呂 洋，李 紅，岳紅云，姚長江

·基礎研究·

骨髓來源細胞表達的MMP-2/MMP-13在脈絡膜新生血管發(fā)生發(fā)展中的作用

呂 洋，李 紅，岳紅云，姚長江

目的 探討骨髓來源細胞(BMCs)基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)的動態(tài)表達及其與脈絡膜新生血管(CNV)發(fā)生、發(fā)展的關系。方法 選取成功接受骨髓移植的24只C57BL/6J綠色熒光蛋白(GFP)嵌合體小鼠為觀察組，未接受骨髓移植的48只C57BL/6J小鼠為對照組。兩組均予激光光凝照射以誘發(fā)CNV，利用Western blot法及明膠酶譜法檢測對照組在激光誘發(fā)前、誘發(fā)后1、3、5、7、10、14、28 d時MMP-2/MMP-13的表達情況，利用免疫熒光染色檢測觀察組CNV中GFP陽性細胞(即移植的骨髓細胞)是否表達MMP-2/MMP-13，并進行定量分析。結果 Western blot法、明膠酶譜法、免疫熒光均顯示在激光誘發(fā)早期兩組CNV中MMP-2的表達即開始快速增加，在誘導第3天表達量最高、活性最強，且觀察組BMCs表達MMP-2也在此時達到高峰，占總表達量的63.21%，隨后MMP-2表達量開始下降；在激光誘發(fā)早期兩組CNV中MMP-13的表達緩慢增加，在誘導后第7天表達量最高、活性最強，且觀察組BMCs表達MMP-13亦達最高峰，占總表達量的77.87%，隨后下降。結論 BMCs可能作為調(diào)控靶點改變MMP-2/MMP-13的表達，進而影響血管細胞的出芽、移行、凋亡及CNV纖維化。

脈絡膜新生血管化；骨髓來源細胞；基質(zhì)金屬蛋白酶

脈絡膜新生血管(CNV)是來自脈絡膜毛細血管的增殖血管，多位于黃斑部，是目前臨床40余種眼病共同的病理過程，可造成嚴重的視力損害[1]。近年研究發(fā)現(xiàn)，基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)在CNV形成過程中發(fā)揮重要作用，其參與細胞移行，降解細胞外基質(zhì)，促進新生血管出芽，有利于骨髓來源細胞(BMCs)趨化參與新生血管形成[2]。CNV原位細胞表達MMPs是有限的，BMCs參與CNV生成可能是MMPs的重要來源[3-7]。本研究探討參與CNV生成的BMCs是否為MMPs的重要來源及其對CNV發(fā)生、發(fā)展的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器 兔抗小鼠MMP-2/MMP-13多克隆抗體(美國Abcam公司)，羊抗兔IgG二抗(美國BioLab公司)，DyLight594標記的羊抗兔抗體(美國Earth公司)。

1.2 動物來源及分組 采用6～8周齡綠色熒光蛋白(green fluorescent protein, GFP)雌性轉基因小鼠作為骨髓移植供體，體重18～24 g，由第四軍醫(yī)大學神經(jīng)生物學教研室惠贈；受體鼠為6～8周齡的野生型雌性C57BL/6J小鼠，體重18～24 g，由第四軍醫(yī)大學實驗動物中心提供，其中接受骨髓移植的26只C57BL/6J GFP嵌合體小鼠為觀察組，未接受骨髓移植的48只C57BL/6J小鼠為對照組。

1.3 骨髓移植及嵌合程度分析 ①骨髓移植：觀察組行60Co照射，總劑量為8.0 Gy，1.0 Gy/min。照射后12 h內(nèi)經(jīng)尾靜脈注射制備好的BMCs細胞懸液，每只300 μl[5]；②嵌合程度分析：移植后28 d采用流式細胞儀分析血液樣本中表達GFP的細胞在單核細胞中所占比例[8]。

1.4 激光光凝照射誘發(fā)CNV 對照組48只小鼠與觀察組骨髓移植成功的24只小鼠均行激光光凝照射，波長532 nm，時間0.1 s，光斑直徑75 μm，功率100 mw，每只眼6～8個激光斑，距視盤1～1.5個盤直徑[9]。

