方 舟，方 芳，季方茹，李艷翠

(佳木斯大學附屬第一醫(yī)院藥劑科，黑龍江 佳木斯 154003)

三種藥物相關基因多態(tài)性在黑龍江省東部地區(qū)糖尿病患者中的分布①

方 舟，方 芳，季方茹，李艷翠

(佳木斯大學附屬第一醫(yī)院藥劑科，黑龍江 佳木斯 154003)

目的：比較黑龍江佳木斯地區(qū)健康人群和2型糖尿病患者中藥物相關基因TCF7L2SNPrs12255372、IRS-1SNPrs2943650、MTHFRC677TSNPrs1801133基因多態(tài)性的分布，為糖尿病患者的診斷與個體化治療提供臨床依據。方法：應用熒光染色原位雜交法(Fish法)檢測佳木斯地區(qū)健康人群和2型糖尿病(T2DM)患者TCF7L2、IRS-1、MTHFRC677T的基因型。采用SPSS17.0軟件，計數資料采用χ2檢驗方法分析。結果：佳木斯地區(qū)健康人群和2型糖尿病患者TCF7L2、IRS-1的三種基因型頻率分布組間比較P>0.05，基因型分布無統計學意義；MTHFRC677T三種基因型頻率分布組間比較(P<0.05)，基因型分布有統計學意義。結論：黑龍江佳木斯地區(qū)健康人群MTHFRC677TSNPrs1801133位點基因多態(tài)性分布與2型糖尿病患者存在關聯；IRS-1SNPrs2943650、TCF7L2SNPrs12255372基因位點與2型糖尿病患者沒有相關性。

糖尿病，藥物相關基因，基因多態(tài)性，熒光原位雜交

1 儀器和試劑

熒光原位雜交DNA測序分析程序：北京華夏時代基因科技發(fā)展有限公司；TL-988實時熒光定量PCR儀：西安天隆科技儀器有限公司；掌式離心機：珠海博邁杰生物科技有限公司；HC-3017高速離心機：科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司；PHARM-GENE200SNP分析樣品處理試劑，PHARM-GENE01SNP分析保存液(北京華夏時代基因科技

發(fā)展有限公司)。

2 方法

2.1 標本來源

選取2014-06～2016-06住院的2型糖尿病患者324例，體檢健康人270例，糖尿病排除1型糖尿病、妊娠型糖尿病和特殊類型糖尿病，診斷依據WHO1998年新的診斷標準。

2.2 基因檢測

2.2.1 基因多態(tài)性檢測方法

檢測條件：95℃預變性600s；95℃變性30s，62℃復性75s，45或50個循環(huán)。在樣品檢測的同時，加測3種不同基因型的質控品作為對照。

方法：取150μL新鮮全血加入含有1000μL氯化銨溶液的Eppendorf試管中，混合混勻后室溫放置5min，離心5min，加入100μL耀金保，震蕩混合混勻，室溫放置20～30min。吸取本液1.0～1.5μL加入待測基因對應的耀金分試劑中，漩渦混合均勻，瞬時離心，上至機器中檢測。

解析：分析已知反應物和產物,結合題意“調節(jié)pH≈3”可知缺項是 H+,Ce3+→Ce(OH)4,失1 e-,H2O2→Ce(OH)4,得2 e-,根據得失電子守恒,Ce3+前的化學計量數為2,H2O2前的化學計量數為1,再根據電荷守恒,H+前的化學計量數為6,最后觀察可知H2O2前的化學計量數為6,配平的方程式為2Ce3++H2O2+6H2O==2Ce(OH)4↓+6H+。

2.2.2 基因型的判斷

將檢測的樣品熒光曲線圖與質控品曲線圖進行比較。

TCF7L2SNPrs12255372熒光擬合曲線見圖1；IRS1SNPrs2943650熒光擬合曲線見圖2；MTHFRSNPrs1801133熒光擬合曲線見圖3。

2.3 統計學方法

采用SPSS17.0統計軟件χ2檢驗來計算糖尿病組和健康人組的三種基因型的分布頻率，P<0.05為差異具有顯著性。

圖1 TCF7L2 SNP rs12255372(G>T)熒光擬合曲線

圖2 IRS 1 SNP rs2943650(C>T)熒光擬合曲線

圖3 MTHFR SNP rs1801133(C>T)熒光擬合曲線

3 結果

3.1TCF7L2基因多態(tài)性在健康人和糖尿病患者中的分布

選取健康人對照組270例，糖尿病患者324例，按上述方法測定TCF7L2SNPrs12255372基因型，結果：GG基因型155例，分布頻率為57.4%；GT型75例，頻率27.8%；TT型40例，頻率14.8%，其中G等位基因頻率為66.7%，T等位基因頻率為33.3%。糖尿病患者324例，TCF7L2SNPrs12255372基因GG型170例，頻率52.5%；GT型86例，頻率26.5%；TT型68例，頻率21.0%，其中G等位基因頻率為65.7%，T等位基因頻率為34.3%。健康人與糖尿病患者TCF7L2基因分布頻率見表1。

