韓駿飛，李明軍，孫凌峰，王崇禧

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154003)

大鼠在不同力度打擊造成彌漫性軸索損傷后腦脊液NGF的表達(dá)①

韓駿飛，李明軍，孫凌峰，王崇禧

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154003)

目的：探究大鼠腦脊液中神經(jīng)生長因子(Nervegrowthfactor,NGF)在不同力度打擊造成彌漫性軸索損傷(Diffuseaxonalinjury,DAI)后的表達(dá)及其與損傷嚴(yán)重水平的相關(guān)性。方法：選取48只SD大鼠(雌雄不限)，隨機(jī)分為A、B、C、D、E和假手術(shù)組F。在Marmarou等研究的基礎(chǔ)上，制作不同力度DAI模型致傷裝置，分別采用A組(砝碼懸掛高度及質(zhì)量：70cm×400g)(下同)，B組(80cm×400g)，C組(90cm×400g)，D組(100cm×400g)，E組(110cm×400g)沖擊力擊打大鼠頭部，以造出DAI模型以及F假手術(shù)組(無沖擊力損傷)，共6組。于造模成功后第24h，取腦脊液采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測，后處死大鼠制作腦組織標(biāo)本，觀察選取符合DAI模型的大鼠腦脊液標(biāo)本進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。結(jié)果：在正常大鼠腦脊液中存在NGF，且DAI后腦脊液NGF含量較正常增多，與假手術(shù)組有差別(P<0.05)；損傷后各組間也有差別(P<0.05)，隨損傷程度加重，大鼠腦脊液中NGF含量增加。結(jié)論：NGF水平與大鼠彌漫性軸索損傷的嚴(yán)重程度密切相關(guān)，NGF的水平可以作為評估DAI嚴(yán)重程度的一種方法。

彌漫性軸索損傷；神經(jīng)生長因子；酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)；大鼠

NGF是研究較為廣泛的神經(jīng)生長因子，通過整體實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ桶l(fā)現(xiàn)NGF作用巨大，可以保護(hù)和修復(fù)變性以及壞死的腦缺血神經(jīng)細(xì)胞[1]。NGF結(jié)合受體trkA進(jìn)而產(chǎn)生作用。成熟神經(jīng)細(xì)胞的存活需要其維持，其對損傷細(xì)胞的修復(fù)有促進(jìn)作用并且參與細(xì)胞凋亡。顱內(nèi)NGF的量在個體生長、衰老歷程中有著復(fù)雜的變化，可能與神經(jīng)細(xì)胞分化、功能聯(lián)系的建立和維持及衰老有密切關(guān)系。探求腦脊液及腦組織中NGF在不同力度DAI后表達(dá)的變化，目的為臨床上判斷DAI后患者損傷程度水平提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)對象

選取48只SD大鼠(雌雄不限)，體重(310±10)g，不同性別大鼠隨機(jī)分成A組(砝碼懸掛高度及質(zhì)量：70cm×400g)(下同)，B組(80cm×400g)，C組(90cm×400g)，D組(100cm×400g)，E組(110cm×400g)DAI模型以及假手術(shù)組F組(無沖擊力損傷)，各組數(shù)目一致。

1.2 制作模型和相關(guān)檢測

DAI模型制作參照Marmarou等的基礎(chǔ)上，制作不同力度DAI模型。質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的水合氯醛(400mg/kg)腹腔注射麻醉后，頭頂部去毛，分離組織至骨膜暴露顱骨冠狀縫與人字縫之間的顱骨穹隆。術(shù)區(qū)安放不銹鋼墊片，移至自制致傷設(shè)備有機(jī)玻璃管正下端，使砝碼處于玻璃管中心位置。待大鼠出現(xiàn)角膜反射及刺痛反應(yīng)確證蘇醒后，分別按規(guī)定的打擊高度使砝碼自由落體，打擊不銹鋼墊片后即時移走大鼠，避免再次損傷。A組(70cm×400g)、B組(80cm×400g)、C組(90cm×400g)、D組(100cm×400g)、E組(110cm×400g)以及假手術(shù)組F組(無沖擊力損傷)。大鼠打擊后，將各組大鼠分籠飼養(yǎng)，意識障礙恢復(fù)后自行進(jìn)食水。于造模成功后第24h，取腦脊液采用酶聯(lián)免疫法檢測，記錄各數(shù)據(jù)后處死大鼠制作腦組織標(biāo)本，觀察指標(biāo)：(1)生命體征及神經(jīng)系統(tǒng)表現(xiàn)；(2)應(yīng)用光學(xué)顯微鏡和透射電鏡觀察腦組織標(biāo)本形態(tài)及病理學(xué)變化。選取符合DAI模型SD大鼠腦脊液標(biāo)本進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

NGF在正常大鼠腦脊液中會有少量的存在，SD大鼠DAI后腦脊液中NGF含量均較正常增多，與假手術(shù)組有顯著差異(P<0.05)；損傷后各組間也有顯著差異(P>0.05)，隨實(shí)驗(yàn)損傷程度水平加重，大鼠腦脊液中NGF含量呈增多變化，見表1。

圖1 腦脊液酶聯(lián)免疫法檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

腦脊液酶聯(lián)免疫法檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線圖：標(biāo)準(zhǔn)品2000、1000、500、250、125、62.5、31.2、0pg/mL為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上作圖，畫出標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖1。