1.5 Western blot法檢測對照組CNV中MMP-2/MMP-13的表達 取24只小鼠，隨機分為激光誘發(fā)前、誘發(fā)后第1、3、5、7、10、14、28天，每個時間點3只，將小鼠眼球的視網(wǎng)膜及脈絡膜組織加入細胞裂解液制備的蛋白樣品中，120 V電壓下4℃電泳2 h。利用電轉移法將蛋白轉移至硝酸纖維素濾膜上，室溫封閉2 h，將濾膜與兔抗鼠多克隆一抗MMP-2/MMP-13(濃度分別為1∶4000、1∶5000)混勻后于4℃下封閉過夜，后用TBST沖洗濾膜3次，將膜轉移至羊抗兔IgG二抗(濃度為1∶1000)于37℃孵育2 h，TBST再次沖洗濾膜，使用化學發(fā)光顯影檢測器觀察，應用UVP圖像分析軟件進行分析。

1.6 明膠酶譜法檢測對照組CNV中MMP-2/MMP-13的表達 取24只小鼠，隨機分為激光誘發(fā)前、誘發(fā)后第1、3、5、7、10、14、28天，每個時間點3只，將小鼠眼球的視網(wǎng)膜及脈絡膜組織勻漿、離心制備成蛋白抽提液，取5 μl上樣于含0.1%明膠的8%聚丙烯酰胺凝膠中進行SDS-PAGE電泳(血漿樣品先經(jīng)1∶40稀釋后再上樣)。電泳結束后將凝膠置于洗脫液(2.5% Triton X-100，50 mmol/L Tris-HCl，5 mmol/L CaCl2，1 μmol/L ZnCl2；pH 7.6)中振蕩洗脫2次，每次45 min，再用漂洗液(除不含Triton X-100外其余同洗脫液)漂洗2次，每次20 min，以上均在4℃環(huán)境中進行，再將凝膠置于37℃的孵育液(50 mmol/L Tris-HCl,5 mmol/ L CaCl2,1 μmol/L ZnCl2，0.02% Brij-35；pH 7.6)中孵育42 h。孵育結束后經(jīng)染色液(0.05% Coomassic亮藍、30%甲醇、10%乙酸)染色3 h，脫色液A、B、C(甲醇濃度分別為30%、20%、10%，乙酸濃度分別為10%、10%、5%)分別脫色0.5、1及2 h，可見MMP-2和MMP-13位于藍色背景的透亮帶上。此凝膠成像以反轉模式打印，使酶解活性表現(xiàn)為黑色條帶，經(jīng)圖像分析系統(tǒng)讀取條帶面積和灰度。條帶酶解量=條帶面積×(條帶灰度-背景灰度)，比活=酶解量÷樣品蛋白濃度，用以反映酶含量。

1.7 免疫熒光染色觀察MMP-2/MMP-13的表達 取觀察組、對照組各24只小鼠，隨機分為激光誘發(fā)前、誘發(fā)后第1、3、5、7、10、14、28天，每個時間點3只。在-20℃環(huán)境下做垂直于視網(wǎng)膜8～10 μm的冰凍切片，經(jīng)干燥、封閉后與兔抗小鼠MMP-2/MMP-13多克隆抗體(濃度分別為1∶200、1∶300)室溫孵育過夜，洗滌后滴加紅色熒光標記的山羊抗兔IgG抗體(濃度為1∶300)，室溫孵育3 h，洗滌、封片后在激光共聚焦顯微鏡下觀察并拍照。以PBS代替一抗作空白對照。觀察CNV中GFP陽性細胞(即移植的骨髓細胞)表達MMP-2/MMP-13的情況。顯微鏡下BMCs標記為綠色熒光，MMP-2/MMP-13為紅色熒光，兩者共同聚焦部分為黃色熒光。采用Image J測量BMCs表達的MMP-2/MMP-13的面積(黃色)和CNV表達MMP-2/MMP-13總面積(紅色)(以像素為單位)。分析CNV中MMP-2/MMP-13的表達總量及BMCs表達構成比。

2 結果

2.1 骨髓移植后嵌合程度分析 觀察組骨髓移植28 d后嵌合度>85%共24只，成功率為92.31%，其外周血單核細胞中GFP細胞所占比例平均(90.83±3.68)%，符合后期實驗要求[7]，見圖1。

圖1 流式細胞儀分析兩組小鼠骨髓嵌合程度

1a.對照組骨髓細胞流式分析結果示：大部分骨髓細胞為陰性;1b.觀察組骨髓細胞流式分析結果示：大部分骨髓細胞為陽性

2.2 Western blot法檢測對照組CNV中MMP-2/MMP-13的表達 隨著時間的延長，MMP-2/MMP-13的表達大體呈先升高后下降的趨勢，均在激光誘發(fā)前表達量最低，MMP-2在激光誘發(fā)后第1天開始快速增加，第3天達高峰，隨后下降；MMP-13在激光誘發(fā)后第1天緩慢增加，第7天達高峰，隨后下降，見表1、圖2。

