由于DENV引起的免疫應(yīng)答加強了對宿主的損傷[9,10]。

盡管內(nèi)皮細(xì)胞是主要的血流屏障，但是DENV對內(nèi)皮細(xì)胞的直接作用并不是主要的發(fā)病機制。DENV感染后血管完整性和功能的缺失不是由于內(nèi)皮細(xì)胞的損傷，而是DENV感染細(xì)胞后釋放血管活性因子引起的[22]。雖然已有很多報道研究了內(nèi)皮細(xì)胞在DENV感染發(fā)病機制中的作用，但是對于內(nèi)皮細(xì)胞和T細(xì)胞之間的免疫病理發(fā)病機制還尚不清楚。“細(xì)胞因子風(fēng)暴”已經(jīng)被證實在增加內(nèi)皮細(xì)胞通透性，導(dǎo)致血漿滲漏的過程中扮演著重要的角色[23]。本次研究中，HUVECs被DENV-2感染，與CD4+T 細(xì)胞共培養(yǎng)，各時間點的IL-6和IL-8的mRNA相對表達(dá)均有顯著增加，提示CD4+T細(xì)胞可增強被DENV-2感染的內(nèi)皮細(xì)胞的活化。越來越多的證據(jù)表明，內(nèi)皮細(xì)胞本身在免疫增強反應(yīng)中扮演了一個突出的角色，在DHF/DSS患者中病毒引起內(nèi)皮細(xì)胞通透性增加[24]。在體外，內(nèi)皮細(xì)胞可以被DENV感染并產(chǎn)生IL-6和IL-8，激活補體并可能發(fā)生凋亡[23]。高水平的IL-6和IL-8可直接增加血管滲透性，或者間接通過募集免疫細(xì)胞導(dǎo)致DHF的發(fā)病[25]。IL-8可以募集嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和初始T細(xì)胞到達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞表面[26]。

交叉反應(yīng)性T細(xì)胞通過免疫病理學(xué)對DHF的發(fā)生起作用[27]。DHF病人已被證明有細(xì)胞因子和趨化因子的循環(huán)增強，和DF患者相比，活化的DENV特異性交叉反應(yīng)性T細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ、IL-2和TNF-α[27,28]，提示了交叉反應(yīng)性T細(xì)胞的活化和登革熱相關(guān)疾病的嚴(yán)重程度。此次實驗共培養(yǎng)中的CD4+T細(xì)胞IL-4、IL-17、TNF-α、IFN-γ的mRNA表達(dá)也逐漸增加，說明被DENV-2感染的HUVECs能促使CD4+T細(xì)胞分泌大量細(xì)胞因子，這或許是引起炎癥反應(yīng)甚至血漿滲漏的重要因素。CD4+T細(xì)胞可以通過各種方式幫助機體對病原體發(fā)生應(yīng)答，比如可以產(chǎn)生細(xì)胞因子引起細(xì)胞毒性，通過活化APC間接幫助初始CD8+T細(xì)胞應(yīng)答，增強B細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞反應(yīng)，產(chǎn)生炎性因子和抗體，促進(jìn)記憶反應(yīng)[29]。被感染的巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和肥大細(xì)胞等免疫細(xì)胞，能分泌趨化因子CXCL-9/10/11、IL-6/8和RANTES[30,31]。同時，活化的T細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子和趨化因子可能會作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞導(dǎo)致血漿滲漏[32]。血漿滲漏是DHF患者的主要臨床特征。在重癥登革熱中有許多的因素引起，其中，交叉反應(yīng)性記憶T細(xì)胞活化能誘導(dǎo)促炎性細(xì)胞因子比如IFN-β的產(chǎn)生，這些細(xì)胞因子直接作用于內(nèi)皮細(xì)胞，導(dǎo)致血漿滲漏[7]。