表1 各組造模合格大鼠腦脊液NGF含量測量數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

*:與假手術(shù)組比較，P<0.05，各實(shí)驗(yàn)組之間比較，P<0.05。

3 討論

彌漫性軸索損傷(diffuseaxonalinjury,DAI)，是由于外傷導(dǎo)致，造成顱內(nèi)神經(jīng)軸索腫脹或斷裂，軸漿外溢出現(xiàn)軸索球?yàn)樘卣鞯哪X實(shí)質(zhì)損傷。在外力作用下，由于腦白質(zhì)及灰質(zhì)的密度不同而產(chǎn)生的剪應(yīng)力使顱腦產(chǎn)生旋轉(zhuǎn)和/或角加速度，從而造成神經(jīng)軸索和顱內(nèi)小血管的損傷。目前臨床上判斷腦外傷造成的DAI時，多依靠影像學(xué)檢查。CT和MRI應(yīng)用方便，卻不能直接客觀地辨別受損軸索的嚴(yán)重程度，且HRCT也很難分辨非出血性的病灶以及細(xì)小的出血點(diǎn)，現(xiàn)尚無統(tǒng)一的診斷標(biāo)準(zhǔn)[2]。這給DAI的診斷及治療方案的選擇上加大了難度。

神經(jīng)損傷修復(fù)需要兩個前提：一是內(nèi)源性神經(jīng)纖維的再生基礎(chǔ)；二是神經(jīng)再生的微環(huán)境。即有生長潛能的神經(jīng)元和營養(yǎng)因素及導(dǎo)向因素。營養(yǎng)因素包括促進(jìn)因子和抑制因子。前者即為神經(jīng)營養(yǎng)因子(Neurotrophicfactors,NTFs)，包含神經(jīng)生長因子、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因素(Brain-derivedneurotrophicfactor,BDNF)、神經(jīng)營養(yǎng)因子—3、4、5、6、7(NT3、4、5、6、7)等。已確證NGF對外周以及中樞神經(jīng)元的存活和生長有重要意義，許多文章指出在神經(jīng)細(xì)胞的存活、分化、增殖及受損神經(jīng)元的退行性病變方面，NGF意義巨大[3],近來探究表明,NGF可以保障脊髓神經(jīng)元的存活，增進(jìn)中樞神經(jīng)細(xì)胞的修復(fù)[4，5]。

不僅神經(jīng)細(xì)胞可以產(chǎn)生NGF，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞也可以產(chǎn)生NGF。實(shí)驗(yàn)表明，正常狀態(tài)時NGF全部是由神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生，但顱腦損傷后NGF含量會隨之增多，其主要來源是星形膠質(zhì)細(xì)胞(astrocyte,Ast)，Guanhua等認(rèn)為顱腦損傷后由4種轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)控NGF的合成，這些因子主要存在于Ast中,神經(jīng)細(xì)胞則幾乎無表達(dá)，所以Ast是傷后NGF的主要來源。學(xué)者藺鐵認(rèn)為推進(jìn)營養(yǎng)因子的分泌，可能比神經(jīng)替代方式改善神經(jīng)功能要越發(fā)重要[6]。左右等研究制造大鼠DAI模型，發(fā)現(xiàn)采用砝碼(高度及質(zhì)量：90cm×400g)(下同)的沖擊力可建立穩(wěn)定的大鼠中度DAI模型，病理學(xué)特征明顯并且穩(wěn)定性好[7]。110cm×400g的沖擊力對大鼠損傷則相對較重，導(dǎo)致大鼠意識障礙的時間長，符合重度DAI的特征。本實(shí)驗(yàn)選取5種力度對大鼠進(jìn)行DAI造模，制作腦組織標(biāo)本選取符合DAI模型的SD大鼠腦脊液標(biāo)本進(jìn)行研究。 周政等在實(shí)驗(yàn)動物腦損傷后從基因以及蛋白表達(dá)這兩個方面上對NGF含量隨時間改變進(jìn)行記錄并研究，發(fā)現(xiàn)NGFmRNA及NGF表達(dá)均增高，與對照組差別明顯[8]。NGF可以促進(jìn)神經(jīng)纖維斷端的再生、保護(hù)其周圍尚未死亡的神經(jīng)細(xì)胞，對神經(jīng)纖維軸突再生有促進(jìn)作用，并能促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的新陳代謝。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，推斷NGFmRNA表達(dá)的增高可能與神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)和修復(fù)密切相關(guān)[9]。學(xué)者劉程偉進(jìn)行深入探索并發(fā)現(xiàn)NGF有協(xié)助血管修復(fù)、促進(jìn)血供重新建立等作用，使臟器缺血得到緩解[10]。

在實(shí)驗(yàn)選取的時間，NGF的表達(dá)與損傷程度情況具有相關(guān)性。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：1、在正常大鼠腦脊液中存在NGF。2、大鼠DAI后腦脊液中NGF含量較正常增多，與假手術(shù)組有差別(P<0.05)；損傷后各組間也有差別(P<0.05)。大鼠DAI后腦損傷程度越重，NGF含量表達(dá)越多。準(zhǔn)確認(rèn)識DAI的病理變化及規(guī)律，能夠解釋部分患者的病程進(jìn)展，提高診治水平。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)彌漫性軸索損傷后會出現(xiàn)NGF的表達(dá)變化，并且認(rèn)為NGF可能是有效協(xié)助判斷彌漫性軸索損傷嚴(yán)重程度的因素之一，今后有望對彌漫性軸索損傷復(fù)雜病理變化過程的進(jìn)一步研究提供指導(dǎo)意義，為臨床上研究彌漫性軸索損傷的機(jī)制及診療等方面提供新的思路和方向。

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2016年佳木斯大學(xué)研究生科技創(chuàng)新項(xiàng)目，編號：YM2016_037。

韓駿飛(1990～)男， 黑龍江齊齊哈爾人，在讀碩士研究生。

李明軍(1965～)男，黑龍江佳木斯人，學(xué)士，主任醫(yī)師，碩士研究生導(dǎo)師。E-mail: 382279194@qq.com。

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1008-0104(2017)03-0096-02

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