表1 Western blot法檢測對照組脈絡膜新生血管在不同時間點MMP-2/MMP-13相對表達量的變化

2.3 明膠酶譜法檢測對照組CNV中MMP-2/MMP-13的表達 隨著時間的延長，MMP-2/MMP-13的表達大體呈先升高后下降的趨勢。MMP-2在激光誘發(fā)前活性最低，激光誘發(fā)后第1天開始增加，第3天活性最強，隨后開始下降；MMP-13在激光誘發(fā)后第1天活性最低，隨后開始增加，第7天活性最強，隨后開始下降，見表2、圖3。

2.4 觀察組MMP-2/MMP-13的水平變化 觀察組免疫熒光圖像顯示，激光誘發(fā)后GFP陽性的BMCs在CNV區(qū)域聚集，同時表達MMP-2/MMP-13(圖4)。采用Image J分析發(fā)現(xiàn)BMCs表達的MMP-2在誘發(fā)早期即開始快速增加，第3天到達高峰，占總表達量的63.21%，隨后開始下降；MMP-13在誘發(fā)早期開始緩慢增加，第7天表達量達高峰，占總表達量的77.87%，隨后開始下降，與不同時間點總表達趨勢一致，見圖5。對照組免疫熒光染色未見綠色熒光，說明綠色熒光確由供體鼠骨髓細胞發(fā)出。

圖2 Western blot法檢測對照組脈絡膜新生血管在不同時間點MMP-2/MMP-13相對表達量變化

2a為MMP-2/MMP-13代表性蛋白條帶圖，2b為MMP-2/MMP-13蛋白表達量比較

表2 明膠酶譜法檢測對照組脈絡膜新生血管在不同時間點MMP-2/MMP-13相對表達量的變化

3 討論

因各種原因造成的視網(wǎng)膜缺血、缺氧，均可誘導來自脈絡膜的病理性新生血管侵入視網(wǎng)膜，損傷正常的脈絡膜及視網(wǎng)膜結構，導致出血，是進行性視力損傷的主要原因之一，嚴重影響生活質(zhì)量。有研究證實，BMCs能移行至病變損傷部位，分化為多種細胞，參與CNV的發(fā)生、發(fā)展，還可作為載體，將藥物、藥物激活物質(zhì)等帶到損傷部位，起到靶向治療作用[4,10]。

圖3 明膠酶譜法檢測對照組脈絡膜新生血管在不同時間點MMP-2/MMP-13相對表達量的變化

3a為MMP-2/MMP-13代表性蛋白條帶圖，3b為MMP-2/MMP-13蛋白表達量比較

MMPs是CNV生成所必需的物質(zhì)[4,7]，是一類在結構上具有顯著同源性鋅離子依賴性內(nèi)肽酶[4,7]，可降解膠原活性，主要降解血管基底膜和細胞外基質(zhì)。CNV生成時先在MMPs作用下分解基底膜與細胞外基質(zhì)，后血管內(nèi)皮細胞(VEC)方能分裂增殖形成幼芽，進而發(fā)展為CNV。因此，MMPs是CNV生成的基礎，其中MMP-13主要降解Ⅰ、Ⅲ型膠原，MMP-2主要降解Ⅳ、Ⅴ型膠原。有研究顯示堿性成纖維細胞生長因子(pigment epithelium-derived factor, PEDF)為MMP-2底物[4,7]，是目前已知的功能最強大的內(nèi)源性新生血管抑制因子，能促進VEC凋亡,抑制VEC增殖和移行，下調(diào)血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的表達，阻止其與受體結合，減少VEGF誘發(fā)的血管滲漏并抑制炎癥反應，且PEDF可阻止神經(jīng)元凋亡，從而保護視網(wǎng)膜。

圖4 免疫熒光檢測觀察組脈絡膜新生血管MMP-2/MMP-13的表達情況(骨髓來源細胞為綠色，MMP-2/MMP-13為紅色，兩者共同表達區(qū)域為黃色)

4a為激光誘發(fā)后第3天MMP-2與骨髓來源細胞的表達，4b為激光誘發(fā)后第7天MMP-2與骨髓來源細胞的表達，4c為激光誘發(fā)后第7天MMP-13與骨髓來源細胞的表達，4d為激光誘發(fā)后第28天MMP-13與骨髓來源細胞的表達；GFP為綠色熒光蛋白；DAPI為細胞核特異性標志物