表1 健康人與糖尿病患者TCF7L2基因型分布頻率表

對照組與糖尿病組TCF7L2SNPrs12255372其等位基因概率經χ2檢驗，可知(χ2=0.104，P>0.05)，其等位基因分布頻率沒有顯著性差異，無統計學意義。三種基因型GG/GT/TT分布頻率，經χ2檢驗，可知(χ2=3.826，P>0.05)，三種基因型分布頻率沒有差異性，不具有統計學意義。

3.2IRS-1 基因多態(tài)性在健康人和糖尿病患者中的分布

選取糖尿病患者324例，按上述方法測定IRS1SNPrs2943650基因型：測定結果：CC型6例，頻率1.9%；CT型36例，頻率11.1%；TT型282例，頻率87%，其中C等位基因頻率為48%，T等位基因頻率為92.2%。選取健康人對照組270例，測定結果：CC型9例，頻率3.3%；CT型36例，頻率13.3%；TT型225例，頻率83.3%，其中C等位基因頻率為10%，T等位基因頻率為90%。健康人與糖尿病患者IRS-1基因型分布頻率見表2。

表2 健康人與糖尿病患者IRS 1基因型分布頻率表

對照組與糖尿病患者IRS-1SNPrs2943650基因型頻率，其等位基因概率經χ2檢驗，可知(χ2=1.654，P>0.05)，其等位基因分布頻率無顯著性差異，不具有統計學意義。三種基因型CC/CT/TT頻率經χ2檢驗，可知(χ2=2.117，P>0.05)，三種基因型分布頻率沒有差異性，不具有統計學意義。

3.3MTHFR基因多態(tài)性在健康人和糖尿病患者中的分布

選取健康人對照組270例，測定MTHFRSNPrs1801133基因，結果：CC型36例，頻率13.3%；CT型135例，頻率50%；TT型99例，頻率36.7%，其中C等位基因頻率為38.3%，T等位基因頻率為61.7%。測定糖尿病患者324例，MTHFRSNPrs1801133基因CC型70例，頻率21.6%；CT型119例，頻率36.7%；TT型135例，頻率41.7%，其中C等位基因頻率為40.0%，T等位基因頻率為60.0%。健康人與糖尿病患者MTHFR基因分布概率見表3。

表3 健康人與糖尿病患者MTHFR基因型分布頻率表

對照組與糖尿病組MTHFR677等位基因概率經χ2檢驗，可知(χ2=0.331，P>0.05)，其等位基因分布頻率沒有顯著性差異。對照組與糖尿病組MTHFR677基因CC/CT/TT三種基因型頻率，經χ2檢驗，可知(χ2=12.647，P<0.05)，三種基因型分布頻率有顯著性差異性，具有統計學意義。

4 討論

TCF7L2基因(又稱T細胞因子-4)是Wnt信號傳導通路中的轉錄因子，參與細胞增殖與分化的調節(jié)[5]，它位于人類10號染色體長臂25區(qū)(染色體10q25.3)，共有2159個堿基對，包含17個外顯子，其表達產物是T細胞因子/淋巴細胞增強子結合因子中的一個。一些研究認為TCF7L2基因變異與2型糖尿病相關[7]，但是同時也有研究認為沒有關聯[8]。這可能是不同的研究者選取的基因位點及病例入選標準不同有關?？傊P于TCF7L2基因多態(tài)性與2型糖尿病的關聯還沒有定論，有必要進行大樣本深入研究。本試驗研究本地區(qū)健康人TCF7L2TSNPrs12255372基因多態(tài)性與2型糖尿病患者的基因多態(tài)性不相關。MTHFR基因位于染色體1q36.3，編碼區(qū)長1980bp，MTHFR基因的677位堿基胞嘧啶(Cytosine,C)變異為胸腺嘧啶(Thymine,T)，使編碼的丙氨酸(Ala)變異為纈氨酸(Val)[9]而產生多態(tài)性，它與很多疾病相關[10]，本實驗表明MTHFRSNPrs1801133三種基因型分布頻率在黑龍江省佳木斯地區(qū)健康人和糖尿病患者中有顯著性差異性。胰島素受體底物1(IRS-1)基因突變導致胰島素對血小板活性的抑制作用削弱，導致胰島素抵抗。胰島素受體底物1(IRS-1)廣泛存在于胰島素敏感的組織中，在胰島素受體信號傳導通路中處于關鍵部位，是胰島素受體激酶的第一個直接底物。本實驗對IRS-1SNPrs2943650基因CC/CT/TT三種基因頻率進行統計分析，經χ2檢驗，可知(χ2=2.117，P>0.05)，三種基因型分布頻率沒有差異性，不具有統計學意義。

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佳木斯大學科學技術面上項目，編號：S2014-031。

方舟(1984～)男，黑龍江佳木斯人，碩士，主管藥師。

李艷翠(1973～)女，黑龍江鶴崗人，碩士，主任藥師。E-mail:liyancui3400@163.com。

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1008-0104(2017)03-0084-03

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