本次研究證明在有CD4+T 細(xì)胞共培養(yǎng)的條件下，DENV-2的NS1基因表達(dá)下降，說明T細(xì)胞在早期感染過程中對DENV-2的復(fù)制有一定抑制作用。據(jù)報道，在急性DENV感染中，免疫抑制性的IL-10可以引起T細(xì)胞的凋亡，DHF患者中T細(xì)胞的數(shù)量比DF患者少，提示T細(xì)胞的凋亡減少了病毒的清除，從而導(dǎo)致抗病毒反應(yīng)減弱，引起嚴(yán)重的臨床疾病。最近，越來越多的人類或者小鼠的研究表明T細(xì)胞在DENV感染中發(fā)揮重要的保護(hù)作用[33]。盡管如此，目前對于DENV感染的發(fā)病機制尚不清楚，尤其是T細(xì)胞在DENV感染中的作用了解更少。本次研究對HUVECs和CD4+T細(xì)胞之間對細(xì)胞因子的相互影響有了一定了解，為今后繼續(xù)研究內(nèi)皮細(xì)胞在DENV-2感染中的免疫調(diào)節(jié)作用以及DENV感染后的免疫病理反應(yīng)提供了一定的基礎(chǔ)。

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[收稿2017-04-11]

(編輯 張曉舟)

EffectofinteractionbetweenCD4+TcellsandHUVECsinfectedwithDWNV-2onexpressionofinflammatorycytokines

ZHANGNi,ZUOLi,WANGKe,YUANJing.DepartmentofImmunology,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550025,China

Objective:To study the interaction of the inflammatory cytokines expression between CD4+T cells and primary human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) infected by dengue virus (DENV-2).Methods:PBMC was extracted from white blood cells by density gradient centrifugation,CD4+T cells were sorted by immunomagnetic beads.The expression of CD3 and CD4 molecules on the surface of cells was detected by flow cytometry to identify the purity of CD4+T cells.First,HUVECs were pretreated by specific-S1P1 receptor agonist CYM-5442 for 24 h,second,infected by DENV-2 on the titer of 103TCID50,then co-culturing with CD4+T cells,The relative expression of NS1 partial sequence and IL-6,L-8 mRNA of HUVECs,and IL-4,IL-17,TNF-α,IFN-γ of CD4+T cells detected by Real-time RT-PCR.IL-6 and IL-8 secreted in cultured supernatant analyzed by ELISA.Results:The purity of CD4+T cells was (98.02±0.32)%.The expression of NS1 gradually increased to 24 h (3.03±0.26,P<0.001),decreased after reaching the peak.The relative expression of NS1 in the group of co-cultured with CD4+T cells was lower than other groups.After infection,the expression of IL-6 and IL-8 were up-regulated,and the expression of IL-6 and IL-8 at each time point was significantly increased after co-culturing with CD4+T (P<0.01).IL-6 of CYM-5442 pretreatment group,in 24 h (28.91±2.34,P<0.05)，36 h(19.36±0.1，P<0.05) and 72 h(13.84±0.82，P<0.05) was significantly decreased,the expression of IL-8 also decreased significantly.The mRNA expression of IL-4,IL-17,TNF-α and IFN-γ in CD4+T cells was significantly increased after co-culturing with HUVECs.After the treatment with CYM-5442 group,the expression was decreased.Conclusion:DENV-2 could infect the primary HUVECs,and the expression of NS1 was inhibited after co-culturing with CD4+T cells.CD4+T cells can not only enhance the activation of HUVECs infected by DENV-2,but also can be activated by the infected HUVECs infected with DENV-2.

DENV-2;HUVECs;CD4+T cells;Cytokine;Immunomodulation

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.06.002

①本文受國家自然科學(xué)基金項目(81560263)、貴州省教育廳“125”重大科技專項(黔教合重大專項字[2012]008號)、貴州省教育科研優(yōu)秀人才省長基金(2009)和貴州省衛(wèi)計委科學(xué)技術(shù)基金項目(gzwjkj2006-1-005)資助。

張 妮(1991年-)，女，在讀碩士，主要從事抗病毒感染的分子免疫學(xué)研究，E-mail：zhangni21@163.com。

及指導(dǎo)教師：左 麗(1955年-)，女，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事抗病毒感染的分子免疫學(xué)研究，E-mail：zuoligymc@163.com。

R392.11

A

1000-484X(2017)06-0811-07