圖5 觀察組脈絡膜新生血管在不同時間點骨髓來源細胞MMP-2/MMP-13的表達構成比

5a為激光誘發(fā)后各時間點MMP-2的總表達量及其構成比，5b為激光誘發(fā)后各時間點MMP-13的總表達量及其構成比

眼內(nèi)的PEDF主要來源于視網(wǎng)膜色素上皮(RPE)細胞，CNV區(qū)域PEDF表達顯著下調(diào)，而CNV的形成可發(fā)揮營養(yǎng)神經(jīng)及保護作用，因此，PEDF是CNV相關疾病的理想治療因子。本研究證明，在激光誘發(fā)后，MMP-2/MMP-13的表達大體呈先上升后下降的趨勢，且MMP-2的表達升高更早。MMP-2與MMP-13的表達上調(diào)可降解CNV基底膜和細胞外基質(zhì)Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ及Ⅴ型膠原，為血管細胞的增殖、移行、出芽創(chuàng)造條件，促進CNV早期的快速發(fā)展。PEDF是CNV最強的內(nèi)源性抑制因子，有研究發(fā)現(xiàn)處于活動期富含血管的CNV中VEGF和PEDF均高表達，而在靜止的、纖維化的CNV中二者的表達均較弱[11]，提示VEGF表達上調(diào)是CNV發(fā)生、發(fā)展的啟動因素，且在VEGF誘導PEDF上調(diào)這一反饋機制的作用下，PEDF濃度亦升高。PEDF為MMP-2底物，其對PEDF的降解可促進CNV形成和視網(wǎng)膜損傷[12]。本研究發(fā)現(xiàn)激光誘發(fā)早期MMP-2表達迅速上調(diào)，對于打破VEGF與PEDF的平衡及激發(fā)新生血管的形成非常重要；在激光誘發(fā)后期，MMP-2表達下調(diào)，對PEDF的降解作用減弱，促使了血管膜纖維化。

激光誘發(fā)后7～14 d是CNV生長高峰期[13]，BMCs在CNV早期即開始聚集[6]，于激光誘發(fā)后第7天BMCs熒光強度最強[3]，MMP-13的表達亦達高峰，占MMP-13總表達量的77.87%，與Lecomte等[7]結果一致,提示BMCs對CNV生成時MMP-13的迅速上調(diào)起主要作用,同樣說明在MMP-2表達高峰期，大部分來自BMCs，說明BMCs對MMP-2的表達上調(diào)亦起主要作用。BMCs不但參與CNV的細胞構成，同時為CNV生成提供重要的分子基礎。由此推測，BMCs可通過分泌MMP-2/MMP-13而作用于CNV發(fā)生、發(fā)展的多個環(huán)節(jié)，對CNV的病理過程產(chǎn)生影響，且MMP-2與MMP-13在BMCs參與CNV發(fā)生發(fā)展過程中可能扮演關鍵角色[14-15]。

在激光誘導小鼠CNV模型中，BMCs是MMP-2/MMP-13的重要來源，提示BMCs可能作為調(diào)控靶點以改變MMP-2/MMP-13的表達，進而影響血管細胞的出芽、移行、凋亡及CNV纖維化。本研究從BMCs參與CNV發(fā)生發(fā)展的角度探索CNV的發(fā)病機制，尋找一個新的、更高效的分子靶點，實現(xiàn)對CNV的多角度治療，從而為臨床工作提供新的理論依據(jù)。

[1] Li Calzi S, Neu M B, Shaw L C,etal. EPCs and pathological angiogenesis: when good cells go bad[J].Microvasc Res, 2010,79(3):207-216.

[2] Hoffmann S, He S, Ehren M,etal. MMP-2 and MMP-9 secretion by rpe is stimulated by angiogenic molecules found in choroidal neovascular membranes[J].Retina, 2006,26(4):454-461.

[3] Barnett J M, Penn J S, Jayagopal A. Imaging of endothelial progenitor cell subpopulations in angiogenesis using quantum dot nanocrystals[J].Methods Mol Biol, 2013,1026:45-56.

[4] Hou H Y, Liang H L, Wang Y S. Bone marrow-derived cells in neovascular age-related macular degeneration: contribution and potential application[J].Ophthalmic Res, 2011,45(1):1-4.

[5] Hou H Y, Wang Y S, Xu J F,etal. The dynamic conduct of bone marrow-derived cells in the choroidal neovascularization microenviroment[J].Curr Eye Res, 2006,31(12):1051-1061.

[6] Hou H Y, Wang Y S, Xu J F,etal. Nicotine promotes contribution of bone marrow-derived cells to experimental choroidal neovascularization in mice[J].Exp Eye Res, 2008,86(6):983-990.

[7] Lecomte J, Louis K, Detry B,etal. Bone marrow-derived mesenchymal cells and MMP13 contribute to experimental choroidal neovascularization[J].Cell Mol Life Sci, 2011,68(4):677-686.

[8] Espinosa-Heidmann D G, Caicedo A, Hernandez E P,etal. Bone marrow-derived progenitor cells contribute to experimental choroidal neovascularization[J].Invest Ophthalmol Vis Sci, 2003,44(11):4914-4919.

[9] 楊秀梅,王雨生.脈絡膜新生血管的動物模型[J].國際眼科縱覽,2006,30(3):166-170.

[10]侯慧媛,王雨生,徐建峰.骨髓來源細胞在脈絡膜新生血管生成中的作用[J].中華眼底病雜志,2009,25(1):30-33.

[11]Tong J P, Yao Y F. Contribution of VEGF and PEDF to choroidal angiogenesis: a need for balanced expressions[J].Clin Biochem, 2006,39(3):267-276.

[12]Chung C, Shugrue C, Nagar A,etal. Ethanol exposure depletes hepatic pigment epithelium-derived factor, a novel lipid regulator[J].Gastroenterology, 2009,136(1):331-340.

[13]Hou H Y, Liang H L, Wang Y S,etal. A therapeutic strategy for choroidal neovascularization based on recruitment of mesenchymal stem cells to the sites of lesions[J].Mol Ther, 2010,18(10):1837-1845.

[14]高凡,王雨生,侯慧媛.兩種缺氧模型對小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞中基質(zhì)金屬蛋白酶表達及其對促血管形成能力的影響[J].眼科新進展,2016,36(5):401-405.

[15]Gao F, Sun M, Gong Y,etal. MicroRNA-195a-3p inhibits angiogenesis by targeting Mmp2 in murine mesenchymal stem cells[J].Mol Reprod Dev, 2016,83(5):413-423.

Effect of MMP-2/MMP-13 Expression by Bone Marrow-derived Cells in Development of Choroidal Neovascularization

LYU Yang1, LI Hong1, YUE Hong-yun1, YAO Chang-jiang2
(1. Department of Ophthalmology, Lanzhou General Hospital of Lanzhou Military Area Command, Lanzhou 730000, China; 2. Department of Osteology, the Second Hospital of Lanzhou University, Lanzhou 730000, China)

Objective To investigate matrix metalloproteinase (MMP) dynamic expression by bone marrow-derived cells (BMCs) and its relationship with pathogenesy and development of choroidal neovascularization (CNV). Methods A total of 24 C57BL/6J green fluorescent protein (GFP) of allophenic mice, who underwent bone marrow transplantation successfully, were selected as observation group, while other 48 C57BL/6J mice without bone marrow transplantation were selected as control group. CNV was induced by irradiating with laser photocoagulation for all mice. In control group, MMP-2/MMP-13 expressions were detected by Western blot and gelatin zymography method before induction, and at 1st, 3rd, 5th, 7th, 10th, 14thand 28thd after induction; In observation group, immunofluorescence staining was used to identify whether or not MMP-2/MMP-13 was expressed by GFP -positive BMCs in CNV, and quantitative analysis was also performed. Results Western blot, gelatin zymography and immunofluorescence staining methods all showed that MMP-2 expressions were rapidly increased in the early laser stage of CNV patients in two groups, and the expressions of BMCs and MMP-2 reached the highest values and strongest activity at 3rdd after induction; the highest value of MMP-2 expression in observation group occupied 63.21% of the total expression; and then MMP-2 expression began to decline. MMP-13 expression showed slowly increases at the early laser stage of CNV patients in two groups, and the highest expression and strongest activity were found at 7thd after induction; the highest values of MMP-13 expression in CNV patients in two groups and in observation group occupied 77.87% of the total expression; and then MMP-13 expression began to decline. Conclusion BMCs can be used as target point to regulate MMP-2/MMP-13 expression, and it can further affect pullulation, transmigration, apoptosis and fibration of CNV.

Choroidal neovascularization; Bone marrow derived cells; Matrix metalloproteinase

國家自然科學基金資助項目(81500748)；甘肅省自然基金項目(1308RJZA249)

730000 蘭州，蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院眼科(呂洋、李紅、岳紅云)；730000 蘭州，蘭州大學第二醫(yī)院骨科(姚長江)

姚長江，E-mail：15117203811@163.com

R773.4

A

1002-3429(2017)06-0103-05

10.3969/j.issn.1002-3429.2017.06.036

2017-02-27 修回時間：2017-03-28)